Молекулярные механизмы таргетной терапии при болезни Паркинсона

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-15-00177

НазваниеМолекулярные механизмы таргетной терапии при болезни Паркинсона

Руководитель Пчелина Софья Николаевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" , Ленинградская обл

Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-402 - Медицинская генетика

Ключевые слова болезнь Паркинсона, наследственные формы, GBA1, LRRK2, животные модели, альфа-синуклеин, таргетная терапия, нейропротекция

Код ГРНТИ76.03.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Нами в ходе многолетних исследований (Гранты РНФ 17-75-20159, РНФ 19-15-00315, 22-25-00721 и 22-25-00501 ) сформирован банк биологического материала (кровь, ДНК, мононуклеары крови) от пациентов с наследственными формами болезни Паркинсона, GBA-БП (N=32) характеризующиеся снижением активности лизосомного фермента β-глюкоцереброзидазы (GCase) и LRRK2-БП (N=27), ассоциированной с увеличением киназной активности лейцин богатой лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), разработана полноатомная модель GCase, системы скрининга малых химических молекул, активирующих GCase, фармакологических шаперонов (ФШ) GCase in silico и на пациент специфичных клетках (первичная культура макрофагов, дофаминергические нейроны (Kopytova et al., Parkinsonism & Related Disorders. 2021, 84:112-121; Kopytova et al., Int J Mol Sci. 2023 22;24(10):9105), предложен новый относящийся к аллостерическому типу ФШ GCase (заявка на патент № 2023123457), который способен связываться в сайте, расположенном на поверхности фермента вне его активного центра, и восстанавливать его функцию. Ожидается, что именно аллостерические ФШ будут более эффективные в клинических трайлах по лечению GBA-БП и болезни Гоше по сравнению с ФШ GCase связывающиеся с ферментами в его активном сайте. Однако, нейропротекторное действие аллостерического ФШ GCase на животных моделях паркинсонизма не исследованы. Недавно было показано, что к восстановлению активности GCase могут приводить другие таргетные соединения предложенные для лечения LRRK2-БП, а именно, ингибиторы LRRK2 (Ysselstein et al., Nat Commun . 2019, 5;10(1):5570; Sanyal et al., 2020, Frontiers in Neurosci, 14:442). Обсуждается, что данный эффект может быть обусловлен участием LRRK2 в регуляции аутофагии, в частности, через фосфорилирование белков Rab8 и Rab10, последний из которых является основным субстратом LRRK2 (Steger et al., 2016m doi: 10.7554/eLife.12813). Нарушение аутофагии, в частности пути PI3K/AKT/mTOR на фоне увеличения уровня белка альфа-синуклеина было выявлено нами ранее при анализе транскриптома клеток мозга на мышиной модели с МФТП-индуцированным паркинсонизмом и дисфункцией фермента GCase (Usenko et al., Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 12164). В то же время, влияние ингибиторов LRRK2 на активность других лизосомных ферментов остается неизвестным. В настоящем проекте будет продолжен поиск модификаций ФШ GCase методом молекулярного докинга in silico. На пациент-специфичных клетках от пациентов с GBA-БП и LRRK2-БП, пациентов с болезнью Гоше и другими лизосомными болезнями накопления (ЛБН), а также на животных моделях паркинсонизма (мыши с МФТП-индуцированным паркинсонизмом) нами будет впервые исследовано сочетанное влияние ФШ GСase, ингибиторов LRRK2 на активность лизосомных ферментов (глюкоцереброзидазы (GCase), альфа-галактозидазы (GLA), альфа-глюкозидазы (GAA), галактоцереброзидазы (GALC), сфингомиелиназы (ASM) и альфа-идуронидазы (IDUA))), уровень их субстратов, активности LRRK2 (по оценке уровня фосфориллирования белка rab10), уровень аутофагии, накопление различных форм (общий, олигомерный, фосфориллированный (Ser129)) альфа-синуклеина и степень нейродегенерации дофаминергических нейронов. Также впервые будет оценено влияние ФШ GСase, ингибиторов LRRK2, а также их сочетанного действия на транскриптом клеток ЧС модельных животных. Проведенное исследование позволит расширить наше понимание механизма действия разрабатываемых таргетных препаратов для лечения БП, впервые даст оценку нейропротекторных свойств ФШ GCase аллостерического типа и потенциирующего эффекта индукторов аутофагии и ФШ GCase. Важно, также отметить, что снижение активности GCase и увеличение активности LRRK2 может наблюдаться и при спорадических формах БП (сБП), что делает возможным расширение терапевтического эффекта данных препаратов при развитии ненаследственных форм БП.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Болезнь Паркинсона (БП) является неизлечимым нейродегенеративным заболеванием. Распространенность БП в возрасте 60-80 лет составляет 1-4%. Среди всех форм БП, обусловленных наследственными причинами БП, ассоциированная с мутациями в гене GBA1 (GBA1- БП), является наиболее распространенной, составляя 10% от всех случаев заболевания. Ген GBA1 кодирует лизосомный фермент глюкоцереброзидазу (GCase), участвующую в деградации лизосфинголипидов. Наиболее распространенными мутациями в гене GBA1 ассоциированными с БП являются аминокислотные замены N370S, L444P, не затрагивающие активный сайт фермента, но меняющие его конформацию. В следствие этого мутантный фермент деградирует, не достигая сайта действия в лизосомах. Биаллельные мутации в гене GBA1 приводят к развитию редкого наследственного заболевания болезни Гоше. В последние годы одной из основных групп фармпрепаратов разрабатываемых для восстановления функций ферментов при нарушении их конформации в следствие аминокислотных замен является группа фармакологических шаперонов (ФШ) - малых молекул, связывающихся с ферментом и способствующих восстановлению конформации его мутантной формы. Ожидается, что именно аллостерические ФШ GCase (связывающиеся в сайтах на поверхности фермента) будут более эффективны в клинических исследованиях по лечению GBA1-БП и болезни Гоше по сравнению с ФШ GCase, связывающихся с ферментом в его активном сайте. Целью настоящего проекта является разработка отечественных препаратов для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией GCase. В ходе выполнения первого года настоящего проекта нами продолжен поиск новых малых молекул, являющихся ФШ GCase, которые могли бы быть использованы для лечения как болезни Гоше, так и GBA1- БП. В результате молекулярного докинга ранее описанного ФШ NCGC00241607 нами предложены его модификации, а именно соединения N4, N5. Скрининг данных соединений на первичной культуре макрофагов от пациентов с болезнью Гоше и GBA1- БП показал перспективность для включения в дальнейшие исследования соединения N4, поскольку данный препарат показал свою эффективность в увеличении активности GCase на первичной культуре макрофагов от 2 пациентов с болезнью Гоше и одного пациента с и GBA1- БП (N370S). В последние годы было высказано предположение, что таргетные препараты, разрабатываемые для наследственной формы БП, обусловленной мутациями в гене киназы LRRK2 (LRRK2-БП), ингибиторы киназы, могут быть эффективны также в восстановлении активности GCase при GBA1-БП (Ysselstein, et al. 2019, Nat Commun. 2019;10(1)). Основной задачей первого года явилась оценка действия ингибитора LRRK2 (MLi-2) на активность GCase и других лизосомных ферментов (альфа-галактозидазы (GLA), галактоцереброзидазы (GALC), сфингомиелиназы (ASM)) на пациент-специфичных дофаминергических нейронах, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК- ДА нейроны) от пациентов с GBA1- БП и LRRK2-БП, а также оценка влияния MLi-2 на восстановление активности GCase в первичной культуре макрофагов, полученных от пациентов с болезнью Гоше. Оценку активности GCase и уровня ее субстрата в клетках, культивируемых в присутствии и без MLi-2, проводили с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). В исследование включено 7 пациентов с болезнью Гоше. Влияния ингибирования активности LRRK2 на активность GCasе в группе пациентов с болезнью Гоше не выявлено. Впервые показано, что усиление транспорта фермента GCase в лизосому посредством ингибирования активности LRRK2 при наличии только мутантных форм фермента является недостаточным и не сопровождается увеличением активности GCase. При ингибировании LRRK2 на ИПСК-ДА нейронах было выявлено как повышение активности GCase так и повышение активности других исследуемых лизосомных гидролаз, ASMase, GLA и GALC. Кроме того, ингибирование LRRK2 было более эффективным в восстановлении активности GCase при GBA1-БП (N370S), чем при LRRK2-БП (G2019S). Также впервые показано, что ингибирование LRRK2 не только повышает относительный уровень GCase, но и усиливает транспорт GCase в лизосомы. В рамках настоящего проекта нами впервые высказана гипотеза о том, что ингибиторы киназы LRRK2 могут потенциировать действие ФШ GCase в восстановлении активности фермента (Т.С. Усенко, С.Н. Пчелина. Болезнь Паркинсона, ассоциированная с мутациями в гене LRRK2. Подходы к терапии. Молекулярная биология, 2025, в печати; Усенко Т.С., Башарова К.С., Безрукова А.И., Безруких В.А., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н. Оценка возможности влияния ингибиторов LRRK2 на активность глюкоцереброзидазы на пациент-специфичных клетках пациентов с болезнью Гоше. Биохимия, 2025, в печати). Гипотеза основана на описанном участии LRRK2 в регуляции эндо-лизосомного транспорта, а также впервые продемонстрированного нами в рамках настоящего проекта влияния ингибирования активности LRRK2 на эффективность транслокации GCase в лизосомы (Usenko et al., J Neurol Chem, 2025, submitted). Другой задачей настоящего проекта явилась оценка предложенного нами аллостерического ФШ GCase N2 на восстановление активности GCase в различных отделах мозга экспериментальных животных. Несмотря на масштабность исследований аллостерических ФШ GCase на клеточных культурах, сегодня опубликовано одно исследование по оценке влияния аллостерического ФШ GCase S-181 на активность фермента на животных (Burbulla et al., Sci Transl Med, 2019, 11(514)). В качестве положительного контроля было использовано введение ФШ GCase ингибиторного типа, амброксол гидрохлорид (ABX). Исследование проводилось на самцах линии мышей C57BL/6. Оценка активности ферментов и концентрации субстрата проводилась с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС. Оценка влияния ФШ GCase (N2, ABX) на активность GCase дикого типа показала, что при введении N2 (25 мкг/кг) и ABX (70млг/кг) (внутрибрюшинное введение, один раз в день, 13 дней) активности GCase увеличивается в префронтальной коре (p=0.009, p=0.01, соответственно). Также показано снижение субстрата при воздействии ABX в префронтальной коре (р=0.004), при воздействии N2 – в среднем мозгу (р=0.03). Таким образом, в ходе выполнения настоящего этапа мы подтвердили эффективность предложенного нами ФШ GCase в увеличении активности GCase не только на клеточной культуре, но и в мозге лабораторных животных. На следующих этапах выполнения проекта будет проведена оценка сочетанного влияния ингибиторов LRRK2 и ФШ GCase N2, а также проведена оценка нейропротекторных свойств молекулы N2 на экспериментальных моделях МФТП-индуцированного паркинсонизма на мышах. Полученные результаты расширяют понимание механизма действия ингибиторов LRRK2 и ФШ GCase в восстановлении активности лизосомных ферментов, что является крайне важным для дальнейшей разработки терапии БП и для текущих клинических испытаний.

Публикации

1. Усенко Т.С., Башарова К.С., Безрукова А.И., Безруких В.А., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ИНГИБИРОВАНИЯ КИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ LRRK2 НА АКТИВНОСТЬ ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗЫ НА ПАЦИЕНТ_СПЕЦИФИЧНЫХ КЛЕТКАХ ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ГОШЕ Biochemistry (Moscow) (год публикации - 2025)

2. Усенко Т.С., Безрукова А.И., Башарова К.С., Руденок М.М., Шадрина М.И., Сломинский П.А., Пчелина С.Н. Поиск мишеней для терапии болезни Паркинсона на основе анализа транскриптома черной субстанции модельных жи-вотных мышей с МФТП-индуцированным паркинсониз-мом и дисфункцией глюкоцереброзидазы Институт Цитологии и Генетики, 1308 (год публикации - 2024)

3. Т.С. Усенко, С.Н. Пчелина БОЛЕЗНЬ ПАРКИНСОНА, АССОЦИИРОВАННАЯ С МУТАЦИЯМИ В ГЕНЕ LRRK2. ПОДХОДЫ К ТЕРАПИИ Молекулярная биология (год публикации - 2025)

4. Т.С. Усенко, А.И. Безрукова, К.С. Башарова, М.М. Руденок, М.И. Шадрина, П.А. Сломинский, С.Н. Пчелина АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМА, КАК ПОДХОД ДЛЯ ПОИСКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ТЕРАПИИ БОЛЕЗНИ ПАРКСИНСОНА Сборник тезисов, с. 37-38 (год публикации - 2024)

5. Башарова К.С., Безрукова А.И., Безруких В.А., Байдакова Г.В., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Влияние ингибирования киназной активности LRRK2 на активность лизосомного фермента глюкоцереброзидазы (GCase) в первичной культуре макрофагов пациентов с дисфункцией GCase Астерион, с. 170-171 (год публикации - 2024)

6. Башарова К.С., Безрукова А.И., Григорьева Е.В., Копытова А.Э., Байдакова Г.В., Павлова С.В., Милюхина И.В., Медведев С.П., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Сопоставление эффективности препаратов, направленных на восстановление активности глюкоцереброзидазы, при болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1, на пациент-специфичных клетках Эко-Вектор, с. 108-110 (год публикации - 2024)

7. Лавринова А.О., Демидова Е.А., Пидюрчина В.Н., Безрукова А.И., Сергеева Е.В., Кванчиани В.В., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Емельянов А.К., Пчелина С.Н. Влияние фармакологического шаперона глюкоцереброзидазы на активность фермента в мозге мышей Медицинская генетика, Медицинская генетика 2025. Том 24. Номер 6 (год публикации - 2025)
10.25557/2073-7998.2025.06.83-85

8. Башарова К.С., Копытова А.Э., Безрукова А.И., Рыбаков А.В., Захарова Е.Ю., Усенко Т.С., Пчелина С.Н. Сопоставление эффективности препаратов, направленных на восстановление активности глюкоцереброзидазы при болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1, на пациент-специфичных клетках Медицинская генетика, Медицинская генетика 2025. Том 24. Номер 5 (год публикации - 2025)
10.25557/2073-7998.2025.05.59-62

9. Пчелина С.Н., Безрукова А.И., Руденок М.М., Журавлев А.С., Рыболовлев И.Н., Лавринова А.О., Байдакова Г.В., Николаев М.А., Нестеров М.С., Абаимов Д.А., Пидюрчина В.Н., Партевян С.А., Семенова Е.И., Усенко Т.С., Захарова Е.Ю., Емельянов А.К., Шадрина М.И., Сломинский П.А. ДВОЙНАЯ НЕЙРОТОКСИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ДОСИМПТОМНОЙ СТАДИИ ПАРКИНСОНИЗМА C ДИСФУНКЦИЕЙ ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗЫ У МЫШЕЙ БИОХИМИЯ, БИОХИМИЯ, 2025, том 90, вып. 8, с. 1148 – 1162 (год публикации - 2025)
10.31857/S0320972525080065

10. Усенко Т.С., Башарова К.С., Безрукова А.И., Григорьева Е.В., Павлова С.В., Байдакова Г.В., Николаев М.А., Гапоненко И.Н., Хегай О.В., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н. Restoration of Lysosomal Hydrolase Activities by LRRK2 Inhibition in GBA1- and LRRK2-Associated Parkinson's Disease Patient-Derived Cells Journal of Neurochemistry, Volume 169, Issue 9 e70214 (год публикации - 2025)
10.1111/jnc.70214

11. Башарова К.С., Безрукова А.И., Байдакова Г.В., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНГИБИТОРОВ LRRK2 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ НАРУШЕНИЕМ ФУНКЦИИ ЛИЗОСОМНОЙ ГИДРОЛАЗЫ ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗЫ, НА ПАЦИЕНТ-СПЕЦИФИЧНЫХ КЛЕТКАХ XII МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ: БИОИНФОРМАТИКОВ, БИОТЕХНОЛОГОВ, БИОФИЗИКОВ, ВИРУСОЛОГОВ, МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ И СПЕЦИАЛИСТОВ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ, АНО «Инновационный центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2025. — 614 с (год публикации - 2025)
10.25205/978-5-4437-1843-9-308

12. Башарова К.С., Безрукова А.И., Байдакова Г.В., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГИБИРОВАНИЯ КИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ LRRK2 В ВОССТАНОВЛЕНИИ АКТИВНОСТИ ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТИПА МУТАЦИЙ В ГЕНЕ GBA1 НА ПАЦИЕНТ-СПЕЦИФИЧНЫХ КЛЕТКАХ ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ VIII СЪЕЗД ФИЗИОЛОГОВ СНГ XV СЪЕЗД АЛЛЕРГОЛОГОВ И ИММУНОЛОГОВ СНГ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ», НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. – М.: Издательство «Медицина–Здоровье», 2025. – 11с (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Болезнь Паркинсона (БП) — распространенное нейродегенеративное заболевание, обусловлено гибелью дофаминергических нейронов среднего отдела мозга. В настоящее время заболевание неизлечимо, нейропротекторная терапия отсутствует. Этиология заболевания в большинстве случаев не известна. Гибель нейронов связывают с нейротоксическим действием агрегатов белка альфа-синуклеина. Наиболее распространенными формами БП, являются БП, обусловленная мутациями в гене киназы LRRK2 (LRRK2- БП) и форма, обусловленная мутациями в гене GBA1 (GBA1-БП), кодирующем лизосомный фермент глюкоцереброзидазу (GCase). Именно к данным формам БП в настоящий момент терапия малыми молекулами, а именно ингибиторами LRRK2 и модуляторами активности (фармакологическими шаперонами (ФШ)) GCase, находится на фазе клинических исследований за рубежом. В России наш коллектив ведет многолетние разработки по поиску малых молекул модуляторов активности GCase аллостерического типа. Ранее нами предложен новый относящийся к аллостерическому типу ФШ GCase (патент № RU2809824C1), который способен связываться в сайте, расположенном на поверхности фермента вне его активного центра, и восстанавливать его функцию. Ожидается, что именно аллостерические ФШ будут более эффективные в клинических трайлах по лечению GBA1-БП и болезни Гоше (биаллельные мутации в гене GBA1) по сравнению с ФШ GCase связывающиеся с ферментом в его активном сайте таким, как препарат амброксол (АВХ). Ранее нами показана эффективность ФШ GCase N2 в восстановлении активности GCasе и снижении субстрата данного фермента на пациент-специфичных клетках пациентов (первичная культура макрофагов, дофаминергические нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ДА нейроны)). Так же на пациент-специфичных клетках пациентов с LRRK2-БП и GBA1-БП продемонстрирована возможность модулирования активности GCase ингибитором фермента LRRK2, Mli-2. Был показано, что ингибирование LRRK2 приводит к восстановлению эндолизосомного транспорта, который контролируется субстратами LRRK2 белками семейства Rab (Usenko TS, et al. J Neurochem. 2025;169(9):e70214). Задачами настоящего этапа проекта явилась оценка нейропротекторных свойств предложенного ФШ GCase N2, а также оценка сочетанного действия ингибитора LRRK2, Mli-2, и молекулы N2. Основное достижение данного этапа проекта — демонстрация нейропротекторных свойств предложенного нами ФШ GCase N2 на нейротоксической МФТП-индуцированного паркинсонизма на мышах линии C57BL/6. В ходе выполнения проекта данная модель паркинсонизма была нами охарактеризована, предложенная схема введения МФТП приводила к нейродегенерации дофаминергических нейронов среднего мозга, снижению уровня дофамина в стриатуме, накоплению альфа-синуклеина, однако не вызывала поведенческих нарушений (Пчелина С.Н. и др., Биохимия. 2025;90(8):1148–1162). В ходе настоящего этапа сопоставляли количество тирозин положительных нейронов среднего мозга при введении МФТП и МФТП в сочетании N2. Гибель нейронов на фоне введения N2 сокращалась на 20%. Важно отметить, принципиальное значение полученных данных. Не сморя на то, что два ФШ GCase аллостерического типа проходят фазу клинических исследований за рубежом, нейропротекторные свойства были показаны только для амброксола, модулятора активности GCase ингибиторного типа. Таким образом, нами получены первые данные о нейропротекторных свойствах аллостерических активаторах GCase. Полученные данные подчёркивают обоснованность использования аллостерических ФШ GCase в качестве нейропротекторного средства при БП и необходимость проведения доклинических исследований предложенного нами соединения. В то же время для выяснений механизмов нейропротекторного дйствия ФШ GCase N2 целесообразна оценка его влияния на накопление альфа-синуклеина, которая будет проведена на завершающем этапе настоящего проекта с использованием трансгенных мышей с экспрессией мутантного альфа-синуклеина человека (линии B6.Cg-Tg(Prnp-SNCA*A53T)23Mkle/J). На настоящем этапе исследования нами была проведена оценка потенцирующего эффекта ингибирования киназной активности LRRK2 (селективный ингибитор MLi-2) в восстановлении активности GCase и снижения концентрации лизосфинголипида HexSph при культивировании пациент-специфичных клеток (первичная культура макрофагов, ДА-нейроны) в присутствии модулятора активности GCase N2 с последующей оценкой уровня субстрата относительный уровень белка GCase, различных форм белка альфа-синуклеина (мономерного, фосфорилированного (Ser129), олигомерного, степени аутофагии (по относительному уровню белка LC3B) методом вестерн блоттинга. Дополнительно действие модулятора активности GCase N2 и MLi-2 было сопоставлено с действием ABX. Статистически значимых различий действия исследуемых молекул N2 и MLi-2 с АВХ выявлено не было в отношении восстановления активности GCase (p>0.05), что свидетельствует об эффективности N2. В тоже время была выявлена тенденция к снижению концентрации HexSph при действии N2 (р=0.093) по сравнению с действием ABX в первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с GBA1-БП, что соответствует наблюдаемому нами ранее эффекту и подтверждает эффективность N2. Впервые было показано влияние N2 на уровень олигомерного альфа-синуклеина в ДА нейронах пациента с GBA1-БП, воздействие N2 приводило к снижению олигомерного альфа-синулеина. Нами также подтверждено действие Mli-2 на уровень и активность GCase, однако, потенцирующего действия при культивировании как на первичной культуре макрофагов от пациентов с болезнью Гоше (N=14), пациентов с GBA1-БП (N=9) так и на ДА нейронах от пациента с GBA1-БП c комбинацией веществ N2 и MLi-2 на увеличение активности GCase, уровень субстрата, уровня белков GCase и альфа-синуклеина выявлено не было. В качестве задела для решения задач следующего года проекта нами были отработаны условия для генотипирования мышей по наличию гена SNCA, полученного в результате скрещивания самцов линии B6.Cg-Tg(Prnp-SNCA*A53T)23Mkle/J и самок линии C57BL/6, а также методы оценки уровня альфа-синуклеиа в тканях мозга модельных животных. В итоге, полученные данные говорят о потенциале использования разработанного нами ФШ GCase N2 в качестве нейропротекторного препарата для лечения GBA1-БП. Для оценки потенциирующего действия ингибирования LRRK2 в восстановлении активности GCase при использовании ФШ N2 необходимы дальнейшие исследования на модельных животных, запланированные на следующем этапе проекта, поскольку эффект наблюдаемый на пациент-специфичных клетках может не отражает в полной мере организменное действие малых молекул.

Публикации