Селекция факторов трансляции прокариотической рибосомой

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-14-00253

НазваниеСелекция факторов трансляции прокариотической рибосомой

Руководитель Полесскова Елена Вячеславовна, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" , Ленинградская обл

Конкурс №104 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова рибосома, трансляция, антибиотики, биосинтез белка, криоэлектронная микроскопия

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Пандемия новой коронавирусной инфекции продемонстрировала всему миру крайне уязвимые позиции человечества в случае лавинообразного распространения вирусной инфекции. Несмотря на то, что в середине прошлого века наша цивилизация вступила в «эру антибиотиков», непрерывное возникновение и распространение патогенных бактериальных штаммов, устойчивых к применяемым антибиотикам, сигнализирует о нарастающей опасности возникновения бактериальных инфекций, перед которыми современная медицина будет бессильна. В связи с этим крайне актуальной выглядит необходимость расширения спектра эффективных терапевтических препаратов, что требует объединенных усилий в области фундаментальных исследований и практической реализации в фармацевтической индустрии. Наиболее перспективным направлением нам представляется детальное структурное и функциональное изучение комплексов известных антибиотиков с их мишенями с целью определения детального молекулярного механизма действия и последующей рациональной направленной модификации ингибиторов для улучшения их характеристик связывания и преодоления бактериальной резистентности, а также рациональное создание новых молекул, обладающих антибактериальными свойствами. Поскольку примерно половина применяемых на сегодняшний день антибиотиков нарушают работу бактериального аппарата трансляции, обоснованным является пристальное внимание именно к ингибиторам бактериальной рибосомы. При этом всестороннее изучение комплекса рибосома-ингибитор далеко выходит за рамки исключительно практической значимости. Несмотря на десятилетия изучения, многие аспекты функционирования рибосомы и ее лигандов (матричной и транспортных РНК, факторов трансляции) остаются невыясненными до конца и использование блокаторов определенных реакций трансляции является удобным инструментом для получения промежуточных комплексов и их последующего анализа. В данном проекте планируется использование комбинации современных функциональных и структурных методов (кинетические методы остановленного и погашенного потоков, микротермофореза, дифференциальной сканирующей флуориметрии, интерференции в тонких пленках, анализа размера и концентрации наночастиц, методы криогенной электронной микроскопии, молекулярного моделирования и молекулярной динамики) для определения особенностей взаимодействия бактериальной рибосомы с разными типами ингибиторов. Наряду с каноническими антибиотиками – малыми молекулами, в данном проекте будет уделено особое внимание природным и искусственно созданным пептидным антибиотикам, перспективность изучения и использования которых обусловлена их способностью обходить механизмы резистентности, отсутствием токсичности, простотой синтеза и высокой скоростью действия. В рамках данного проекта планируется разработка пептидного ингибитора одной из наиболее загадочных областей рибосомы, которая до сих пор так и не была визуализирована вследствие своей подвижности – рибосомного стебля L12. Таким образом, проект будет способствовать получению фундаментальных знаний о функционировании прокариотической рибосомы и может создать задел для создания эффективных противобактериальных терапевтических средств.

Ожидаемые результаты
Мы ожидаем получение новых результатов по двум основным направлениям: (1) изучение процесса взаимодействия факторов трансляции с рибосомным стеблем L12, их последующей активации и доставки к транслирующей рибосоме, (2) изучение молекулярного механизма действия нескольких типов ингибиторов биосинтеза белка. При этом ожидаемые результаты второго направления, являясь востребованными самостоятельно для области разработки и оптимизации антибиотиков, будут также способствовать более глубокому пониманию фундаментальных процессов функционирования бактериального аппарата трансляции, то есть получению результатов по первому направлению. Несмотря на принципиальную важность рибосомного стебля L12 в селекции, доставке и активации факторов трансляции, детальный механизм его функционирования, как и его структурные особенности остаются невыясненными до конца (1). В данной работе будет охарактеризована термодинамика и кинетика взаимодействия рибосомного стебля L12 с белковыми факторами (EF-Tu, EF-G, IF2), различающимися по функции и механизму активации ГТФазы. В рамках данной работы планируется создание как минимум одной пептидной молекулы, которая будет эффективно ингибировать работу рибосомного стебля L12, что может дать старт разработке нового типа ингибиторов рибосомы, а также позволит продвинуться в изучении механизма доставки факторов трансляции к рибосоме. Поскольку для активации ГТФазы EF-Tu необходимо не только взаимодействие с рибосомным стеблем L12, но также и корректное кодон-антикодоновое взаимодействие доставляемой тРНК с кодоном мРНК в А-сайте рибосомы (2, 3), будет осуществлено детальное структурное и функциональное изучение ингибирования бактериальной рибосомы при помощи малых молекул, взаимодействующих с рибосомой в области центра декодирования. Для этого будут использоваться как стандартные антибиотики аминогликозидового ряда (апрамицин, торбрамицин), так и их модификации. Несмотря на широкую изученность, аминогликозиды переживают ренессанс, который связан с постоянным синтезом новых представителей этого класса, обладающих рядом преимуществ по сравнению с предшественниками, например, могут преодолевать возникшую бактериальную резистентность. Также мы планируем использовать новый антибиотик, выделенный из культуральной жидкости Actinoplanes sp. 49252, вещество 49252, механизм действия которого неизвестен на данный момент, однако предположительно он направлен на нарушение декодирования. Мы планируем продолжить изучение взаимодействия румицидинов (недавно открытый новый класс пролин-богатых пептидов с антибактериальными свойствами) с функциональным рибосомным комплексом для выяснения их молекулярного механизма ингибирования. Ранее нами было показано, что румицидины проникают в выходной канал рибосомы и подавляют трансляцию (4). Модификация длины, а также последовательности пептидов указывает на критически важные области пептида, позволяя продолжить работу по выяснению детального механизма ингибирования с использованием ряда функциональных тестов и криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ). Таким образом, в результате выполнения проекта мы ожидаем получение новых фундаментальных знаний относительно функционирования рибосомы на этапе селекции трансляционных факторов и их доставки к рибосоме. Ожидаемые результаты обладают высокой значимостью для мирового научного сообщества, что подтверждается большим количеством высокорейтинговых публикаций, несмотря на десятилетия изучения аппарата биосинтеза белка (5-8). Совершенствование методов (например, создание новых детекторов для крио-ЭМ или использование новых методов микротермофореза и интерференции в тонких пленках), разработка расходных материалов (например, появление стабильных флуорофоров в различных диапазонах спектра) позволяет подняться на новый уровень изучения трансляции и разобраться в деталях крайне сложно организованного процесса. Практическая значимость ожидаемых результатов заключается в том, что информация, полученная для системы, блокированной ингибитором-антибиотиком, позволит выявить детальный молекулярный механизм действия антибиотиков разных типов и даст информацию для направленной модификации ингибиторов и разработки новых антибактериальных препаратов, что является крайне актуальной задачей. Более того, в рамках данной работы будет изучен механизм действия нового антибиотика 49252 и будет предпринята попытка создания нового пептидного ингибитора рибосомного стебля L12.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Румицидины (Rum) – новый класс пролин-богатых антимикробных пептидов, синтезируемых некоторыми видами жвачных и обладающих ярко выраженной антибактериальной активностью (Panteleev, 2024). Несмотря на то, что для всех ранее охарактеризованных ПБП была показана принципиальная значимость N-концевых остатков для проявления их антибактериальной активности, удаление первых 8 аминокислотных остатков румицидинов не приводило к существенному снижению их ингибиторной активности, указывая на возможное существование альтернативного механизма ингибирования трансляции. В ходе реализации данного Проекта было убедительно показано, что N-концевые остатки румицидинов играют важную роль в ингибировании биосинтеза белка, препятствуя связыванию и аккомодации А-сайтовой тРНК и полностью предотвращая прохождение пептидилтрансферазной реакции, скорее всего за счёт формирования заякоревающей петли в области А-сайта, стерически препятствующей протеканию А-сайтовых реакций. В ходе изучения механизма действия антибиотика боттромицина А2 было показано, что данный антибиотик приводит к невозможности прохождения пептидилтрансферазной реакции в случае доставки глициновой тРНК в А-сайт рибосомы, но не препятствует реакции транспептидации в случае валиновой или фенилаланиновой тРНК. Оказалось, что BotA2 не ингибирует пептидилтрансферазную реакцию как таковую, а нарушает предшествующий этап доставки глицинового остатка в ПТЦ. На основании наших данных можно предположить, что боттромицин связывается не с рибосомой, а с элонгационным фактором EF-Tu в области аминокислотного кармана, причём только в случае расположения в кармане самой маленькой аминокислоты, глицина. Все остальные аминокислоты занимают больше места в аминокислотном кармане EF-Tu, что, скорее всего, препятствует связыванию антибиотика с элонгационным фактором. Подобное взаимодействие антибиотика с аминокислотой и EF-Tu приводит к тому, что тРНК остаётся в изогнутой конформации (состояние A/T) с антикодоном, связанным с мРНК, и акцепторным стеблем, взаимодействующим с EF-Tu, что приводит к блокировке тройного комплекса на рибосоме вследствие невозможности высвобождения акцепторного конца тРНК и его последующей аккомодации в А-сайте.

Публикации

1. И.А. Волынкина, А.А. Грачев, А.Д. Ливенский, Д.К. Ягода, П.С. Касацкий, О.А. Толичева, Е.С. Комарова, А.Е. Тупикин, В.А. Алферова, А.О. Каракчиева, А.А. Никандрова, М.В. Бирюков, Ю.В. Закалюкина, Л.В. Дорофеева, Ю.А. Ихалайнен, И.А. Родин, Д.А. Лукьянов, М.Р. Кабилов, Е.В. Полесскова, А.Л. Коневега, П.В. Сергиев, О.А. Донцова УНИКАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ГЛИЦИН-СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИНГИБИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСЛЯЦИИ АНТИБИОТИКОМ БОТТРОМИЦИНОМ А2 Биохимия, том 90, вып. 11, с. 1727 – 1753 (год публикации - 2025)
10.7868/S3034529425110123

2. Шуленина О.В., Толстыко Е.А., Коневега А.Л., Полесскова Е.В. НОВЫЕ АСПЕКТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА ПРОЛИН-БОГАТЫМИ АНТИМИКРОБНЫМИ ПЕПТИДАМИ Биохимия, том 90, вып. 11, с. 1638 – 1656 (год публикации - 2025)
10.7868/S3034529425110078