Изучение иммуногенных свойств гибели опухолевых клеток глиомы человека для разработки противоопухолевой вакцины

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-75-10060

НазваниеИзучение иммуногенных свойств гибели опухолевых клеток глиомы человека для разработки противоопухолевой вакцины

Руководитель Турубанова Виктория Дмитриевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический Университет "СИРИУС" , Краснодарский край

Конкурс №98 - Конкурс 2024 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова иммуногенная клеточная смерть, иммунотерапия рака, иммуногенный апоптоз, некроптоз, ферроптоз, глиома, DAMPs, INF-I, CRT, HMGB1

Код ГРНТИ34.43.45

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Глиомы высокой степени злокачественности являются наиболее распространенными первичными опухолями головного мозга у взрослых со средней выживаемостью по разным данным от 4,9 до 13,5 месяцев (Navarria et al., 2022; Van Den Bent et al., 2020; Varela et al., 2023). Стандартом лечения является хирургическая резекция и лучевая терапия с адъювантным темозоломидом. Этот протокол остается неизменным с 2005 года, хотя лечение малоэффективно в контексте долгосрочной выживаемости. Существует необходимость разработки новых методов терапии глиом, которые значительно бы улучшили исход лечения. Иммунотерапия позволяет преодолеть супрессивное микроокружение глиомы. Было показано, что индукция иммуногенной клеточной смерти (ICD) не только убивает раковые клетки, но и приводит к активации противоопухолевого иммунитета через сигнальный механизм опасности, вызванный активацией молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPs). Таким образом клетки умирающие путем ICD, выступают как адъюванты, активируя иммунную систему, которая в свою очередь генерирует специфический противоопухолевый Т-клеточный иммунный ответ на антигенный состав опухоли (Galluzzi et al., 2017). За счет большой гетерогенности глиомы подходы иммунотерапии, основанные на ICD, крайне перспективны, поскольку позволяют запустить противоопухолевый иммунитет против целого спектра антигенов глиомы пациента. Фотодинамическая терапия (ФДТ) является клиническим вариантом лечения поверхностных или полостных опухолей. Стимуляция противоопухолевого иммунитета ФДТ способствует долгосрочному контролю заболевания и является основным преимуществом по сравнению с традиционными методами лечения, которые являются иммуносупрессивными (Donohoe et al., 2019). Индукция острого воспаления с помощью ФДТ привлекает иммунные клетки в обработанные области опухоли, а также они секретирует хемокины и гранулярные белки, чтобы стимулировать созревание и активацию дендритных клеток (Mroz et al. 2011), которые мигрируют в лимфатические узлы, активируя адаптивный иммунный ответ (Brackett and Gollnick, 2011). Это наблюдение привело к широким исследованиям механизмов фотодинамического воздействия при индукции иммуногенной клеточной смерти (Garg et al. 2016; Turubanova et al., 2019; Balalaeva et al., 2021; Turubanova et al., 2022). Терапевтический исход фотодинамической терапии сильно зависит от клеточных и молекулярных механизмов, вызванных окислительным повреждением и местом локализации действия АФК. Один и тот же фотосенсибилизатор может вызывать два механизма гибели клеток в зависимости от условий применения: как правило, высокое фотоповреждение вызывает некроз, а умеренные дозы воздействия приводят к регулируемым формам гибели клеток (например, апоптоз, некроптоз или ферроптоз)(Golstein and Kroemer, 2006; Galluzzi et al., 2017; Piette, 2015). Вакцины на основе дендритных клеток показали перспективность лечения глиомы в терапевтических условиях. Но несмотря на многообещающие результаты in vitro и in vivo, полученные на линиях глиомы мышей (Garg et al., 2016; Redkin et al., 2023), активация иммуногенной клеточной гибели мало изучена на первичных опухолевых клетках, в том числе нет убедительных исследований на клетках глиомы пациентов. В настоящем проекте мы предлагаем изучить иммуногенные свойства фотодинамически-погибающих клеток глиомы пациентов для оценки возможности использования их в создании пациент-специфичной вакцины. На первичных клеточных культурах глиомы пациентов будет проведен анализ накопления и распределения фотосенсибилизатора c уже изученными иммуногенными свойствами на линиях глиом мышей (Turubanova et al., 2022; Redkin et al., 2023). Будут подобраны условия фотоиндукции регулируемой клеточной смерти и будет определен тип гибели. Для подтверждения иммунентного потенциала клеточной смерти будет проведен анализ высвобождения DAMPs вследствие фотоповреждения, а также функциональное созревание дендритных клеток при взаимодействии с умирающими/мертвыми клетками глиомы.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На первом этапе исследования получены и описаны 5 первичных культур глиом человека (G17, G22, G33, G37, G52), выделенных из хирургического материала. Диагнозы соответствовали классификации WHO CNS5. Клетки культивировались в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и криоконсервировались не позднее 3-го пассажа для сохранения гетерогенности. Культуры демонстрировали различия в скорости пролиферации, морфологии и устойчивости к механическому и ферментативному воздействию, что потребовало индивидуальных протоколов культивирования. Микроскопический анализ выявил различия в морфологии: клетки G52 были наиболее вытянутыми, а G17 — наименьшими по размеру. Культуры G17, G22 и G52 оказались более устойчивы к центрифугированию, чем G33 и G37. Для диссоциации клеток G17, G22 и G52 эффективно применяли смесь версена и трипсина (3:1), тогда как G33 и G37 требовали чистого трипсина. Оптимальные интервалы пассажирования составили 4–5 дней для G17, G22 и G52, 7–9 дней для G33 и 14–16 дней для G37. Исследование динамики накопления тетра(арил)тетрацианопорфиразина с фторбензил-О-фенилом в качестве бокового заместителя (pz III) показало, что культура G22 достигала максимальной флуоресценции за 3 часа, тогда как G17 и G33 — за 4 часа. Клетки G37 и G52 демонстрировали резкое увеличение сигнала между 2–3 часами инкубации. Для всех культур 4-часовая инкубация обеспечивала достаточное накопление фотосенсибилизатора, что было принято за стандарт для последующих экспериментов. МТТ-анализ выявил темновую токсичность pz III при концентрациях ≥50 мкМ, тогда как низкие дозы (0,7–1,1 мкМ) стимулировали пролиферацию G22, G33 и G37. Фотодинамическое воздействие (20 Дж/см²) вызывало гибель ≥40% клеток G17 и G52 при 0,7 мкМ, а для G22, G33 и G37 пороговые концентрации составили >1,1 мкМ. Значения IC50 и IC80 варьировали в зависимости от типа глиомы. Проточная цитофлуориметрия с окрашиванием Annexin V-FITC и DAPI показала, что оптимальные концентрации pz III для индукции апоптоза составляли 1,9 мкМ (G17) и 2,1 мкМ (G22, G33, G37). При этом 94,2% клеток G17 и 91% G33 подвергались регулируемой гибели, тогда как в культуре G22 доля некротических клеток достигала 27,4%. Для G37 характерна высокая доля клеток на ранних стадиях апоптоза (13,2%). Установлено, что фотодинамическое воздействие с pz III преимущественно индуцирует регулируемую гибель клеток глиом. Полученные концентрации (1,9–2,1 мкМ) сопоставимы с данными для линии GL261, что открывает перспективы для сравнительного анализа иммуногенных свойств клеточной смерти in vitro.

Публикации

1. Редькин Т.С., Слепцова Е.Е., Хузина А.Р., Савюк М.О., Турубанова В.Д., Крысько Д.В. Дендритноклеточная вакцина, на базе фотоиндуцированных клеток глиомы GL261 – новый эффективный терапевтический агент против опухоли головного мозга Пущино: Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук», Пущино: Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук», 2024. – 291 с. – ISBN 978-5-605-06351-3. – EDN EJUQVJ (год публикации - 2024)

2. Слепцова Е.Е., Хузина А.Р., Пескова Н.Н., Редькин Т.С., Лермонтова С.А., Савюк М.О., Клапшина Л.Г., Балалаева И.В., Турубанова В.Д. Особенности внутриклеточной локализации фотоагента и типа клеточной гибели при использовании фотосенсибилизатора из группы тетра(арил)тетрацианопорфиразинов с 4-(4-фторбензиокси)фенилом в качестве бокового заместителя на первичных клеточных культурах глиомы Пущино: Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук», Пущино: Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук», 2024. – 291 с. – ISBN 978-5-605-06351-3. – EDN EJUQVJ (год публикации - 2024)

3. Турубанова В.Д., Савюк М.О., Слепцова Е.Е., Редькин Т.С., Хузина А.Р., Балалева И.В., Мищенко Т.А., Крысько Д.В. Иммуногенные свойства фотоиндуцированной клеточной смерти глиомы как основа дендритноклеточной вакцинации в животных моделях М.: Издательство «Медицина–Здоровье» , М.: Издательство «Медицина–Здоровье», 2025. – с. 81 (год публикации - 2025)

4. Хузина А.Р., Турубанова В.Д. «Beyond Fluorescence: FLIM Microscopy’s Cutting-Edge Insights in Cancer immunotherapy» («За пределами флуоресценции: передовые достижения ФЛИМ-микроскопии в иммунотерапии рака») Гены и Клетки (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2026 году
В ходе выполнения 2-го этапа проекта изучены последствия фотоиндуцированной гибели клеток глиом разных подтипов. Показана локализация pz III в клетках глиом. Паттерны распределения pz III различались: в глиобластомах (G17, G24) фотосенсибилизатор накапливался преимущественно в аппарате Гольджи и лизосомах; в астроцитомах (G22, G30) — в небольших количествах в ЭПР, в культуре G33 — равномерно в митохондриях и аппарате Гольджи; в олигодендроглиомах (G37, G55) — в ЭПР, аппарате Гольджи и лизосомах. Определены пути клеточной смерти. Ингибиторный анализ через 14 ч после ФДТ показал смешанный тип гибели с преобладанием ферроптоза, а также с участием апоптоза и некроптоза. Вклад ингибиторов апоптоза и ферроптоза был значим для G22, G55, G24; ингибиторов апоптоза и некроптоза — для G33 и G30. Гибель G37 ингибировалась только ферростатином-1, указывая на исключительный ферроптоз. Вклад ферроптоза подтверждён с использованием DFO и витамина Е. Оценён вклад различных типов АФК. В культурах G17, G33, G55 наблюдалась темновая токсичность pz III. ФДТ вызывала устойчивое увеличение флуоресценции DCFH-DA в течение 120 мин во всех культурах, кроме G55. Ключевым типом АФК во всех культурах был супероксид-анион; в G17, G22, G33, G37 значимый вклад вносил также синглетный кислород. Гидроксильный радикал обнаружен только в G22. Описаны изменения митохондрий. Конфокальная микроскопия астроцитомы G22 показала быструю фрагментацию тубулярной митохондриальной сети через 15 мин после ФДТ с образованием глобулярных кластеров, усиление фрагментации через 1 ч и наличие митохондрий в аутофагических везикулах через 3 ч. Цитометрически через 45 мин после ФДТ 45,4% клеток утратили J-агрегаты (снижение митохондриального потенциала), через 3 ч — 68,6%. Окислительно-восстановительное состояние клеток глиом оценивали по соотношению аутофлуоресценции НАД(Ф)Н/ФАД. В необработанных клетках регистрировали определённое базальное значение этого отношения. После 4-часовой инкубации с pz III в темноте параметр снижался, что указывает на начальный стресс дыхательной цепи. После ФДТ отношение увеличивалось через 15 мин, достигало пика через 45 мин, затем снижалось к 1,5 часам. Максимальные значения зафиксированы через 24 ч в полностью погибших клетках. Выраженная гиперредукция свидетельствует об ингибировании комплексов I/III дыхательной цепи, обратном потоке электронов через НАДН-дегидрогеназу и блокаде АТФ-синтазы, приводящих к энергетическому дефициту. Таким образом, при ФДТ-индуцированной гибели клеток наблюдается пролонгированный митохондриальный ответ: быстрая острая фаза (первые 45 мин) с деполяризацией мембраны и гиперпродукцией НАД(Ф)Н, за которой следует частичное восстановление отношения НАД(Ф)Н/ФАД на фоне устойчивой дисфункции митохондриального потенциала. Методом FLIM оценены метаболические изменения по времени жизни флуоресценции NAD(P)H. В контроле τm = 0,84 нс, через 4 ч после загрузки pz III τm снижалось до 0,60 нс. С 15 мин после ФДТ наблюдалось возрастание τm до максимума через 90 мин (1,05 нс), затем снижение, но остававшееся выше контроля через 3 и 24 ч. Проанализировано высвобождение DAMPs. Экспозиция CRT на живых клетках детектировалась через 3 ч после обработки pz III; в астроцитомах G22, G33 максимум через 0,5 ч после ФДТ; в глиобластомах G17, G24 — сразу после ФДТ с сохранением уровня до 3 ч. Экспозиция Hsp90 в астроцитомах и олигодендроглиомах возрастала через 0,5 ч после ФДТ с максимумом к 3 ч; в глиобластомах значимое увеличение наблюдалось сразу после ФДТ и сохранялось до 3 ч. Высвобождение АТФ в астроцитомах достигало максимума через 0,5 ч, продолжаясь до 3 ч; в олигодендроглиомах значимо возрастало сразу после ФДТ до 3 ч; в глиобластомах — через 1,5 ч с сохранением высокого уровня до 3 ч. Динамика высвобождения DAMPs варьировала в зависимости от подтипа глиомы, подтверждая гетерогенность иммуногенного потенциала фотоиндуцированной гибели. На 2-м этапе опубликована 1 обзорная статья (Q1), даны ответы на рецензию по экспериментальной статье (Q1), коллектив выступил с 5 устными и 2 постерными докладами, опубликовал 5 тезисов.

Публикации

1. Шилягина Н.Ю., Саннова Е.А, Турубанова В.Д. и Балалаева И.В. Photo- and Immunotherapy Interface: Can Dendritic Cell Vaccines Overcome the Limitations of PDT? Pharmaceutics , Pharmaceutics 18, no. 5: 588. (год публикации - 2026)
10.3390/pharmaceutics18050588

2. Н.А. Щелчкова, Л.М. Обухова ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ БИОМАРКЕРЫ У ПАЦИЕНТОВ С ГЛИОМАМИ РАЗНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ АЛЬТЕРАЦИЙ Тезисы Пятой международной конференции "VOLGA NEUROSCIENCE MEETING 2025", Нижний Новгород, 2025, Тезисы Пятой международной конференции "VOLGA NEUROSCIENCE MEETING 2025", Нижний Новгород, 2025, стр. 180-181 (год публикации - 2025)

3. Е.Е. Слепцова, К.А. Ачкасова, Т.С. Редькин, А.Р. Хузина, В.Д. Турубанова ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА ТЕТРА(АРИЛ)ТЕТРАЦИАНОПОРФИРАЗИНА НА ПЕРВИЧНОЙ ГЛИОМЕ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO Тезисы Пятой международной конференции "VOLGA NEUROSCIENCE MEETING 2025", Нижний Новгород, 2025, Тезисы Пятой международной конференции "VOLGA NEUROSCIENCE MEETING 2025", Нижний Новгород, 2025, стр. 50 (год публикации - 2025)

4. В.Д. Турубанова, Е.Е. Слепцова, К.А. Ачкасова, Т.С. Редькин, А.Р. Хузина, Л.Г. Клапшина, И.В. Балалева РАЗРАБОТКА ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ, ОСНОВАННЫХ НА ИНДУКЦИИ ИММУНОГЕННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОМ ЧЕЛОВЕКА Тезисы Пятой международной конференции "VOLGA NEUROSCIENCE MEETING 2025", Нижний Новгород, 2025, Тезисы Пятой международной конференции "VOLGA NEUROSCIENCE MEETING 2025", Нижний Новгород, 2025, стр. 50 (год публикации - 2025)

5. Слепцова Е.Е., Редькин Т.С., Хузина А.Р., Клапшина Л.Г., Балалаева И.В., Турубанова В.Д. ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ ГЛИОМЫ ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ИНДУКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕТРА(АРИЛ)ТЕТРАЦИАНОПОРФИРАЗИНОВ Всероссийская научно-практическая конференция "Экспериментальная медицина", посвященная 135-летию Института экспериментальной медицины: сборник тезисов докладов / под науч. ред. Абдурасуловой И.Н. – Санкт-Петербург: «Издательскополиграфический комплекс «Гангут», 2025; ИЭМ. – 346 с, Всероссийская научно-практическая конференция "Экспериментальная медицина", посвященная 135-летию Института экспериментальной медицины: сборник тезисов докладов / под науч. ред. Абдурасуловой И.Н. – Санкт-Петербург: «Издательскополиграфический комплекс «Гангут», 2025; ИЭМ. – 346 с (год публикации - 2025)

6. Слепцова Е.Е, Редькин Т.С., Хузина А.Р., Савюк М.О., Пескова Н.Н., Лермонтова С.А, Балалаева И.В., Клапшина Л.Г., Крысько Д.В., Турубанова В. Д. Photodynamically induced glioma cell death as a basis for antitumor immunotherapeutic strategy Future of Biomedicine 2025. IV international scientific conference, 16–22 September 2025 : abstract book. – Vladivostok : Publishing House of the Far Eastern Federal University, 2025. , Future of Biomedicine 2025. IV international scientific conference, 16–22 September 2025 : abstract book. – Vladivostok : Publishing House of the Far Eastern Federal University, 2025. (год публикации - 2025)
10.24866/7444-6012-9