Мукоадгезивные матрицы на основе морских полисахаридов для повышения эффективности противовирусных средств

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-20019-П

НазваниеМукоадгезивные матрицы на основе морских полисахаридов для повышения эффективности противовирусных средств

Руководитель Ермак Ирина Михайловна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук , Приморский край

Конкурс №5051 - Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Код ГРНТИ34.39.49

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Слизистые оболочки органов человека представляют собой первую линию защиты и являются входными воротами для инфекций. Ингибировать адсорбцию вируса на слизистую оболочку и доставлять лекарственное средство можно с помощью мукоадгезивных систем, интерес к которым обусловлен возрастающим распространением вирусов и их передачей воздушно-капельным путём через мукозальные ткани носа, рта, верхних дыхательных путей, слизистую оболочку конъюнктивы, половых органов. Морские полисахариды красных водорослей - каррагинаны (КН), благодаря безопасности их использования в пищевых и медицинских целях, вязкоупругим свойствам, простому механизму термообратимого гелеобразования и способности образовывать комплексы с поликатионом хитозаном, являются перспективными полимерами для получения различных форм трансмукозальных систем доставки лекарственных средств. Основная задача проекта заключается в разработке мукоадгезивных систем на основе каррагинанов и хитозанов в виде спреев, гидрогелей, губок, способных предотвратить адсорбцию вируса на слизистую оболочку, инактивировать вирусные частицы и усилить действие внесенного противовирусного средства. Выбор этих полисахаридов объясняется их собственной биологической активностью, в частности противовирусной, антибактериальной, иммуномодулирующей, проявление которых зависит от структурных особенностей полисахаридов. В рамках проекта 2021 г нами установлена ингибирующая активность КНов, их комплексов с хитозаном против широкого спектра вирусов, а также усиление ими фармакологического действия внесенных противовирусных субстанци. Показано, что КН взаимодействует с природным антиоксидантом эхинохромом (ЭХ), успешно применяемым в офтальмологии, и образует с ним стабильные комплексы КН/ЭХ, обладающие антивирусным, антибактериальным и противоспалительным действием. Каррагинан снижает лечебную дозу препарата Ацикловира® (АЦВ), за счет формирования с ним комплекса, повышающего устойчивость к инфицированию вирусом герпеса. Научная новизна продолжающегося проекта заключается не только в изучении фундаментальных закономерностей формирования мукоадгезивных систем на основе морских полисахаридов, но в разработке рационального с фармакологической точки зрения, удобного для приема антивирусного изделия, содержащего лекарственную субстанцию и обеспечивающего ее терапевтический эффект при минимуме побочного действия. Из полисахаридов будут выбраны каррагинаны и их комплексы с хитозаном, обладающие антивирусной активностью и определенными физико- химическим свойствами, полезными для создания медицинских спреев, губок, гелей. Использование физико-химических методов анализа (спектроскопии, динамического светорассеяния, электрокинетических измерений, вискозиметрии и реологии, микроскопии, рентгеноструктурного анализа, изотермического калориметрического титрования) даст представление о составе и стабильности полученных форм. Оценка эффективности мукоадгезивных систем будет исследована по их способности ингибировать развитие вирусной инфекции на экспериментальных животных (сирийские хомячки). Особое внимание будет уделено стандартизации каррагинанов, оценке их выхода и разработке методик для выделения структурных типов каррагинанов, необходимых для получения губок в полупромышленных масштабах на опытно-экспериментальном производстве ТИБОХ. Одна из основных практических задач заключается в разработке и утверждении Технических условий на каррагинан, как медицинское изделие, в качестве основы мукоадгезивных лекарственных форм. Полученные на основе каррагинана спреи с антивирусной активностью для полости рта и носоглотки, а также гидрогели и губки, для местного использования, обеспечат доступную форму индивидуальной защиты в период вирусных пандемий. Учитывая тот факт, что герпес на глазах, является частным случаем герпесвирусной инфекции, то совместное действие каррагинана и эхинохрома в составе разработанных капель или геля, может снизить риск развития ВПГ- конъюнктивита.

Ожидаемые результаты
Полученные в ходе проекта 2021 результаты свидетельствуют о высокой противовирусной активности выделенных из красных водорослей Дальневосточных морей каррагинанов и их способности усиливать ингибирующее действие субстанций, против ряда вирусов, что создает основу для дальнейшей практической реализации запланированной работы. Основной результат продолжающегося проекта заключается в разработке на основе морских полисахаридов рационального с фармакологической точки зрения, удобного для приема и хранения мукоадгезивного противирусного медицинского изделия в виде спрея, гидрогелевых мазей, пленок, губок, с включенными в них лекарственными субстанциями. Для разработки мукоадгезивных матриц, способных предотвращать адсорбцию вируса на слизистые оболочки организма, усиливать эффективность включённых в них противовирусных субстанций будут оптимизированы условия их получения, подобраны концентрации полисахаридов, определены соотношения полисахаридной матрицы и лекарственной субстанции, оценено влияние вспомогательных компонентов для создания мукоадгезивных медицинских изделий. На клеточных культурах будет оценена их биосовместимость и адгезия . На экспериментальных животных будут разработаны модели вирусной инфекции, отработаны способы введения и дозы испытуемых матриц и дана оценка их лечебной эффективности. Мукоадгезивные микробиоцидные лекарственные формы, созданные на основе полисахаридных матриц, могут быть использованы как в качестве профилактических средств - модификаторов биологического ответа организма на экзогенные и эндогенные воздействия, так и при острых и хронических заболеваниях. Создание на основе морских полисахаридов микробицидных мукоадгезивных систем может быть лучшей профилактической стратегией для одновременного предотвращения множественных вирусных и бактериальных инфекций. Важным результатом проекта должна быть разработка и утверждение Технических условий на каррагинан, как медицинское изделие, с целью его использования в качестве основы мукоадгезивных лекарственных форм. Особое внимание будет уделено стандартизации и выбору тех каррагинанов, которые не только являются наиболее удобной и эффективной матрицей для медицинского изделия, но и могут производиться в полупромышленных масштабах, в частности на опытно-экспериментальном производстве ТИБОХ ДВО РАН. Наличие современной приборной базы института, аналитического оборудования, опытно- экспериментального производства и Центра контроля качества биологически- активных добавок, созданного на базе института совместно с оператором Госсистемы маркировки «Честный знак», позволит проводить должный контроль качества выпускаемой продукции. Необходимость эффективного предотвращения передачи вирусных инфекций в обществе, и при этом достаточна низкая стоимость производства мукадгезивных систем российского производства на основе морских полисахаридов, полученных из экологически чистых морских источников, должны обеспечить наибольший экономический и социально-значимый эффект профилактических и лечебных мер. Новые знания, полученные в результате выполнения проекта, откроют перспективу для организации производств по переработке морского сырья, что будет также способствовать развитию отечественной биотехнологии и и импортозамещению - получению российских препаратов из отечественного сырья.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Из промысловых видов водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae, собранных в дальневосточных морях, выделены с высоким выходом (до 50%) полисахариды-каррагинаны (Σ-3КН), фракционированы на желирующие и нежелирующие фракции и уточнены их структуры. Согласно данным 13С- ЯМР –и ИК – спектроскопии и химического анализа желирующие фракции представляют собой каппа- каррагинаны (каппа-КН). Каппа-КН представляет определенный интерес в качестве полисахаридных матриц. Для получения чистого каппа-КН с максимальным выходом и сохранением показателей качества была проведена оптимизации схемы его получения. Из нескольких опробованных схем, выбрана наиболее экономичная, позволяющая минимизировать стадии процесса. Рассмотрены различные условия стерилизации каррагинанов и показано, что наиболее щадящим методом (не вызывающего деградацию полисахарида) является УФ обработка водных растворов каррагинанов в течение 4 ч, или автоклавирование полисахарида 15 мин и 105° С при давлении пара 2,2 кгс/cм. Подобраны условия приготовления назальных спреев на основе полученных образцов каррагинанов (Σ-3КН и его составляющих - каппа-КН и лямбда –КН и каппа/йота-КН), содержащих сорбат калия в качестве консерванта, и изучены их физико-химические характеристики. Показано влияние сорбата калия на заряд и полиисперсность полисахаридов и наибольшая устойчивость растворов лямбда-КН и Каппа/йота-КН в период их хранения в течение трех суток. Исследованы мукоадгезивные свойства растворов каррагинанов, предлагаемых в качестве основы назальных спреев, разными методами с использованием поверхности изолированной слизистой носа свиньи. Сравнительный анализ мукоадгезивных свойств методом потока растворов каррагинанов (Σ -3КН , каппа-КН, лямбда- КН и йота/каппа- КН), содержащих сорбат калия в качестве консерванта, выявил наименьшую адгезию к слизистой йота/каппа- КН и наибольшую Σ -3КН (до 80% удержания на слизистой). Применение второго способа определения мукоадгезивных свойств вещества с помощью текстурного анализатора EZTest, оказалось менее информативным. Высокая статистическая ошибка, полученная при расчётах, не позволяет говорить о корректности полученных результатов. Изучена in vitro антивирусная активность полученных каррагинанов, как основы назальных спреев, против вируса простого герпеса (ВПГ-1) и SARS-CoV-2. Исследуемые полисахариды обладают низкой цитотоксичностью и их ингибирующее действие изучено на разных стадиях развития ВПГ-1. Предварительная обработка вируса показала, что Σ-3КН проявляет значительно более высокую противовирусную активность, по сравнению с Каппа-КН. Его ингибирующая концентрация (IC50) в 4 раз ниже, чем у Каппа-КН, а значение терапевтического индекса SI в 4 раза выше. Однако, предобработка клеток (профилактическое действие) выявила более высокую активность Каппа-КН (SI равен 111), что в 3 раза больше, чем SI Σ-3КН. Лечебный препарат АЦ в этих случаях не проявлял никакой активности, но при обработке инфицированных клеток его эффект был существенно сильнее Каппа-КН и Σ-3КН. Для исследования противовирусной активности Σ-3КН и Каппа-КН в отношении SARS-CoV-2 и оценки их влияния на снижение вирусной нагрузки и цитокиновый статус инфицированных клеток разными штаммами вируса (геновариант Delta, геновариант Omicron) использовали как культуру клеток Vero E6, так и клетки A549 (клетки аденокарциномы лёгких человека) со сверхэкспрессией ангиотензин-превращающего фермента 2 (ACE2), который является рецептором вируса SARS-CoV-2. Влияние каррагинанов на ранние стадии жизненного цикла SARS-CoV-2 в культуре клеток Vero E6 изучали с помощью оценки уровня подавления цитопатогенного действия вируса и по снижению содержания РНК вируса SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Результаты по противовирусной активности Σ-3КН и Каппа-КН в отношении наиболее вирулентного штамма SARS-CoV-2 Delta в культуре клеток Vero E6 и А549/ACE2 показали, что оба каррагинана ингибируют репликацию вируса дозозависимым образом, но с разным эффектом. При предварительной обработке клеток Vero E6 веществами перед инфицированием большую защиту от коронавирусной инфекции проявляет Σ-3КН: его селективный индекс в 2 раза выше, чем у Каппа-КН. Однако больший эффект наблюдался при одновременной обработки клеток вирусом и полисахаридами, где наиболее выраженное подавление цитопатогенного действия вируса в культуре клеток Vero E6 показал тоже Σ-3КН. Результаты исследования анти-SARS-CoV-2 активности Σ-3КН и Каппа-КН, с использованием ОТ-ПЦР-РВ, также выявили наиболее выраженное снижение содержания вирусной РНК в обеих культурах клеток при их одновременной обработке каррагинанами и вирусом. При этом способе применения Σ-3КН значимо снижал содержание РНК SARS-CoV-2 в инфицированных клетках Vero E6 и А549/ACE2: коэффициент ингибирования репликации вируса (IC) составил 89,1% и 63,1%, соответственно, тогда как Каппа-КН был менее эффективен: IC 75,4% (для Vero E6) и IC 55,8% (для А549/ACE2). Профилактическое применение κаппа-КН и Σ-3КН было менее выраженным: коэффициенты ингибирования репликации вируса (IC) в инфицированных клетках Vero E6 и А549/ACE2 были в 1,3-1,5 раза ниже, чем при одновременном применении каррагинанов с вирусом. Сравнительный анализ динамики продукции провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNF-α) клетками А549/ACE2, инфицированными штаммами SARS-CoV-2 Delta и Omicron, выявил более высокий уровень индукции цитокинов штаммом Delta, по сравнению со штаммом Omicron. Оба каррагинана (Каппа-КН и Σ-3КН) оказывают дозозависимое ингибирующее действие на вирус-индуцированную продукцию провоспалительных цитокинов: IL-6 и TNF-α. При этом, Σ-3КН проявляет более высокую ингибирующую активность в отношении индукции обоих цитокинов по сравнению с Каппа-КН. Изучение адгезивности и цитотоксичности каппа-КН и Σ-3КН на культуре стволовых клеток слизистой оболочки губ (hLMSC) на базе ОИ, показало адгезию исследуемых каррагинанов, предложенных в качестве основы для спрея, к клеткам слизистой оболочки губ, а также отсутствие цитотоксичности исследуемых полисахаридов по отношению к этим клеткам. Для создания и утверждения Технических условий на каррагинан, как медицинское изделие, с учетом рационального использования морского сырья разработана Технологическая инструкция для получения на опытном производстве ТИБОХ каррагинана (Σ-3КН, обозначенного как Полимарин С) из водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae. Полученные результаты, описанные выше, свидетельствуют о перспективности использования в качестве основы назального спрея каррагинана (Σ-3КН), полученного по разработанной Технологической инструкции.

Публикации

1. Крылова Н.В., Кравченко А. О., Лихацкая Г.Н., Иунихина О.В., Глазунов В.П., Запорожец Т.С., Щелканов М.Ю, Ермак И. М. Carrageenans and the carrageenan-echinochrome complex as anti-SARS-CoV-2 agents International Journal of Molecular Sciences, № 26, Т 13, С. 6175 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26136175

2. Кравченко А.О., Крылова Н.В., Иунихина О.В., Анастасюк С.Д., Исаков В.В., Глазунов В.П., Володько А.В., Китан С.А., Щелканов М.Ю., Ермак И.М. Structure and properties of polysaccharides from tetrasporophytes of Mazzaella parksii International Journal of Biological Macromolecules, № 300, С. 140178 (год публикации - 2025)
10.1016/j.ijbiomac.2025.140178

3. Крылова Н.В., Майстровская О.С., Персиянова Е.В., Кравченко А.О., Глазунов В.П., Ермак И.М., Запорожец Т.С., Щелканов М.Ю. Антигерпетическая активность поли- и олигосахарида из Дальневосточной красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis (Gigartinales: Phyllophoraceae) Дальневосточный журнал инфекционной патологии, №51, С. 39-43 (год публикации - 2025)
DOI: 10.62963/2073-2899-2025-51-39-43

4. Крылова Н.В., Запорожец Т.С., Кравченко А.О., Майстровская О.С., Милованкин П.Г., Белов Ю.А., Крыжановский С.П., Ермак И.М., Щелканов М.Ю. Анти-SARS-COV-2 активность различных типов каррагинанов из красных водорослей (Rhodophyta) Дальневосточных морей Дальневосточный журнал инфекционной патологии, №50, С. 105-109 (год публикации - 2025)
10.62963/2073-2899-2025-50

5. Бахолдина С.И., Ермак И.М., Стенкова А.М., Глазунов В.П., Крылова Н.В., Соловьева Т.Ф. Каррагинаны из красных водорослей проявляют антивирусный эффект и предотвращают образование амилоидов белка Сборник тезисов VII Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология», Москва, 22–26 сентября 2025 г. / Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. – Москва, 2025, С. 72 (год публикации - 2025)

6. Кравченко А.О., Крылова Н.В., Глазунов В.П., Ермак И.М. Сульфатированные полисахариды из тетраспорофитов Mazzaella parksii как перспективные антивирусные агенты Сборник тезисов VII Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология», Москва, 22–26 сентября 2025 г. / Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. – Москва, 2025, С. 20 (год публикации - 2025)

7. Ермак И.М., Глазунов В.П., Крылова Н.В. Противовирусный и противовоспалительный потенциал морских полисахаридов: возможные пути его реализации Сборник тезисов VII Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология», Москва, 22–26 сентября 2025 г. / Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. – Москва, 2025, C. 16 (год публикации - 2025)