Регуляция процессов обновления клеток в организме, фундаментальной основы длительного сохранения функциональной активности органов и тканей, здоровья и активного долголетия человека

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-75-30005

НазваниеРегуляция процессов обновления клеток в организме, фундаментальной основы длительного сохранения функциональной активности органов и тканей, здоровья и активного долголетия человека

Руководитель Воронцова Мария Владимировна, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №107 - Конкурс 2025 года по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-405 - Регенеративная медицина

Ключевые слова Регенерация костной ткани; остеогенная дифференцировка; функционализированные матриксы; остеобласты; ожирение; метаболический синдром; адипогенная дифференцировка; мезенхимные стромальные клетки; секретом

Код ГРНТИ76.03.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Дисфункция соединительных тканей лежит в основе патогенеза социально-значимых заболеваний, включая ожирение, сахарный диабет 2 типа, метаболический синдром и остеопороз. Согласно современным представлениям, дисфункция ткани обусловлена, прежде всего, нарушением ее обновления. Определяющую роль в процессе обновления стромальных тканей и их адаптации играют постнатальные мезенхимные стволовые клетки (МСК). Полученные нами ранее результаты и данные литературы свидетельствуют о том, что активность МСК находится под строгим нейрогуморальным контролем. Целью проекта является выяснение механизмов влияния гомеостатических гормонов на функциональную активность МСК. Результаты проекта позволят раскрыть новые механизмы регуляции обновления и репарации тканей человека, понять механизмы и процессы, определяющие чувствительность стволовых клеток к гормонам и нейромедиаторам, а также выяснить роль переключения каскадов внутриклеточной сигнализации и паракринной активности клеток в этих событиях. Такое выяснение механизмов нейроэндокринной регуляции стволовых клеток имеет важное значение для разработки новых подходов к лечению социально значимых заболеваний. В результате выполнения проекта впервые будут получены данные относительно регуляторных взаимодействий между различными функциональными субпопуляциями в составе стромальных тканей на примере жировой ткани и надкостницы, с помощью комбинации подходов транскриптомного анализа одиночных клеток и протеома различных регуляторных субпопуляций. Ранее такой анализ стромальных тканей не проводили. В частности, будут получены результаты, описывающие сеть регуляторных взаимодействий в стромальных стволовых клетках. Данная схема будет востребована в исследованиях, направленных на поиск ключевых точек регуляции функциональной активности МСК, которые могут являться мишенями для разработки новых терапевтических подходов к лечению заболеваний, связанных с дисфункцией стромальных тканей. Кроме этого, понимание структуры регуляторных механизмов является крайне перспективным для решения задач биоинженерии и создания функционализированных биомедицинских конструкций, способных направленно влиять на процессы обновления и восстановления ткани.

Ожидаемые результаты
В данном проекте будут получены новые, актуальные результаты, раскрывающие механизмы регуляции обновления и репарации тканей человека. Планируемые результаты чрезвычайно важны как для фундаментальной науки, так и для разработки методов и подходов регенеративной медицины. В результате выполнения проекта будет создана модель сети регуляторных взаимодействий в стволовых клетках стромы, которая позволит выявить новые молекулярные мишени и будет способствовать разработке новых технологий и терапевтических подходов для стимуляции регенерации тканей и органов. Будут разработаны новые экспериментальные клеточные модели для изучения процессов обновления и репарации тканей, в том числе с помощью методов редактирования генома. Так, результаты проекта позволят понять механизмы и процессы, определяющие чувствительность стволовых клеток к гормонам и нейромедиаторам, включая инсулин, паратгормон, норадреналин и серотонин, выяснить роль переключения каскадов внутриклеточной сигнализации и паракринной активности клеток в этих событиях. Такое выяснение механизмов нейроэндокринной регуляции стволовых клеток может иметь важное значение для разработки новых подходов к диагностике и лечению социально значимых заболеваний, включая сахарный диабет, а также модификации существующих подходов в лечении системных заболеваний предусматривающих использование блокаторов рецепторов. В данном проекте будет проанализировано влияние гомеостатических гормонов на приобретение МСК инициированного состояния, необходимого для дальнейшего выбора направления дифференцировки. Таким образом, в случае МСК, выход стволовой клетки из ниши - это изменение функционального состояния клетки с приобретением чувствительности к гормонам-регуляторам. В рамках данного проекта будут также установлены механизмы паракринной регуляции обновления стромальных тканей регуляторными субпопуляциями МСК, чувствительными к системным гормональным сигналам (INSR+ субпопуляция), и к действию нейромедиаторов симпатической нервной системы (β3 adrenoceptor+ субпопуляция). Для этого нами будет проанализирована способность регуляторных субпопуляций МСК (INSR+ и β3-adrenoceptor+, а также клеток, восприимчивых к ПТГ) контролировать обновление стромальных тканей посредством продукции паракринных стимулов. Будет оценен потенциал регуляторных субпопуляций к влиянию на дифференцировку стволовых клеток, а также на их эпигенетический статус в экспериментальной модели неконтактного сокультивирования, а также in vivo. При этом в рамках проекта этого будет произведен анализ субпопуляционного состава как стволовых, так и терминально дифференцированных клеток стромальных тканей. В частности, будут установлены нейро-эндокринные регуляторные механизмы, определяющие формирование клеточной гетерогенности при дифференцировке стволовых клеток. Для установления молекулярных механизмов, лежащих в основе способности регуляторных популяций МСК контролировать процессы обновления стромальных тканей, мы произведем протеомный анализ внутриклеточных и секретируемых ими белков. На основании полученных результатов будет созданы новые высокотехнологичные медицинские препараты для лечения переломов и коррекции дисфункции жировой ткани. В частности, мы разработаем технологию функционализации биоинженерных конструкций, используемых в настоящее время для восстановления стромальных тканей. Планируемые результаты будут получены с помощью современных методов и подходов, обеспечивающих получение достоверных результатов, которые будут востребованы учеными, работающими в области регенеративной медицины. Помимо этого, наш коллектив обладает богатым опытом практических и трансляционных исследований (в том числе доклинической оценки безопасности и эффективности генотерапевтических и клеточных продуктов), а также патентования получаемых результатов. На основании полученных данных будут обновлены специализированные образовательные программы в рамках курса магистратуры “Регенеративная биомедицина”.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На первом этапе проекта мы протестировали гипотезу о том, что дифференцировку МСК предваряет приобретение этими клетками особого состояния “инициации”, в котором они совершают дальнейшее коммитирование в том или ином направлении дифференцировки. Мы обнаружили, что при стимуляции часть МСК сохранялась в исходном (базальном) состоянии. В клетках этого кластера повышена экспрессия генов, связанных с окислительным фосфорилированием и синтезом АТФ, а также кодирующих рибосомальные белки, что указывает на их высокую синтетическую активность и активный аэробный метаболизм. В каждой из интегрированных пар массивов выявлялись кластеры, характерные для соответствующего направления дифференцировки. С помощью анализ “траекторий развития” мы впервые обнаружили, что во всех трех парах массивов присутствовал кластер, в который клетки переходили из базального состояния, и в котором происходило дальнейшее разветвление траекторий дифференцировки. Мы установили что кластер клеток в инициированном состоянии совпадал у всех трех пар массивов. Таким образом, в каждом из проанализированных направлений дифференцировки происходит формирование кластера, в который МСК переходят из базального состояния, и именно в этом кластере происходит разделение дальнейших траекторий развития, что подтверждает нашу гипотезу. Для выявления инициированного состояния МСК in vivo мы отработали методику локальной симпатической денервации одного из парных жировых депо мыши. Наилучшие результаты показало локальное введение гуанетидина в одно из парных эпидидимальных жировых депо после вскрытия брюшной полости. У этих животных в контрольных депо выявлялись симпатические волокна, а в депо, куда вводили гуанетидин, в ткани окрашивались лишь отдельные точки, не выстроенные в цельные волокна. На данном этапе выполнения проекта мы проанализировали влияние таких цАМФ-мобилизующих гормонов, как норадреналин, серотонин или ПТГ, на повышение уровня внутриклеточного Ca2+ в МСК жировой ткани под влиянием аденозина, норадреналина, серотонина, дофамина, гистамина, ангиотензина II, ПТГ, ГАМК и глутамат (Ca-мобилизующий сигнал). Норадреналин вызывал повышение доли клеток, отвечающих повышением концентрации Са2+ в цитоплазме на аденозин, ПТГ и ангиотензин II. ПТГ приводил к увеличению доли клеток, отвечающих повышением концентрации Са2+ в цитоплазме, на аденозин, ГАМК и ПТГ. Серотонин вызывал увеличение доли МСК, отвечающих повышением концентрации Са2+ в цитоплазме на норадреналин и ПТГ. Последовательная стимуляция МСК норадреналином и затем ангиотензином II, вызывала повышение экспрессии мРНК адипонектина. Преинкубация МСК с норадреналином с последующей обработкой клеток аденозином, напротив, привела к снижению экспрессии маркеров адипогенной дифференцировки. Последовательная стимуляция МСК норадреналином и затем ПТГ, не влияла на экспрессию мРНК адипонектина. Для повышения точности и воспроизводимости количественного анализа результатов адипогенной дифференцировки нами был разработан алгоритм подсчета доли клеток с липидными каплями с применением моделей глубокого обучения. Разработанные алгоритмы обеспечивают эффективный и воспроизводимый анализ адипогенной дифференцировки МСК, в том числе прижизненный. Мы впервые в России разработали собственные подходы по аннотации клеточных типов в образцах scRNAseq с применением искусственного интеллекта. Мы использовали архитектуру трансформер (pytorch-tabnet) для создания собственного инструмента – scAdam. При помощи пакетов scanpy, anndata, pytorch, pandas, numpy и scipy мы адаптировали tabnet для работы с форматом anndata, характерным для датасетов scRNA-seq в языке программирования Python. Мы сравнили инструмент scAdam c 7 другими методами автоматической аннотации клеточных типов: CellTypist, scGPT, TOSICA, Azimuth, Symphony, Scanvi и Seurat на 4 массивах данных и установили, что модели scAdam превосходят другие методы автоматической аннотации по сбалансированной точности. Используя разработанные подходы мы выявили семь функционально различных подтипов зрелых адипоцитов (N = 24056 клеток) в массивах данных транскриптомов одиночных ядер клеток подкожной жировой ткани, названные scAd1-7 (subcutaneous Adipocyte). Эти данные существенно расширяют существующие представления о физиологии жировой ткани. Вклад выявленных подтипов в функционирование жировой ткани, а также сигналы, регулирующие их формирование, будут исследованы в дальнейшем. На данном этапе проекта мы впервые обнаружили, что в МСК из надкостницы по сравнению с МСК жировой ткани выше уровень экспрессии проостеогенных SATB2, HOXA10, RUNX2 и CREB5. При этом в МСК жировой ткани выше уровень экспрессии антиостеогенного траскрипционного фактора TWIST2. При воздействии ПТГ на МСК из надкостницы происходит повышение экспрессии регуляторов остеогенеза RUNX2, SATB2, KAT6A, CREB1, SATB2 и KAT6B. Воздействие ПГТ на МСК жировой ткани приводит к снижению экспрессии как активаторов (WWTR1, SMAD1), так и ингибиторов остеогенеза (TWIST2). Мы показали, что контрольные МСК жировой ткани и надкостницы существенно различаются по активности ингибиторов остеогенеза (STAT1 и TWIST2). При воздействии ПТГ на МСК жировой ткани повышается активность проостеогенного DLX3 и падает активность активатора остеогенеза SMAD5. ПТГ в МСК жировой ткани снижает активность ингибиторов остеогенеза (STAT1 и TWIST2). При этом ПТГ не влияет на активность транскрипционных регуляторов остеогенеза на МСК надкостницы. На модели неконтактного сокультивирования мы показали, что МСК, предварительно обработанные ПТГ стимулируют остеогенную дифференцировку МСК, которым не добавляли этот гормон. Для дальнейших исследований влияния секретома МСК на остеогенез in vivo, нами было протестирована кинетика набухания и высвобождения секретома МСК гидрогелей, напечатанных в виде стандартной сетки 1×1 см из образцов с концентрацией коллагена 2%, 4% и 7%. Мы установили, что в качестве носителя секретома оптимальной является комбинация 4% концентрации коллагена и низкотемпературная заморозка, что позволяет сохранить макроструктуру и контролируемое набухание. Протестированные гидрогели не влияли на морфологию и жизнеспособность культивируемых фибробластов человека. Таким образом, все задачи первого этапа проекта были решены.

Публикации

1. А.Д. Бондарев, П.А. Тюрин-Кузьмин Транскриптомика на уровне одиночных клеток в изучении функциональной гетерогенности жировой ткани: Насколько сопоставимы животные модели и человек? ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 16: БИОЛОГИЯ, Т. 80, № 4. С. 277–283. (год публикации - 2025)
10.55959/MSU0137-0952-16-80-4-2

2. Д.В. Иващенко, В.А. Мангушева, В.Ю. Сысоева, Р.Ю. Еремичев, Т.В. Никитина, Л.Н. Щербакова, П.И. Макаревич, Е.С. Младова, Н.И. Калинина, О.Б. Панина Пролиферативная активность и экспрессия эстрогеновых рецепторов в мезенхимальных стромальных клетках эндометрия у пациенток с повторными неудачами имплантации АРХИВ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ ИМ. В.Ф. СНЕГИРЕВА (год публикации - 2026)

3. Бондарев А., Кулебякин К., Гусев Н., Тюрин-Кузьмин П. Canonical and Non-Canonical Mechanisms of Insulin-Dependent Signaling Regulating Adipogenic Differentiation in Adipose Tissue Renewal BIOCHEMISTRY (MOSCOW), том 91 (год публикации - 2026)
10.1134/S0006297925603727

4. В. А. Усачёв, М. В. Щебетина, K. Ю. Смажило, М. А. Кулебякина, О. И. Клычников, Е. Бахчинян, Н. С. Волошин, М. А. Замотина, П. А. Тюрин-Кузьмин, М. В. Воронцова, К. Ю. Кулебякин ИНДУКТОР БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПОДАВЛЯЕТ ОСТЕОГЕННУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Онтогенез (год публикации - 2025)

5. В.А. Мангушева, Д.В. Иващенко, Н.И. Калинина, Л.Н. Щербакова, П.И. Макаревич, В.Ю.Сысоева Дифференцировочные особенности культивируемых мезенхимных стромальных клеток эндометрия Технологии живых систем (год публикации - 2026)

6. Смажило К.Ю., Усачев В.А., Кулебякина М.А., Щебетина М.В., Чечехина Е.С., Бахчинян Е., Клычников О.И., Воронцова М.В., Кулебякин К.Ю. Измененная чувствительность к гомеостатическому регулятору обновления костной ткани у иммортализованных мезенхимных стромальных клеток Технологии живых систем (год публикации - 2026)