Оценка возможности использования mTOR в качестве мишени для терапии болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA in vitro

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-25-00212

НазваниеОценка возможности использования mTOR в качестве мишени для терапии болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA in vitro

Руководитель Усенко Татьяна Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" , Ленинградская обл

Конкурс №89 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова Болезнь Паркинсона, mTOR, STING, альфа-синуклеин, активность ферментов, аутофагия, первичная культура макрофагов периферической крови, SH-SY5Y

Код ГРНТИ76.29.51

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Болезнь Паркинсона (БП) – это нейродегенеративное заболевание, в основе патогенеза которого лежит накопление белка альфа-синуклеина в черной субстанции головного мозга. БП носит в основном спорадический характер (сБП), но описаны также формы заболевания и с известной этиологией. К наиболее распространенным формам БП с известной этиологией относятся БП, ассоциированная с мутациями в генах LRRK2 и GBA1 (LRRK2-БП, GBA-БП). GBA-БП характеризуется снижением активности кодируемого геном GBA1 лизосомного фермента β-глюкоцереброзидазы (GCase), LRRK2-БП - увеличением киназной активности лейцин богатой лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), которая кодируется геном LRRK2. Ранее в ходе выполнения гранта РНФ 22-25-00501 нами на первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с LRRK2-БП и GBA-БП было показано влияние ингибирования киназной активности LRRK2 на увеличение активности фермента GCase (Усенко и др.,2022). Предполагается, что разрабатываемая терапия для LRRK2-БП может подойти для лечения и GBA-БП. При этом дисфункция как GCase, так и LRRK2 приводит к воспалению и нарушению аутофагии, ключевого процесса в деградации альфа-синуклеина в клетке. Ранее проведенный нами транскриптомный анализ клеток черной субстанции мышиной модели с индукцией паркинсонизма посредством инъекции 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) и дисфункцией фермента GCase за счет введения селективного ковалентного ингибитора GCase кондуритол-бета-эпокcида (СВЕ) показал нарушение аутофагии, в частности, нарушение пути PI3K/AKT/mTOR и накопление альфа-синуклеина (Usenko et al.,2023,IJMS, submitted, Pchelina et al., Neurobiol Dis,2023,submitted). Мы предполагаем, что индукция аутофагии может быть использована как для терапии БП с известной этиологией (LRRK2-БП, GBA-БП), так и спорадической формы БП (сБП). Важно отметить, что сБП также как и LRRK2-БП, GBA-БП характеризуется нарушением аутофагии. В настоящее время в качестве ингибитора mTOR в экспериментальных исследованиях используется рапамицин, который, однако, может вызвать гиперингибирование mTOR и, как следствие, гиперактивацию аутофагии и апоптоза, что может быть летально для клеток (Zhu et al.,2019,doi:10.3390/ijms20030728). В настоящем проекте в качестве ингибитора mTOR впервые будет использован Torin1, эффективность которого была показана на нейронах, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с болезнью Гоше, которые являются гомозиготными или компаундными носителями мутаций в гене GBA1, в отношении улучшения процессов биогенеза лизосом и аутофагии (Brown et al.,2019, https://doi.org/10.1242/dmm.038596). В качестве объекта исследования в подаваемом проекте будет использована первичная культура макрофагов периферической крови по ранее отработанному нами протоколу. Будут включены группы с наследственными формами БП, как LRRK2-БП, так и GBA-БП, а также пациенты со сБП. Будет проведена оценка влияния ингибитора mTOR, Torin1, а также сочетанного влияния Torin1 с ингибитором белка STING, вовлеченного в индукцию воспаления, H-151, на уровень альфа-синуклеина, степень аутофагии, уровень провоспалительных цитокинов, апоптоз, активность лизосомных ферментов и концентрацию субстратов на первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с GBA-БП, LRRK2-БП, а также сБП и в контроле. Также будет использована клеточная линия нейробластомы SH-SY5Y, культивируемая в присутствии иона 1-метил-4-фенилпиридиния (МРР+). На данной клеточной модели БП будет оценен уровень альфа-синуклеина, степень аутофагии, активность лизосомных ферментов и концентрация субстратов в присутствии ингибитора mTOR, Torin1, а также при сочетанном действии Torin1 и ингибитора белка STING, H-151. Таким образом, впервые будут оценены перспективы использования mTOR и STING в качестве мишеней для разработки терапии как моногенных форм БП (GBA-БП, LRRK2-БП), так и сБП в клетках крови человека, а также клеточной линии нейробластомы SH-SY5Y.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Молекулярный механизм БП остается неизвестным. Выявлены две самые распространённые формы БП с известной этиологией - БП, ассоциированная с мутациями в гене GBA1, и БП, ассоциированная с мутациями в гене LRRK2. Лекарственных нейропротекторных препаратов при GBA1-БП и LRRK2-БП на сегодняшний день не существует. GBA1-БП характеризуется снижением активности кодируемого геном GBA1 лизосомного фермента β-глюкоцереброзидазы (GCase), LRRK2-БП - увеличением киназной активности лейцин богатой лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), которая кодируется геном LRRK2. При этом дисфункция как GCase, так и LRRK2 приводит к воспалению и нарушению аутофагии, ключевого процесса в деградации альфа-синуклеина в клетке. Ранее было показано нарушение процессов аутофагии, в частности, mTOR-зависимой аутофагии. В настоящее время в качестве ингибитора mTOR в экспериментальных исследованиях используется рапамицин, который, однако, может вызвать гиперингибирование mTOR и, как следствие, гиперактивацию аутофагии и апоптоза, что может быть летально для клеток (Zhu et al.,2019, doi:10.3390/ijms20030728). Актуально использование двух терапевтических мишеней, которые влияли бы на параметры клетки без индукции воспаления и апоптоза. Второй мишенью можно рассмотреть белок STING, который регулирует иммунные реакции в клетке, но в последних исследованиях была рассмотрена возможность использования его в качестве мишени для терапии БП (Hinkle et al, 2022, doi/10.1073/pnas.2118819119). За первый год проведения исследования неврологами был обследован 81 пациент с БП. Диагноз БП ставился в соответствии международными критериями Британского банка мозга (Hughes et al., 1992) и критериями сообщества по двигательным расстройствам (Postuma et al., 2015). В ходе скрининга было выявлено два пациента с мутациями в гене GBA1 - один с мутацией p.N370S/N и второй с мутацией p.L444P/N. Таким образом, в нашем исследовании имеется банк 34 пациента с GBA1-БП и 27 пациентов с LRRK2-БП. Исследование было одобрено этическим комитетом. Все участники подписывали информированное согласие. В исследование текущего года включены 10 неврологически здоровых участников. Первичная культура макрофагов была получена методом градиентного центрифугирования крови с использованием раствора Фиколл. Клетки культивировали в среде RPMI с добавлением М-КСФ, антибиотиков и сыворотки (по протоколу Nikolaev et al., 2018). Макрофаги инкубировали в присутствии ингибиторов mTOR (Torin 1) и/или STING (H-151) в концентрациях 25–200 нМ и 0.25–2 µМ соответственно, выбранных по результатам МТТ-теста. Клетки нейробластомы SH-SY5Y культивировались в среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и гентомицином, дифференцированы по протоколу (Riegerová et al., 2022). На 9 сутки добавляли ингибиторы в тех же концентрациях, инкубируя 24 часа. Все эксперименты выполнены в трех повторах. Методом вестерн-блоттинг было определено дозозависимое влияние ингибиторов протеинкиназы mTOR (Torin 1) и STING (H-151) на основные параметры аутофаголизосомной системы в первичной культуре макрофагов периферической крови неврологически здоровых индивидуумов и клеточной линии SH-SY5Y. В макрофагах Torin 1 снижал p-RPS6 (Ser235/236) и BECN1, активировал аутофагию (снижение p62, накопление LC3B-II), но замедлял деградацию груза в лизосомах по изменению форм CTSD. Уровень GCase повышался при 100 нМ Torin 1. В SH-SY5Y наблюдалось снижение p-mTOR (Ser2448) и p-RPS6 при всех концентрациях Torin 1, уменьшение BECN1 и p62, но без накопления LC3B-II. Лизосомная активность снижалась по изменению уровня CTSD. Torin 1 снижал фосфорилированую и повышал тетрамерную форму альфа-синуклеина и тирозингидроксилазу при 100 нМ. Культивирование макрофагов с H-151 приводило к дозозависимо повышению STING и снижению p-TBK1, модулируя аутофагию по изменениям в уровне BECN1, p62, LC3B-II, CTSD. При этом уровень GCase не изменялся. В SH-SY5Y H-151 снижал STING, p-TBK1, уровни альфа-синуклеина (все формы) и тирозингидроксилазу при 1 µМ. Сочетанное действие Torin 1 и H-151 в макрофагах и в SH-SY5Y нивелировало эффекты основных мишеней ингибиторов p-mTOR, p-RPS6, STING. В макрофагах сочетанная обработка Torin 1 и H-151 приводила также к модуляции процессов аутофагии в макрофагах и SH-SY5Y (увеличение уровня BECN1 и p62, снижение LC3B-II), а также увеличению зрелой формы CTSD, что свидетельствовало об активации процессов деградации груза в лизосоме и снижению уровня GCase. В SH-SY5Y комбинация приводила к значительному снижению фосфорилированного mTOR и всех форм альфа-синуклеина, увеличивала тирозингидроксилазу при Torin 1 (100 нМ) и H-151 (1 µМ). Методом ВЭЖХ-МС/МС проанализировали активность лизосомных ферментов (GCase, GLA, ASMase, GAA, IDUA, GALC) и уровень лизосфинголипидов (HexSph, LysoGb3, LysoSM) в макрофагах и клетках SH-SY5Y. Torin 1 нижал активность GLA, ASMase (200 нМ) и HexSph (50 нМ), но значительных изменений активности ферментов и уровней лизосфинголипидов в целом не вызывал. H-151 Уменьшал активность всех ферментов (кроме GAA и GLA) и снижал LysoGb3 на всех концентрациях. Комбинация Torin 1 + H-151 не влияла на активность ферментов, но уменьшала концентрацию HexSph и LysoGb3, что может препятствовать агрегации альфа-синуклеина. При добавлении MPP+ в SH-SY5Y активность гидролаз (GCase, GLA, ASMase) снижалась. H-151 (0.25–0.5 µM) повышал их активность и уменьшал уровень LysoGb3 (особенно при 1 µM). Комбинация Torin 1 и H-151 снижала лизосфинголипиды, подтверждая её потенциальную эффективность в отношении снижения агрегации альфа-синуклеина. Torin 1 сам по себе снижал LysoGb3, но не влиял на активность гидролаз в присутствии MPP+. Методом проточной цитофлуориметрии с использованием набора Annexin V-FITC показано, что Torin 1 и Н-151 не влияют выраженно на ранний и поздний апоптоз. Сочетанное действие Torin 1 и H-151 приводит к снижению раннего апоптоза во всех комбинациях и менее выраженное, но снижение и позднего апоптоза. Сочетанное действие ингибиторов Torin 1 и H-151 продемонстрировало потенцирующий эффект в снижении уровней лизосфинголипидов, которые считаются ключевыми триггерами агрегации альфа-синуклеина. Также данное сочетание способствовало активации аутофагии и улучшению функции лизосом, проявляясь в увеличении зрелой формы CTSD и снижении LC3B-II. В отличие от раздельного применения, комбинация препаратов уменьшала ранний и поздний апоптоз, а также оказывала более выраженное воздействие на снижение триггерных молекул, связанных с патологией БП. Полученные результаты подтверждают перспективность подхода к использованию одновременно нескольких мишеней для модификации клеточных процессов без избыточной активации воспаления и апоптоза.

Публикации

1. Безрукова А.И., Башарова К.С., Руденок М.М., Байдакова Г.В., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Сломинский П.А., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. MTOR-потенциальная мишень для таргетной терапии болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1 Наукоград Кольцово, Новосибирск, 613-614 (год публикации - 2024)

2. Усенко Т.С., Безрукова А.И., Башарова К.С., Руденок М.М., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Сломинский П.А., Пчелина С.Н. Нарушение mTOR‐зависимой аутофагии при болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1, на основе анализа транскриптома. Саратов, с. 108. (год публикации - 2024)

3. Безрукова А.И., Башарова К.С., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Протеинкиназа mTOR — потенциальная мишень для терапии болезни Паркинсона Саратов, c. 466 (год публикации - 2024)

4. Безрукова A.И., Башарова K.С., Милюхина И.В., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Экспрессия генов mTOR-зависимой аутофагии у пациентов с болезнью Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1, и бессимптомных носителей мутаций в гене GBA1 в мононуклеарах периферической крови Гатчина (год публикации - 2024)

5. Безрукова А.И., Башарова К.С., Милюхина И.В., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Нарушение mTOR-зависимой аутофагии в мононуклеарах периферической крови у пациентов с болезнью Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1, и бессимптомных носителей мутаций в гене GBA1 Санкт-Петербург, с.171-172 (год публикации - 2024)

6. Безрукова А.И., Башарова К.С., Байдакова Г.В. , Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Dose-Dependent Alterations of Lysosomal Activity and Alpha-Synuclein in Peripheral Blood Monocyte-Derived Macrophages and SH-SY5Y Neuroblastoma Cell Line by upon Inhibition of MTOR Protein Kinase - Assessment of the Prospects of Parkinson's Disease Therapy Biochemistry (Moscow), 89(7):1300-1312 (год публикации - 2024)
doi: 10.1134/S0006297924070113

7. Безрукова А.И., Башарова К.С., Милюхина И.В., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Первичная культура макрофагов периферической̆ крови как модель для изучения процессов аутофагии и разработки таргетной терапии для идиопатической и моногенной форм болезни Паркинсона Санкт-Петербург, с.110-112 (год публикации - 2024)

8. Безрукова А., Башарова К., Байдакова Г., Захарова Е., Пчелина С., Усенко Т. Dose-dependent alterations of lysosomal activity and alpha-synuclein level in peripheral blood monocyte-derived macrophages and SH-SY5Y neuroblastoma cell line by upon inhibition of mTOR kinase activity USA (год публикации - 2024)

9. Безрукова А.И., Галкина Е.С., Башарова К.С., Байдакова Г.В., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Цитокиновый профиль плазмы крови пациентов с болезнью Паркинсона в зависимости от типа мутаций в гене GBA1 и эффект таргетной модуляции сигнальных путей STING/mTOR in vitro Материалы X Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, с. 15-16 (год публикации - 2025)

10. Безрукова А.И., Башарова К.С., Милюхина И.В., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Изменение экспрессионного профиля генов сигнального киназного пути PI3K/AKT/mTOR как биомаркер болезни Паркинсона среди носителей мутаций в гене GBA1 Сборник научных трудов представленных на VIII Съезде физиологов СНГ, XV аллергологов и иммунологов СНГ и Симпозиуме «Белки и пептиды» в рамках Объединенного научного форума, с. 12 (год публикации - 2025)

11. Усенко Т.С., Безрукова А.И., Башарова К.С., Емельянов А.К., Копытова А.Э., Милюхина И.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н. Cкрининг препаратов для таргетной терапии болезни Паркинсона на пациент-специфичных клетках Сборник научных трудов представленных на VIII Съезде физиологов СНГ, XV аллергологов и иммунологов СНГ и Симпозиуме «Белки и пептиды» в рамках Объединенного научного форума, с. 83 (год публикации - 2025)

12. Безрукова А.И., Башарова К.С., Милюхина И.В., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Modifiers of Parkinson's disease associated with mutations in the GBA1 gene based on transcriptome data validation Mov Disord, 40 (suppl 1) (год публикации - 2025)

13. Калугина Е.С., Безрукова А.И., Башарова К.С., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Дозозависимое влияние селективного ингибитора STING на активность лизосомных гидролаз и концентрацию лизосфинголипидов в первичной культуре макрофагов периферической крови человека Сборник тезисов XI Всероссийского молодежного научного форума с международным участием “OpenScience 2024”. , Страница 84 (год публикации - 2024)

14. Усенко Т.С. Сигнальный путь STING как мишень нейропротекторной терапии при болезни Паркинсона Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова , том 111, No 6, с. 821–846 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.31857/S0869813925060018

15. Усенко Т. С., Безрукова А. И., Башарова К. С., Байдакова Г. В. , Захарова Е. Ю., Пчелина С. Н. Первичная культура макрофагов периферической крови как модель для скрининга таргетных препаратов для терапии болезни Паркинсона Медицинская генетика, 24(7):109-111 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.25557/2073-7998.2025.07.109-111

16. Усенко Т.С. Нарушение процессов аутофагии при болезни Паркинсона: подходы к терапии Молекулярная биология, Том 59, № 1, 55-74 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.31857/S0026898425010053

17. Усенко Т.С., Безрукова А.И., Башарова К.С., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н. Targeting inflammation and autophagy: a dual-inhibition strategy to reduce α-synuclein pathology in GBA1-associated Parkinson’s disease Mov Disord, 40 (suppl 1) (год публикации - 2025)

18. Безрукова А. И., Башарова К. С., Григорьева Е. В., Павлова С. В., Байдакова Г. В., Захарова Е. Ю., Пчелина С. Н., Усенко Т. С. Альтернативная стратегия терапии GBA1-ассоциированной болезни Паркинсона: модуляция функции глюкоцереброзидазы через путь mTOR Сборник Тезисов XII международной конференции молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины, С. 486-487 (год публикации - 2025)

19. Галкина Е.С., Башарова К.С., Безрукова А.И., Усенко Т.С. Ингибирование активности mTOR влияет на параметры аутофаголизосомной системы первичной культуры макрофагов периферической крови Материалы XXXI всероссийской конференции молодых учёных с международным участием Актуальные проблемы биомедицины - 2025, Страницы 223-224 (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Болезнь Паркинсона (БП) – одно из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний, характеризующееся гибелью дофаминергических нейронов в черной субстанции головного мозга. В основе патогенеза БП лежит накопление и агрегация белка альфа-синуклеина. Молекулярный механизм БП остается неизвестным. Выявлены две самые распространенные формы БП с известной этиологией - БП, ассоциированная с мутациями в гене GBA1 (GBA1-БП) и с мутациями в гене LRRK2 (LRRK2-БП). Лекарственных нейропротекторных препаратов при GBA1-БП и LRRK2-БП на сегодняшний день не существует. Ранее нами были выявлены на уровне транскриптома нарушение путей mTOR и STING на пациент-специфичных клеток GBA1-БП и модельных животных с МФТП-индуцированным паркинсонизмом. Однако, нарушение этих путей при БП ранее не охарактеризовано в первичной культуре макрофагов периферической крови и не оценена перспектива одновременного использования модуляторов активности путей mTOR и STING в качестве потенциального подхода для терапии. В отчетном периоде была выполнена комплексная оценка лизосомной функции, включая степень активации аутофагии и активность лизосомных гидролаз, активности сигнальных путей mTOR и STING, а также воспалительного ответа в первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона (БП), ассоциированной с мутациями в генах GBA1 и LRRK2, пациентов со спорадической формой БП и неврологически здоровых индивидуумов. Дополнительно исследовано влияние ингибиторов mTOR (Torin 1) и STING (H-151), а также их комбинации на модуляцию лизосомной функции. Оценка активности шести лизосомных ферментов (GCase, GLA, GAA, GALC, ASMase, IDUA) и концентрации лизосфинголипидов (HexSph, LysoSM, LysoGb3) проводилась методом ВЭЖХ-МС/МС. Анализ выполнялся в соответствии с модифицированными протоколами Zhang et al. (2008) и Polo et al. (2017). Наиболее выраженные изменения наблюдались в группе GBA1-БП, где выявлено снижение активности GCase, сопровождающееся накоплением HexSph и LysoGb3. У пациентов с LRRK2-БП отмечено снижение активности GALC и повышение концентрации всех исследуемых лизосфинголипидов (HexSph, LysoGb3 и LysoSM). В группе пациентов со сБП было выявлено снижение активности ASMase и накопление HexSph. Таким образом, при всех формах БП выявлено накопление HexSph в первичной культуре макрофагов периферической крови. Методом вестер-блот по оценке ключевых мишеней была выявлена активация сигнальных путей mTOR и STING. В честности, было показано, что уровень p-mTOR повышен при сБП, а p-RPS6 — у GBA1-БП и LRRK2-БП, что указывает на активацию mTOR. Уровень p-TBK1 повышен при всех формах БП, что отражает активацию STING, при этом содержание самого STING снижался у пациентов со сБП и LRRK2-БП. Методом иммунофлуоресцентной микроскопии выявлено, что у GBA1-БП снижена колокализация LC3B с лизосомами и уменьшен средний размер лизосом, что свидетельствует о нарушении аутофаголизосомального слияния. Уровень Beclin-1 повышен, а p62 имеет тенденцию к снижению, что отражает сохраненную инициацию аутофагии при замедленной стадии деградации. У LRRK2-БП уровни Beclin-1 и LC3B соответствуют контролю, а p62 имеет тенденцию к умеренному повышению, что указывает на замедление переработки субстратов. У пациентов со сБП отмечено снижение Beclin-1 и повышение p62 при умеренном накоплении LC3B, что отражает ослабленную инициацию аутофагии и замедление завершения процесса. Методом вестерн-блот было оценено влияние ингибиторов mTOR (Torin 1) и STING (H-151) на степень аутофагии и активацию путей mTOR и STING. Показано, что Torin 1 снижает уровни p-mTOR и p-RPS6, H-151 снижает p-TBK1 и STING, наиболее выраженно у пациентов с GBA1-БП. Torin 1 повышает активность GCase и GALC у GBA1-БП, а H-151 снижает HexSph и LysoGb3. Комбинированное применение Torin 1 + H-151 дополнительно усиливает положительное влияние на ключевые гидролазы GCase и GALC. Torin 1 и комбинация Torin 1+H-151 частично восстанавливают аутофагию. В частности, происходит увеличение количества лизосом, усиление колокализации LC3-позитивных структур с лизосомами, нормализация размеров лизосомных компартментов, особенно у GBA1-БП. Белки аутофагии Beclin-1 и p62 снижаются под действием ингибиторов, а соотношение LC3B-II/LC3B-I увеличивается, что отражает улучшение переработки субстратов. Воздействие ингибиторов на формы катепсина D зависит от генетического подтипа. У пациентов с GBA1-БП снижаются все формы катепсина D при увеличении GCase, у пациентов со сБП преимущественно снижаются зрелые формы катепсина D. Методом иммунофлуоресцентной микроскопии показано, что Torin 1 и комбинация Torin 1 + H-151 частично восстанавливают аутофагию. Увеличивается количество лизосом, усиливается колокализация LC3-позитивных структур с лизосомами, нормализуются размеры лизосомных компартментов, особенно у GBA1-БП. Белки аутофагии Beclin-1 и p62 снижаются под действием ингибиторов, а соотношение LC3B-II/LC3B-I увеличивается, что отражает улучшение переработки субстратов. Методом оценки цитокинового профиля показано, что у GBA1-БП и сБП повышена секреция IL-6, TNF-α и IL-1β, а IFN-γ снижен у GBA1-БП, что свидетельствует о дисбалансе провоспалительного и интерферонового ответа. Комбинированное ингибирование mTOR и STING снижает IL-6 у GBA1-БП, подтверждая участие этих путей в регуляции воспалительной активации макрофагов. В целом показано, что лизосомная дисфункция, нарушение аутофагии и активация сигнальных путей STING/mTOR являются ключевыми механизмами патогенеза различных форм БП. Макрофаги периферической крови могут служить моделью для оценки этих процессов и тестирования фармакологических вмешательств. Комбинированное ингибирование mTOR и STING демонстрирует восстановительный эффект на лизосомную функцию и аутофагию, особенно у пациентов с GBA1-БП.

Публикации