Стресс клеточной стенки у мицелиальных грибов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-24-00069

НазваниеСтресс клеточной стенки у мицелиальных грибов

Руководитель Терёшина Вера Михайловна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №102 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-102 - Ботаника

Ключевые слова мицелиальные грибы, стресс клеточной стенки, клеточная стенка, полисахариды, мембранные липиды, осмолиты

Код ГРНТИ34.27.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Ожидаемые результаты
Проект посвящен решению общебиологической проблемы адаптации организмов к стрессорным факторам. Конкретной задачей проекта является исследование роли осмолитной и мембранной систем клеток мицелиальных грибов в ответе на стресс клеточной стенки (СКС). СКС возникает при действии феромонов, мутаций, ДНК-повреждающих агентов, некоторых стрессоров и соединений, ингибирующих синтез полисахаридов клеточной стенки (КС). Для изучения ответа на СКС in vitro используют азокрасители конго красный (КК) и калькофлуор белый (КФБ), связывающиеся с хитином и глюканом КС и препятствующие образованию микрофибрилл, что приводит к ослаблению КС. Ответом на СКС является усиленный синтез хитина и α-глюкана. Ответ на СКС подробно изучался с позиций регуляции и изменений в клеточной стенке. На основании наших исследований ответов грибов на стрессорные воздействия и механизмов адаптации экстремофильных грибов мы выдвинули гипотезу об участии в ответе на СКС осмолитной и мембранной систем клетки. Мы полагаем, что в условиях СКС, когда нарушается опорная функция КС, стабилизация мембран может быть также компенсаторной реакцией. Для решения этой задачи будет исследован ответ на СКС, вызываемый КК и КФБ, на примере двух грибов — аскомицета Aspergillus niger (КС хитин-глюканового типа) и зигомицета Mucor flavus (КС хитин-хитозанового типа). Состояние мембранного аппарата клетки будет исследовано с помощью флуоресцентного метода. Мы ожидаем увидеть стимуляцию везикулярного транспорта в апикальную область, связанную с усиленным синтезом полисахаридов. Будет изучено влияние азокрасителей на состав полисахаридов КС, осмолитов и мембранных липидов. Для этого в глубинную культуру A. niger после появления ростковых трубок (8–10ч) будут добавлены установленные дозы КК и КФБ и культивирование будет продолжено еще 16 ч. Состав осмолитов и жирных кислот мембранных липидов будет исследован методом ГЖХ, количественный состав мембранных липидов — методом двумерной ТСХ с последующей денситометрией и обработкой данных компьютерной программой Dens. Будут выделены клеточные стенки после замораживания биомассы в жидком азоте и растирания, с последующей отмывкой цитоплазматического содержимого и лиофилизацией. Количество хитина и глюкана будет установлено биохимическими методами с контролем на ГЖХ. Мы ожидаем увидеть не только увеличение количества хитина и глюкана в составе КС, но и рост уровня трегалозы в клетке, и повышение доли фосфатидных кислот в составе мембранных липидов. На втором этапе исследований мы предлагаем выбрать в качестве объекта исследования мукоровый гриб M. flavus с хитин-хитозановым типом КС, что позволит выявить особенности ответа на СКС в зависимости от состава КС. Кроме того, ранее мы показали, что этот гриб является психротолерантом, использует трегалозную защиту от холода и имеет особый состав мембран, обогащенный небислойными фосфолипидами с ненасыщенными жирными кислотами. Поэтому большой интерес вызывает ответ на СКС у экстремофила, хорошо защищенного от действия экстремального фактора — холода. Мы предлагаем на примере этого гриба исследовать не только действие азокрасителей, но и теплового шока на состав полисахаридов КС, осмолитов и мембранных липидов, что позволит ответить на вопросы: (1) вызывают ли СКС тепловой шок и азокрасители (2) Возникают ли изменения в составе осмолитов и мембранных липидов в ответ на СКС (3) что происходит под действием комбинации азокрасителей и теплового шока. Мы ожидаем увидеть аддитивный эффект в составе осмолитов и повышение уровня хитина в ответ на действие азокрасителей, но не теплового шока. Полученные результаты помогут ответить на вопрос, участвует ли мембранная и осмолитная системы клетки в адаптации к СКС, что позволит глубже понимать биохимические основы стрессоустойчивости. Такие данные важны для развития биотехнологий, экологии и борьбы с патогенными грибами

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Цель проекта заключается в исследовании роли осмолитной и мембранной систем клетки в адаптации к стрессу клеточной стенки (СКС). В жизненном цикле грибов СКС возникает in vivo при действии половых феромонов, которые способствуют перестройкам в составе клеточной стенки, а также при действии некоторых стрессоров, например, окислительного воздействия, высокого или низкого значений pH, ДНК-повреждающих агентов, теплового и гипоосмотического шоков. Кроме того, СКС возникает под действием химических соединений, нарушающих синтез или сборку основных полисахаридов клеточной стенки — глюканов и хитина. Для создания СКС in vitro используют фунгицидные антибиотики, азокрасители Конго красный и калькофлуор белый, литические ферменты (зимолиаза), антибиотики, ингибирующие 1,3-β-D-глюкан синтазу (каспофунгин, микафунгин, анидулафунгин) или хитин синтазу (никкомицин), которые приводят к ослаблению клеточной стенки и лизису клеток грибов. В ответ на СКС активируется путь целостности клеточной стенки (Cell Wall Integrity pathway), что приводит к стимуляции синтеза хитина и глюкана. Однако, защитная система аспергиллов использует три фактора транскрипции — RlmA, MsnA и CrzA, — которые также способствуют адаптации к различным абиотическим стрессорам и влекут за собой изменения в составе осмолитов цитозоля и профилей мембранных липидов, роль которых в адаптации к СКС остается неясной. В данной работе для создания СКС у Aspergillus niger использовали азокрасители Конго красный и калькофлуор белый, которые вносили на 4 ч в 12 ч глубинную культуру, когда все споры проросли, но длинные ростковые трубки еще не начали ветвиться. Конго красный вызывал практически полную остановку апикального роста и возникновение множества ампуловидных расширений в гифах, тогда как действие калькофлуора белого приводило только к торможению роста, а расширений было значительно меньше. При этом под действием азокрасителей в составе клеточных стенок гриба увеличивалось содержание хитина (на 33%) и глюкана (на 11-17%). Количество осмолитов в клетках на стадии прорастания очень мало и не превышало 1% от сухой биомассы. В составе осмолитов, которые представлены в контрольном образце преимущественно глицерином и маннитом, при СКС уровень глицерина существенно снижался, что увеличивало долю маннита. В контроле основным мембранным фосфолипидом являются фосфатидные кислоты, составляющие около 55% от суммы, тогда как характерные для грибов фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины составляли лишь 15 и 8% от суммы, соответственно. Ни состав, ни количество мембранных и запасных липидов не изменялось в условиях СКС. Однако в при СКС заметно увеличивалась степень ненасыщенности фосфолипидов за счёт более высокой доли линоленовой кислоты С18:3, что указывает на повышение текучести мембран. Полученные результаты показывают, что адаптация к СКС, вызванному действием Конго красного и калькофлуора белого, сопровождается морфологическими изменениями и повышением количества хитина и глюкана в клеточных стенках, но небольшие перестройки в составе жирных кислот фосфолипидов и осмолитов не носят адаптивного характера. Постоянство состава мембранных липидов и отсутствие значимого увеличения количества осмолитов не подтверждают их участия в адаптации к СКС, вызванному Конго красным и калькофлуором белым, вопреки предыдущим предположениям, основанным на исследованиях путей обеспечения целостности клеточной стенки. Результаты, полученные в данном исследовании, не исключают возможности того, что другие стрессоры, вызывающие СКС, могут влиять на мембранную и осмолитную системы. Мы планируем продолжить изучение этого вопроса двумя способами: используя ингибиторы синтеза хитина и глюкана для индукции СКС и определяя, вызывают ли СКС такие абиотические стрессоры, как тепловой и осмотический шок. https://www.mdpi.com/1422-0067/26/22/10888

Публикации

1. Януцевич Е.А., Данилова О.А., Сахарова С.А., Терёшина В.М. Membrane Lipids and Osmolytes Rearrangements Under Cell Wall Stress in Aspergillus niger N/A, SWITZERLAND, Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 10888. https://doi.org/10.3390/ijms262210888 (год публикации - 2025)
262210888

2. Терёшина В. М. , Януцевич Е. А., Данилова О. А., Сахарова С. А. Роль мембранных липидов и осмолитов в адаптации к стрессу клеточной стенки у Aspergillus niger Волгоград : Библиотечно- издательский центр ВолгГМУ, 5-й Российский микробиологический конгресс : сборник тезисов докладов ; Волгоград, 29 сентября – 3 октября 2025 г. / под ред. Д. А. Бабкова. – Волгоград : Библиотечно- издательский центр ВолгГМУ, 2025. – С. 96-97 . (год публикации - 2025)