Аннотация результатов, полученных в 2024 году
За отчетный 2024 год был оптимизирован метод получения экстрактов из образцов печени (гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) и неопухолевая часть печени). С помощью нанесения на фильтры, трипсинолиза и последующей масс-спектрометрии (так называемый Filter Aided Sample Preparation (FASP) метод) были получены и статистически обработаны данные по панорамному масс-спектрометрическому, протеомному, анализу 5 пар экстрактов. Всего суммарно было детектировано 3677 белков. Уровень 1627 белков оказался выше в опухоли (отсечение 1,5 раза, или они не были детектированы в контроле). В норме таких белков было 656. Анализ с помощью программы Panther GO (gene ontology) позволил выявить, превалирующие в опухоли или контроле функции, процессы и классы белков. Из особенно характерных отличий следует отметить активацию в опухолях иммунных процессов (immune system process (GO:0002376) и процесс межвидового взаимодействия (biological process involved in interspecies interaction between organisms (GO:0044419). По молекулярным функциям в опухолях повышена активность трансляции (translation regulator activity (GO:0045182), и гораздо больше определено белков трансляции (translational protein (PC00263). Также более разнообразна регуляция молекулярных функций (molecular function regulator activity (GO:0098772). Обнаружено больше белков внеклеточного матрикса (extracellular matrix protein (PC00102), метаболизма ДНК (DNA metabolism protein (PC00009), цитоскелета (cytoskeletal protein (PC00085). Однако, в контроле более представлены ферменты метаболизма малых молекул (metabolite interconversion enzyme (PC00262). Оказалось, что из 1627 белков, которые превалируют в опухолях, в базе данных Human Protein Atlas 500 белков фигурируют как прогностические неблагоприятные маркеры. Любопытно, что 70 белков относят к прогностическим благоприятным маркерам. Несколько иная картина наблюдается у белков, уровень которых превалирует в контроле (193 белка). Здесь оказалось примерно одинаковое количество как благоприятных, так и неблагоприятных онкомаркеров. По-видимому, это указывает на некую неоднозначность определения неблагоприятности белка, основанной на определении изменения уровня экспрессии его РНК. Построили для белков, уровни которых значительно повышены в опухолевой ткани (потенциальные маркеры) виртуальную двумерную электрофоретическую карту. Сравнение белков нормы и опухоли с помощью двумерного электрофореза (2DE) показало значительное отличие между ними как по интенсивности определенных пятен, так и по их отсутствию или присутствию. В данном случае оказалось, что в Т1 превалируют 180 пятен (есть в Т1, но нет в К или их интенсивность в Т1 больше, чем в контроле, как минимум в 1,5 раза). В К1 таких пятен оказалось 128. Масс-спектрометрический анализ позволил идентифицировать многие из пятен. На основе 2DE с использованием большого геля (24х20 см) и более чувствительного окрашивания (серебрение) получена двумерная электрофоретическая карта с аннотацией 145 пятен. Проведен секционный анализ окрашенного Кумасси после двумерного гель-электрофореза геля. В результате суммарно для образца Т1 было детектировано 25646 протеоформ, а для К1 – 18388. На основе этих данных были построены трехмерные графики – протеоформные сигнатуры изоформ. Для Т1 были построены сигнатуры 2843 изоформ, и для К1 – 2427 изоформ. В сумме всего получилось ~4000 сигнатур. Сигнатуры большинства белков одинаковы в контроле и опухоли, однако для некоторых из них обнаружена разница. На основании информации о ПТМ (Uniprot) для таких белков построены также и виртуальные возможные сигнатуры. Также были построены полувиртуальные 2DE карты для двух образцов. В случае опухоли – для 1327 белков (изоформ), для контроля – 1581 белок (изоформа). Массивы полученных данных обрабатываются и будут помещены на сайт http://2de-pattern.pnpi.nrcki.ru.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В результате анализа имеющихся в нашем распоряжении контрольных и опухолевых образцов гепатоцеллюлярной карциномы количественная оценка отдельных протеоформ и их распределение в виде протеоформных паттернов была скорректирована после идентификации и количественной оценки белков (протеоформ), присутствующих в каждой секции (секционный 2DE-анализ), с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения и чувствительности. Было построено примерно 4 тысяч паттернов для отдельных сплайс-вариантов (изоформ). Причем для улучшения анализа паттерны построили двух типов – объемные (трехмерные) в виде пирамид, где высота пирамиды каждой секции соответствовала уровню протеоформы, находящейся в данной секции (параметр emPAI), и в виде тепловых карт, где уже цвет соответствовал уровню соответствующей протеоформы. Были построены виртуальные 2DE-карты для контрольных и опухолевых образцов гепатоцеллюлярной карциномы. Также, была построена виртуальная двумерная электрофоретическая карта мастерных белковых форм (277 белков), кодируемых 18 хромосомой человека. После визуального сравнительного анализа белков, имеющих повышенный уровень в опухолевых образцах, было отобрано 38 белков с паттернами, имеющими характерные признаки отличия между контролем и опухолью. В дальнейшем мы планируем более детальное их изучение на предмет использования в качестве специфических онкомаркеров. Были обработаны данные нашего масс-спектрометрического анализа и собраны результаты из других источников о возможных посттрансляционных модификациях (ПТМ), присутствующих в протеоформах потенциальных маркеров гепатокарциномы. Были использованы протеоформная база Human Proteoform Atlas (HPA) и белковые базы Uniprot и Pride. На основании этих данных мы можем получить некоторое представление о том, какие ПТМ могут быть ответственны за появление дополнительных протеоформ, уникальных для опухолевых образцов. Паттерны некоторых потенциальных онкомаркеров были подтверждены с помощью антител (2DE-Вестерн блот). Это паттерны белка фибулин 3 (FBLN3), белка аннексин 2 (ANXA2), белка PCNA (PCNA), белка кофилин (COF1). База “2DE-Рattern” http://2de-pattern.pnpi.nrcki.ru/index.html была дополнена полученными данными и функционально усилена. Были добавлены опции, позволяющие не просто рассматривать включенные в базу данные, но и проводить их количественную обработку, а также и сравнивать данные для разных объектов, полученные разными подходами, используемыми в нашей базе.