Разработка рекомбинантных штаммов онколитических вирусов, экспрессирующих биотерапевтические комплексы для ингибирования новообразования сосудов в солидных опухолях

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-74-10102

НазваниеРазработка рекомбинантных штаммов онколитических вирусов, экспрессирующих биотерапевтические комплексы для ингибирования новообразования сосудов в солидных опухолях

Руководитель Липатова Анастасия Валерьевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук , г Москва

Конкурс №85 - Конкурс 2023 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова онколитические вирусы, анти-VEGF терапия, микроокружение опухоли, вирус осповакцины

Код ГРНТИ62.37.41

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
За последние 30 лет было разработано огромное количество подходов к терапии злокачественных новообразований, но несмотря на это онкологические заболевания остаются одной из основных причин смертности. Высокая гетерогенность опухолей и как следствие возникновение резистентности приводит к неэффективности классических подходов. Роль опухолевого микроокружения тяжело переоценить, ведь суперпролиферативное состояние клеток, усиленный ангиогенез и метаболическая перестройка клеток стромы в первую очередь поддерживает активное развитие опухоли и метастазирование. Терапия, нацеленная на микроокружение зачастую оказывается более эффективной, чем терапия против раковых клеток. Быстрый рост опухоли во многом определяется уровнем экспрессии эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), их гиперэкспрессия связана с неблагоприятным прогнозом у пациентов с раком молочной железы, толстой кишки, легких, головы и шеи и другими видами рака. Моноклональные антитела (мАТ) против EGFR и VEGF-A были включены в протоколы лечения метатстатического рака чуть менее 20 лет назад (цетуксимаб и бевацизумаб). Клиническая эффективность данной таргетной терапии несколько ограничена в первую очередь из-за неэффективного проникновения в опухоль и быстрого выведения мАТ из кровотока, что подразумевает многократное введение высоких доз и более длительную продолжительность лечения, что также делает терапию чрезвычайно дорогостоящей. Возможность создания репликативно-компетентного вирусного вектора с высокой опухолевой селективностью, поддерживающего эффективную экспрессию функционально активных терапевтических антител, видится весьма перспективной. Подобным вектором может служить аттенуированный рекомбинантный штамм вируса осповакцины, с хорошо изученным профилем безопасности и имеющим сродство к различным солидным опухолям. В проекте предлагается рассмотреть возможность создания вектора, экспрессирующего максимально эффективный биотерапевтический комплекс для нарушения функционирования опухолевого микроокружения и ингибирования образования новых сосудов. В качестве биологически активных комплексов (БАК) предлагаются: - наноантитела против VEGF (разработаны в лаборатории Тиллиба С.В., обладают высокой активностью в отношении указанного фактора) - наноантитела против EGFR (разработаны в лаборатории Тиллиба С.В., обладают высокой активностью в отношении указанного фактора) - внеклеточный домен ингибитора ангиогенеза мозга (BAI) – белок васкулостатин - VSTAT - моноклональное одноцепочечное антитело anti-VEGF-A с доказанной клинический эффективностью (аналог бевацизумаба) - интерферон альфа и гамма – обладают эффективными свойствами для ингибирования трансляции и активации противоопухолевого иммунитета. Интерфероны с бевацизумабом входят в терапевтическую схему для лечения рака толстого кишечника. Вирус осповакцины обладает существенным литическим потенциалом в отношении опухолевых клеток. В рамках выполнения проекта планируется создание эффективных экспрессоров на базе рекомбинантного штамма вируса осповакцины каждого отдельного белка, проверка синергетического действия их комбинации на специально разработанных клеточных in vitro моделях , а в последствии и in vivo моделях подкожных ксенографтов человеческих опухолей в иммунодефицитных бестимусных мышах. Будет проведена оценка фармакодинамических свойств предложенных БАК, исследована возможность сочетания виротерапевтических препаратов с химиотерапевтическими. Кроме этого будет проверена эффективность подхода с экспрессией матриксных металлопротеиназ в вирусном векторе для улучшения фармакодинамики БАК и усиления онколитического эффекта.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В течение первого года были созданы штаммы вируса осповакцины, экспрессирующие различные биологически активные комплексы (БАК) с предполагаемыми антиангиогенными и антипролиферативными свойствами. Лучшие комбинации протестированы in vitro методом коинфекции на эндотелиальных клетках HUVEC и в 3D-моделях сфероидов из HUVEC, фибробластов и опухолевых клеток (RKO, CAOV3). Оценка жизнеспособности проводилась с использованием аламарового синего. Отобраны наиболее перспективные комбинации: Штамм 1: anti-VEGF(3), anti-EGFR(2), IFNg, штамм 2: VSTAT, anti-EGFR(2). С использованием кДНК MMP9 была получена из проекта Horizon (clone id: 4054882) был создан штамм, экспрессирующий MMP9. Ген был клонирован в вектор с красным флуоресцентным белком (RFP), конструкция введена в локус тимидинкиназы вируса. Рекомбинантный штамм получен на HEK293T deltaIFNAR1 и подтверждён секвенированием. Были получены два рекомбинантных штамма, экспрессирующих 2 или 3 БАК, подтвержден сиквенс их генома. Кинетика репликации изучена на клеточной линии BHK21 при различных MOI (0.01, 0.1, 1). Максимальный титр через 72 ч составил: 2.5×10⁶ БОЕ/мл и 4.2×10⁶ БОЕ/мл для штаммов 1 и 2 соответственно. Оба штамма эффективно лизировали клетки BHK21, RKO, CAOV3, A549 при MOI ≥ 0.1. Экспрессия БАК в супернатантах подтверждена ИФА с использованием HA-/His-tag и антител к IFN-γ. Штамм 1 протестирован на нескольких опухолевых и первичных линиях (RKO, A549, и др.). Показана высокая экспрессия БАК в течение 72 ч. Активность БАК подтверждена на репортерной линии HEK293T-VS и по снижению пролиферации HUVEC. Анализ экспрессии путем проведения ПЦР в реальном времени выявил подавление VEGF- и EGF-индуцированных генов (DLL4, DUSP1 и др.). Функциональность экспрессируемой MMP9 показана на клетках 4Т1 в тесте на инвазию через трансвеллы с Matrigel. Вирус, несущий MMP9-RFP, обеспечивал активную миграцию (150–400 клеток/лунку), тогда как контрольный штамм — единичные клетки. БАК с антиангиогенными свойствами (anti-VEGF(3), VSTAT) тестировались на модели куриных эмбрионов. Сначала на репортерном штамме, экспрессирющем люциферазу подтвердили продуктивную инфекцию. Начиная с 5-х суток эмбриогенеза наблюдалось достоверное угнетение ангиогенеза: изменение окраски, снижение плотности сосудов, остановка развития. Вирус с VSTAT вызывал выраженные морфологические изменения куриного эмбриона. Рекомбинантные штаммы протестированы на моделях подкожных ксенографтов RKO и MDA-MB-231-fluc на бестимусных мышах. В обеих моделях вирусы, экспрессирующие VSTAT и anti-VEGF(3), вызывали достоверное уменьшение опухоли по сравнению с контрольным штаммом, экспрессирующим только RFP. Проводилось исследование отдалённых эффектов на моделях 4T1 и CT-26 у мышей Balb/c. Эксперимент продемонстрировал значительное снижение сосудистого покрытия опухолей в группах, получивших терапию штаммами, экспрессирующими с anti-VEGF(3) и VSTAT. Запланирована оценка отсроченных системных эффектов и гистология органов после терапии.

Публикации

1. Сона Булоян, Арпине Арутюнян, Грачик Гаспарян, Анаит Саакян, Астхик Шаххатуни, Наталия Ф. Закирова, Гаухар Юсубалиева, Илья М. Кириллов, Ирина Т. Федякина, Павел Н. Сольев, Анастасия В. Липатова, Михаил А. Богомолов, Владимир С. Прасолов, Тимофей Д. Лебедев и Александр В. Иванов Piperazine-Substituted Pyranopyridines Exhibit Antiproliferative Activity and Act as Inhibitors of HBV Virion Production International Journal of Molecular Sciences, International Journal of Molecular Sciences. 2025; 26(9):3991. https://doi.org/10.3390/ijms26093991 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26093991

2. Мартин А. Зенов, Дмитрий В. Январёв, Ольга Н. Иванова, Екатерина А. Денисова, Михаил В. Голиков, Артемий Федулов, Роман Фрыкин, Виктория Саркисова, Дмитрий А. Голдштейн, Петр М. Чумаков, Анастасия В. Липатова, Александр В. Иванов Moderate metabolic changes are dispensable for replication and oncolytic activity of poliovirus in glioblastoma cells International Journal of Molecular Sciences (год публикации - 2025)