Построение структурной базы для рационального дизайна биологически значимых макромолекул с использованием криоэлектронной микроскопии

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 19-74-20146

НазваниеПостроение структурной базы для рационального дизайна биологически значимых макромолекул с использованием криоэлектронной микроскопии

Руководитель Штам Татьяна Александровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" , Ленинградская обл

Конкурс №31 - Конкурс 2019 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова криоэлектронная микроскопия, биоподобные структуры, рациональный дизайн, экзосома, вирусоподобная частица, нуклеопротеин, бета-галактозидаза, глюкоамилаза, мРНК, пептидные препараты

Код ГРНТИ34.17.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Современное представление о структуре биологической материи невозможно без использования методов структурной биологии. На данный момент существует три основных метода исследований структуры – это кристаллография, исследование структуры путем ядерного магнитного резонанса и метод электронной микроскопии. В последние 15 лет одно из направлений электронной микроскопии получило наибольшее развитие в структурной биологии – это метод криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ). Данный метод позволяет исследовать образцы в условиях близких к нативным: состав буферов и концентрация солей могут быть идентичными таковым в клетке. Это дает неоспоримое преимущество перед другими методами, позволяя не только получать информацию о структуре биомакромолекул, но и исследовать конформационные состояния белковых комплексов при их функционировании. На сегодняшний день крио-ЭМ достигла разрешения, сопоставимого с кристаллографией. Так последние исследования белков бета-галактозидазы и апоферритина достигли разрешения в 1.6А, T20S протеосомы и вирусов – 1.8А, 70S и 50S рибосомы прокариот 2.1А. Разрешение такого уровня кардинально меняет представление о структуре белковых комплексов. При таком разрешении мы видим не только все боковые цепи белковой молекулы, но и ионы металлов и молекулы воды вокруг и внутри функциональных центров. Подобного рода структуры дают нам возможность на совершенно новом уровне подходить к производству лекарственных средств таких как антибиотики, витамины и расширяют возможности биотехнологии. В совокупности все знания о подвижности разных частей молекулы белка, взаимодействие с ионами металлов и молекулами воды представляют интерес как для фундаментальной науки, так и для прикладной ее составляющей. Предлагаемый проект направлен на разработку целого ряда новых потенциальных лекарственных препаратов и ферментов с улучшенными свойствами, которые могут быть использованы в фармакологии, с применением общих подходов, основанных на методах получения структурной информации в нативных условиях: крио-ЭМ, малоугловое рассеяние нейтронов и рентгеновских лучей, динамическое светорассеяние. В рамках проекта будет получена структурная база для разработки противогриппозных вакцин как методами генной инженерии, путем конструирования вирусоподобных частиц из коровых белков вируса гепатита B с внесением антигенов различных вирусов, так и обратной генетики, путем рационального дизайна мутаций в нуклеопротеине (NP) вируса гриппа А, определяющих диапазон температур активности вируса. Структурно-функциональные характеристики олигомерных частиц нуклеопротеина вируса гриппа полученные в результате запланированных экспериментов, могут быть также использованы для рационального дизайна противовирусных препаратов на основе пептидных ингибиторов генетического аппарата вируса. Кроме самого таргетного комплекса, будут исследованы свойства экзосом в качестве перспективных носителей как потенциальных ингибиторов функции данного белка, так и других препаратов на основе коротких пептидных последовательностей. Полученные результаты приблизят создание принципиально новой терапевтической методики, основанной на использовании аутологичных экзосом «нагруженных» молекулами РНК. В рамках проекта будет создан структурный базис для исследования начальных этапов реакции гомологической рекомбинации у бактерий на примере белков RecA из E.coli. Это позволит понять молекулярные и структурные механизмы поиска гомологии в RecA подобных белках, а именно как происходит узнавание ДНК и поиск гомологического учатска. Полученные знания могут применяться для инженерии RecA-подобных ферментов, обеспечивающих быстрый обмен гомологичными участками между иммобилизованной зондовой ДНК и исследуемым образцом в диагностических чип-системах. Разрабатываемые в проекте подходы дизайна макромолекул на основе структурных данных высокого разрешения, полученных в нативных условиях, будут применены для решения задач, связанных с созданием ферментов с изменёнными/заданными свойствами, используемых в производстве пищевых продуктов, пребиотиков и функциональных наполнителей таблеток, содержащих другие лекарственные препараты. Получение структур высокого разрешения для белков β-галактозидазы из археи Desulfurococcus amylolyticus и глюкоамилазы из Aspergillus awamori позволит методами белковой инженерии, рационального дизайна и направленной эволюции создать мутантные формы ферментов, демонстрирующие новые функциональные свойства: повышение термо- и рН-стабильности, увеличение выхода продуктов реакции по сравнению с ферментами дикого типа.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Чеблоков А.А., Пичкур Е.Б., Киль Ю.В. , Сергеев В.Р., Рычков Г.Н. Dimer structure of highly thermostable archaeal beta-galactosidase revealed by Cryo-EM International journal of biomedicine, 2019;9 Suppl 1: S32-33 (год публикации - 2019)
10.21103/IJBM.9.Suppl_1.P44

2. Швецов А.В., Пичкур Е.Б., Штам Т.А., Егоров В.В., Цибалова Л.М., Степанова Л.А., Шалджян А.А., Забродская Я.А. HBc4M2e Virus-Like Particles for Influenza A Vaccine Development: a Cryo-EM Study International journal of biomedicine, 2019;9 Suppl 1: S32-33 (год публикации - 2019)
10.21103/IJBM.9.Suppl_1.P36

3. Штам Т.А., Емельянов А.К., Камышинский Р.А., Гараева Л.А., Верлов Н.А., Кудреватых А., Гаврилов Г., Пчелина С.Н. Cryo-Electron Microscopy of Extracellular Vesicles from Cerebrospinal Fluid International journal of biomedicine, 2019;9 Suppl 1: S27-28 (год публикации - 2019)
10.21103/IJBM.9.Suppl_1.P25

4. Шмидт А.Е., Швецов А.В., Соболева Е.В., Сергеев В.Р., Суржик М.А., Киль Ю.В. Thermostability improvement of Aspergillus awamori glucoamylase via directed evolution of its gene located on episomal expression vector in Pichia pastoris cells Protein Engineering, Design, and Selection (год публикации - 2019)
10.1093/protein/gzz048

5. Коношенко М., Сагарадзе Г., Орлова Е., Штам Т., Проскура К., Камышинский Р., Юнусова Н., Александрова А., Ефименко А., Тамкович С. Both Cell-Free and Blood Cell-Surface-Associated Exosomes are Involved in the Crucial Stages of Carcinogenesis Int. J. Mol. Sci., 30.09.2020 (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21197341

6. Штам Т., Нарыжный С., Кулабухова Д., Гараева Л., Сенкевич К., Ланда С., Варфоломеева Е., Салогуб Г., Верлов Н.,Копылов А., Зорина Е., Камышинский Р., Усенко Т., Шварцман А., Захарова Е., Емельянов А., Пчелина С. Altered level of plasma exosomes in patients with Gaucher disease European Journal of Medical Genetics, European Journal of Medical Genetics 63 (2020) 104038 (год публикации - 2020)
10.1016/j.ejmg.2020.104038

7. Нарыжный С., Волницкий А., Копылов А., Зорина Е., Камышинский Р., Байрамуков В., Гараева Л., Шлихт А., Штам Т. Proteome of Glioblastoma-Derived Exosomes as a Source of Biomarkers Biomedicines, Biomedicines 2020, 8, 216 (год публикации - 2020)
10.3390/biomedicines8070216

8. Швецов А.В., Лебедев Д.В., Забродская Я.А., Шалджян А.А., Виноградова Д.С., Коневега А.Л., Гармай Ю.П., Исаев-Иванов В.В., Егоров В.В. и др. Cold and distant: structural features of the nucleoprotein complex of a cold-adapted influenza A virus strain Journal of Biomolecular Structure and Dynamics (год публикации - 2020)
10.1080/07391102.2020.1776636

9. Емельянов А., Штам Т., Камышинский Р., Гараева Л., Верлов Н., Милюхина И., Кудреватых А., Гаврилов Г., Забродская Ю., Пчелина С., Коневега А. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid PLosONE, 15(1): e0227949 (год публикации - 2020)
10.1371/journal.pone.0227949

10. Гараева Л., Камышинский Р., Варфоломеева Е., Ланда С., Киль Ю., Комарова Е., Коневега А., Штам Т. Plant-derived vesicles as a drug delivery system to human cells in vitro Book of abstracts of eighth international conference on radiation in various fields of research., Book of abstracts. p.13 (год публикации - 2020)

11. Гараева Л., Камышинский Р., Варфоломеева Е., Гармай Ю., Ланда С., Бурдаков В., Киль Ю. , Винников И., Каганский А., Комарова Е., Маргулис Б., Коневега А., Штам Т. Потенциал использования везикул растительного происхождения для доставки биомолекул. © НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ, 2020, Open Science 2020: материалы VII Всероссийского молодежного научного форума “Open Science 2020”. стр.110-11 (год публикации - 2020)

12. Штам Т., Евтушенко В., Самсонов Р., Забродская Я., Камышинский Р., Забегина Л., Верлов Н., Бурдаков В., Гараева Л., Слюсаренко М., Никифорова Н., Коневега А., Малек А. Evaluation of immune and chemical precipitation methods for plasma exosome isolation PLosOne, PLoS ONE 15(11): e0242732 (год публикации - 2020)
10.1371/journal.pone.0242732

13. Ястремский Е., Гараева Л., Путевич Е., Сазонов Д., Васильев А., Камышинский Р., Штам Т. Cryo-electron Microscopy Study of Vesicles from Various Species INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMEDICINE, том 11, номер S, стр. 18 (год публикации - 2021)
10.21103/IJBM.11.Suppl_1.P16

14. Гараева Л., Камышинский Р., Кулабухова Д., Ланда С., Варфоломеева Е., Пчелина С., Штам Т. Effect of glucocerebrosidase dysfunction on the pool of plasma exosomes of patients with Gaucher disease INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMEDICINE, том 11, стр. 31 (год публикации - 2021)
10.21103/IJBM.11.Suppl_1.P43

15. Л.А. Гараева, Р.А. Камышинский, Е.Ю. Варфоломеева, С.Б. Ланда, Ю.В. Киль, Е.Ю. Комарова, Е.Д. Путевич, А.Л. Коневега, Т.А. Штам ВЕЗИКУЛЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ КАК ДОСТАВЩИКИ ЭКЗОГЕННЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БИОМОЛЕКУЛ МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ, выпуск 19, стр. 59-61 (год публикации - 2021)
10.37747/2312-640X-2021-19-59-61

16. Гараева Л., Камышинский Р., Киль Ю., Варфоломеева Е., Верлов Н., Комарова Е., Гармай Ю., Ланда С., Бурдаков В., Мясников А., Винников И., Маргулис Б., Гужова И., Каганский А., Коневега А., Штам Т. Delivery of functional exogenous proteins by plant‑derived vesicles to human cells in vitro Scientific Reports, 11, Article number: 6489 (2021) (год публикации - 2021)
10.1038/s41598-021-85833-y

17. Л.А.Гараева, Р.А.Камышинский, Е.Ю.Варфоломеева, С.Б.Ланда, Ю.В.Киль, Е.Д.Путевич, Е.Ю.Комарова, А.Л.Коневега, Т.А.Штам Везикулы растительного происхождения – эффективные доставщики функциональных экзогенных биомолекул СБОРНИК ТЕЗИСОВ ДОКЛАДОВ III ОБЪЕДИНЕННОГО НАУЧНОГО ФОРУМА ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ, том 2, стр. 275 (год публикации - 2021)

18. Штам Т., Волницкий А., Koпылов А., Зорина Е., Камышинский Р., Байрамуков В., Гараева Л., Шлихт А., Нарыжный С. Протеом экзосом, секретируемых клетками глиобластомы, как источник биомаркеров заболевания СБОРНИК ТЕЗИСОВ ДОКЛАДОВ III ОБЪЕДИНЕННОГО НАУЧНОГО ФОРУМА ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ, том 2, стр. 228 (год публикации - 2021)

19. Байрамуков В.Ю., Букатин А.С., Камышинский Р.А., Бурдаков В.С., Пичкур Е.Б., Штам Т.А., Стародубцева М.Н. Nanomechanical characterization of exosomes and concomitant nanoparticles from blood plasma by PeakForce AFM in liquid Biochemica et Biophysica Acta (BBA), ELSEVIER, Biochemica et Biophysica Acta (BBA), 2022, Volume 1866, Issue 7, 130139 (год публикации - 2022)
10.1016/j.bbagen.2022.130139

20. Штам Т.А., Волницкий А.В., Гараева Л.А., Камышинский Р.А., Koпылов А.Т., Зорина Е.С., Байрамуков В.Ю., Спицына А.С., Шлихт А., Нарыжный С.Н. Анализ протеома экзосом, секретируемых клетками глиобластомы, для выявления биомаркеров заболевания Опухолевые маркеры: фундаментальные и клинические аспекты: материалы конференции (2-6 августа 2022 г)- Москва: Блок-Принт, материалы конференции, стр.138-140 (год публикации - 2022)

21. Пичкур Е.Б., Киль Ю.В., Сергеев В.Р., Коневега А.Л., Самыгина В.Р., Рычков Г.Н. Особенности третичной структуры и строения активного центра гипертермофильной бета-галактозидазы из археи Desulfurococcus amyloliticus. XXIX Российская конференция по электронной микроскопии «Современные методы электронной, зондовой микроскопии и комплементарных методов исследованиях наноструктур и наноматериалов» (29-31 августа 2022 г.) - Сборник тезисов, С. 212-213., Москва: ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, 2022. - 633 с. (год публикации - 2022)

22. Драчева К.В., Гараева Л.А., Камышинский Р.А., Ястремский Е.В., Побожева И.А., Анисимова К.А., Баландов С.Г., Хамид З.М., Василевский Д.И., Штам Т.А., Пчелина С.Н., Мирошникова В.В. Криоэлектронная микроскопия экстраклеточных везикул жировой ткани при ожирении НИЦ "Курчатовский институт"-ПИЯФ, Сборник тезисов VIII Всероссийского молодежного научного форума «Open Science 2021», с.245-246 (год публикации - 2021)

23. Самыгина В.Р., Пичкур Е.Б., Киль Ю.В., Сергеев В.Р., Рычков Г.Н. Крио-ЭМ или РСА? Стратегия структурных исследований ферментов на примере бета-галактозидазы. XXIX Российская конференция по электронной микроскопии «Современные методы электронной, зондовой микроскопии и комплементарных методов исследованиях наноструктур и наноматериалов» (29-31 августа 2022 г.) - Сборник тезисов, С. 77-78., Москва: ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, 2022. - 633 с. (год публикации - 2022)

24. Сорокин И.И., Пичкур Е.Б., Гараева Л.А., Штам Т.А., Коневега А.Л. Дмитриев С.Е. Айлантон, компонент препаратов восточной медицины, связывается с А-сайтом эукариотической рибосомы и ингибирует рост опухолевых клеток XXIX Российская конференция по электронной микроскопии «Современные методы электронной, зондовой микроскопии и комплементарных методов исследованиях наноструктур и наноматериалов» (29-31 августа 2022 г.) - Сборник тезисов, С. 111., Москва: ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, 2022. - 633 с. (год публикации - 2022)

25. Штам, Т.А., Гараева, Л.А., Путевич, Е.Д., Спицына, А.С., Емельянова, С.С., Киль, Ю.В., Коневега, А.Л. Возможности использования нановезикул растительного происхождения для доставки противоопухолевых лекарственных средств Материалы VIII Петербургского международного онкологического форума «Белые ночи • 2022», ВОПРОСЫ ОНКОЛОГИИ, 68(S3), 445-446. (год публикации - 2022)

26. Егоров В.В., Швецов А.В., Пичкур Е.Б., Шалджан А.А., Забродская Я.А., Виноградова Д.С., Некрасов П.А., Горшков А.Н., Гармай Ю.П., Ковалева А.А., Степанова Л.А., Цыбалова Л.М., Штам Т.А., Мясников А.Г., Коневега А.Л. Inside and outside of virus-like particles HBc and HBc/4M2e: a comprehensive study of the structure. Biophysical Chemistry, Elsevier, Biophysical Chemistry, Volume 293, 2023, 106943 (год публикации - 2023)
10.1016/j.bpc.2022.106943

27. Штам Т.А., Волницкий А.В., Гараева Л.А., Камышинский Р.А., Koпылов А.Т., Зорина Е.С., Байрамуков В.Ю., Спицына А.С., Шлихт А., Нарыжный С.Н. ПОИСК БИОМАРКЕРОВ ГЛИОБЛАСТОМЫ НА ОСНОВЕ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА СОСТАВА ЭКЗОСОМ, СЕКРЕТИРУЕМЫХ КЛЕТКАМИ ГЛИОМ IN VITRO Ежеквартальный научно-практический рецензируемый журнал "Успехи молекулярной онкологии", приложение, Успехи молекулярной онкологии, том 8, №4, приложение, стр.111-112 (год публикации - 2021)

28. Гараева Л.А., Емельянова С.С., Комарова Е.Ю., Путевич Е.Д., Спицына А.С., Штам Т.А. Растительные экзосомы – переносчики терапевтического экзогенного белка HSP70 в клетки человека Синтетическая биология и биофармацевтика. Материалы всероссийской конференции. – Новосибирск. ООО «Офсет-ТМ»., Синтетическая биология и биофармацевтика. Материалы всероссийской конференции. Новосибирск, ООО «Офсет-ТМ». 2022. — с.134 (год публикации - 2022)

29. Путевич Е.Д., Гараева Л.А., Ястремский Е.В., Камышинский Р.А., Ланда С.Б., Спицына А.С., Емельянова С.С., Коневега А.Л., Штам Т.А. ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НОСИТЕЛИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ Цитология, Санкт-Петербург, ЦИТОЛОГИЯ, том 64, № 7,МАТЕРИАЛЫ VIII МОЛОДЕЖНОЙ ШКОЛЫ-КОНФЕРЕНЦИИ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИЧЕСКИМ ТЕХНОЛОГИЯМ ИНСТИТУТА ЦИТОЛОГИИ РАН, с. 657 (год публикации - 2022)
10.31857/S004137712207001X

30. Килассония А., Гараева Л.А., Спицына А.С., Путевич Е.Д., Коневега А.Л. Штам Т.А Plant-derived vesicles as carries of exogenous functional biomolecule Ann Nutr Metab 2022;78(suppl 3):1-63, Online Book of conference materials: Ann Nutr Metab, № 78(suppl 3:1-63), September 2022, p.59, PC111 (год публикации - 2022)
10.1159/000526374

Публикации