Роль локального чекпойнта в мутационном процессе у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-24-00119

НазваниеРоль локального чекпойнта в мутационном процессе у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Руководитель Королев Владимир Геннадиевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" , Ленинградская обл

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-104 - Общая генетика

Ключевые слова 1.3. Ключевые слова: локальный чекпойнт, дрожжи, индуцированный мутагенез, репарация

Код ГРНТИ34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Эукариотические клетки имеют специализированный ответ на повреждение ДНК, называемый «чекпойнтом», который задерживает развитие клеточного цикла и способствует репарации поврежденной ДНК. Этот процесс подразделяют на два пути. Глобальный чекпойнт имеет решающее значение для поддержания целостности генома при острой стрессовой ситуации, связанной с появлением большого числа повреждений ДНК. В нормальных условиях роста клетка постоянно балансирует между остановкой клеточного цикла и пролиферацией в условиях постоянных эндогенных и экзогенных повреждений ДНК (примерно 20 000 повреждений в день на клетку человека). Индукция чекпойнта определяется количеством однонитевой ДНК, возникающей в процессе репарации повреждений. В почкующихся дрожжах чекпойнтный ответ инициируется ОН ДНК через активацию киназы Mec1, которая ответственна за активацию эффекторной киназы Rad53. Через фосфорилирование большого числа субстратов, Rad53 осуществляет большинство аспектов чекпойнтного ответа, включая супрессию активации поздних ориджинов, контроль уровня синтеза нуклеотидов, регуляцию повреждение-индуцированной транскрипции, задержку клеточного цикла. К тому же, активация чекпойнта инициируется локализацией некоторых белков в остановленной вилке. В дрожжах Mec1 привлекается к онДНК покрытой RPA через физическое взаимодействие с Ddc2 субъединицей белкового комплекса MEC1. RPA-покрытая онДНК также привлекает погрузчик Rad24 к 5’-стороне бреши, где он загружает скрепку 9-1-1 на ДНК (Rad17-Mec3-Ddc1). Для генотоксических агентов существует порог дозы, ниже которого активация чекпойнта минимальна, несмотря на измеримую активность путей репарации ДНК . Процессы репарации, происходящие при уровнях повреждений ДНК ниже порогового, контролируются локальным чекпойнтом. Основное отличие локального от глобального чекпойнта состоит в том, что клетки практически не задерживаются в контрольных точках клеточного цикла и ключевую роль в локальном чекпойнте играет киназа Mec1, в то время как роль киназы Rad53 значительно снижается, а Rad9 вообще не принимает участия. Наибольший выход мутаций происходит при промежуточных уровнях экспрессии комплекса RNR, который контролирует синтез (dNTP) в клетках дрожжей. Локальный чекпойнт функционирует как раз при таких промежуточных уровнях экспрессии RNR из-за пониженной активности киназы Rad53. Мы предполагаем, что низкая активность киназы Rad53 при локальном чекпойнте должна привести к повышенному выходу УФ-индуцированных мутаций. Эту гипотезу планируется проверить анализом выхода УФ-индуцированных мутаций у дикого типа клеток путем сравнения наклона кривых мутагенеза при низких и высоких дозах УФ. Мутации в генах HIM1, HSM3, HIF1 приводят к высокому УФ-индуцированному мутагенезу при глобальном чекпойнте из-за снижения экспрессии RNR (E.A.Alekseeva, T.A. Evstyukhina, V.T. Peshekhonov, V.G. Korolev. 2021. Curr Genet. 67, pages 141–151. 2021). Мы предполагает, что такой же эффект этих мутаций будет проявляться и при локальном чекпойнте из-за дальнейшего снижения активности киназы Rad53. Это предположение будет проверено путем анализа УФ-мутагенеза и измерения экспрессии RNR у мутантов по перечисленным генам при низких дозах излучения. Активность репарационной полимеразы Polη, ответственной за повышенный мутагенез у мутантов him1, hsm3 и hif1, повышается при высоких дозах облучения в конце S-периода. Будет ли высокой роль этой полимеразы в УФ-мутагенезе при низких дозах будет проверено путем анализа спектров УФ-индуцированных мутаций в гене CAN1 у штамма дикого типа и мутанта hif1. Таким образом, в предлагаемом проекте, предполагающем исследование роли локального чекпойнта в индуцированном мутагенезе впервые будет оценена роль экспрессии комплекса RNR и активности высоко ошибочной полимеразы Polη в УФ-индуцированном мутагенезе и получено новое знание о биологическом действии низких доз ДНК-повреждающих агентов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Алексеева Е.А., Евстюхина Т.А., Пешехонов В.Т., Скобелева И.И., Королев В.Г. In yeast Saccharomyces cerevisiae, repair chromatin assembly depends on the cooperative functioning of the Him1 protein and RPD3 and NuB4 complexes Elsevier (год публикации - 2024)

2. И.И. Скобелева, Т.А. Евстюхина, Е.А. Алексеева, В.Т. Пешехонов, Д.В. Федоров, В.Г. Королев Репаративная сборка хроматина играет важную роль в стабильности генома. Генетика (год публикации - 2025)

3. Алексеева Е.А., T. A. Евстюхина Т.А., Пешехонов В.Т., Королев В.Г. In yeast Saccharomyces cerevisiae, repair chromatin assembly depends on the cooperative functioning of the Him1 protein and RPD3 and NuB4 complexes Journal of Biomedical Research and Environmental Siences, J. Biomed. Res. & Environmental Sci. VOLUME: 5 ISSUE: 2024 (год публикации - 2024)
10.37871/jbres1902

4. Е.А. Алексеева, Т.А. Евстюхина, И.И. Скобелева, В.Т. Пешехонов, В.Г. Королев The Reparative DNA Polymerase Polη Plays a Key Role in Mutagenesis at Low Doses of UV Radiation in Yeast Saccharomyces cerevisiae. Генетика, Russian Journal of Genetics, 2024, Vol. 60, No. 12, pp. 1611–1620. (год публикации - 2024)
10.1134/S1022795424701199

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Е.А. Алексеева, Т.А. Евстюхина, В.Т. Пешехонов, И.И. Скобелева, В.Г. Королев. Роль комплекса RPD3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae в активации УФ-индуцированной экспрессии генов RNR комплекса. Репаративная сборка хроматина является важным этапом в поддержании стабильности генома. Правильную сборку хроматина обеспечивают гистоновые шапероны. Нарушение функции этих белков может приводить к развитию различных форм рака и к ряду наследственных заболеваний у человека. Одним из ключевых процессов в репаративной сборке хроматина является ацетилирование и деацетилирование гистонов, комплексов NuB4 и RPD3. Результаты, представленные в данной работе, демонстрируют, что вклад деацетилирования киназы Rad53 вносит существенный вклад в регуляцию гиперактивации киназы после УФ-облучения. Кроме того, полученные данные показывают, что потеря комплекса RPD3 приводит к дестабилизации нуклеосомы в результате снижения эффективности процесса ее сборки и отсутствия эффективного деацетилирования гистонов. Кроме того, в данной работе представлены доказательства того, что белок Him1 может участвовать в качестве гистонового шаперона в репаративной сборке хроматина совместно с шапероном Asf1 и комплексами NuB4 и RPD3. Е.А. Алексеева, Т.А. Евстюхина, В.Т. Пешехонов, В.Г. Королев. Репаративная ДНК полимераза ета (Polη) играет ключевую роль в мутагенезе при низких дозах УФ-облучения у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 2024. Генетика. 2024, том 60, № 12, с. В нормальных условиях и при воздействии малых доз мутагенов, ключевым способом борьбы с повреждениями ДНК у бактериальных и эукариотических клеток являются системы толерантности к повреждениям ДНК (ТПД). Два различных пути ТПД, ошибочный (translesion synthesis - TLS) и безошибочный (рекомбинационный), действуют во всех эукариотических организмах. TLS вовлекает белковый комплекс полимеразы zeta (кодируемый генами Rev1, REV3 и REV7), и полимеразу eta (кодируемую геном RAD30); эти полимеразы консервативны от дрожжей до человека. Мы показали, что при низких уровнях доз УФ-излучения решающую роль в мутагенезе играет высокая активность Polη, которая обходит подавляющее число, оказавшихся на пути репликативной машины повреждений ДНК. Как в случае облучения высокими, так и низкими дозами УФ-лучей, большую роль в индуцированном мутагенезе играет чекпойнт. Однако роли генов участвующих в регуляции УФ-индуцированного мутагенеза при низких и высоких дозах часто различаются. Инактивация гена RAD30 при низких дозах приводит к повышенному уроню индуцированного мутагенеза, а при высоких дозах практически не отличается от уровня штамма дикого типа. Делеции генов HIM1, HSM3 и HIF1, наоборот, снижают высокий уровень мутагенеза, характерный для высоких доз, до уровня штамма дикого типа при низких дозах. Эти различия характеризуют локальный и глобальный чекпойнт. Т.А. Евстюхина, Е.А. Алексеева, В.Т. Пешехонов, Д.В. Федоров, В.Г. Королев. Репаративная сборка хроматина играет важную роль в стабильности генома. Генетика. 2025, том 61, № 2, с. При завершении репарации повреждений ДНК важную роль играют процессы, связанные с восстановлением нормальной структуры хроматина. Некорректная сборка хроматина может привести к геномным перестройкам, которые, в свою очередь, могут быть причиной развития многих болезней, включая рак. Ранее мы показали, что нарушения правильности сборки нуклеосом и их ремодулирования в процессе репаративной сборки хроматина приводит к повышенному уровню мутагенеза. В данной работе мы показали, что мутация asf1Δ имеет конститутивно гиперактивированную киназу Rad53, что служит причиной дезорганизация архитектуры хроматина и драматически изменяет спектр спонтанных репаративных мутаций. Нарушение сайта связывания адапторного белка Rad9 с ДНК в результате инактивации гена DOT1 нивелирует hif1Δ-специфический мутагенез, который является следствием некорректной репаративной сборкой нуклеосом. Отсутствие белка Rad9 в нормальных условиях роста и при обработке низкими дозами УФ-лучей приводит к аберрантной активации комплекса RNR. При этом дальнейшее увеличение дозы УФ-облучения, практически, не влияет на экспрессию RNR3. Эти результаты подтверждают, что корректная сборка хроматина критична для нормального функционирования генома.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Изученные нами мутанты могут и используются для создания тест-штаммов для анализа присутствия генотоксикантов в окружающей среде