Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В течение первого года были созданы штаммы вируса осповакцины, экспрессирующие различные биологически активные комплексы (БАК) с предполагаемыми антиангиогенными и антипролиферативными свойствами. Лучшие комбинации протестированы in vitro методом коинфекции на эндотелиальных клетках HUVEC и в 3D-моделях сфероидов из HUVEC, фибробластов и опухолевых клеток (RKO, CAOV3). Оценка жизнеспособности проводилась с использованием аламарового синего. Отобраны наиболее перспективные комбинации: Штамм 1: anti-VEGF(3), anti-EGFR(2), IFNg, штамм 2: VSTAT, anti-EGFR(2). С использованием кДНК MMP9 была получена из проекта Horizon (clone id: 4054882) был создан штамм, экспрессирующий MMP9. Ген был клонирован в вектор с красным флуоресцентным белком (RFP), конструкция введена в локус тимидинкиназы вируса. Рекомбинантный штамм получен на HEK293T deltaIFNAR1 и подтверждён секвенированием. Были получены два рекомбинантных штамма, экспрессирующих 2 или 3 БАК, подтвержден сиквенс их генома. Кинетика репликации изучена на клеточной линии BHK21 при различных MOI (0.01, 0.1, 1). Максимальный титр через 72 ч составил: 2.5×10⁶ БОЕ/мл и 4.2×10⁶ БОЕ/мл для штаммов 1 и 2 соответственно. Оба штамма эффективно лизировали клетки BHK21, RKO, CAOV3, A549 при MOI ≥ 0.1. Экспрессия БАК в супернатантах подтверждена ИФА с использованием HA-/His-tag и антител к IFN-γ. Штамм 1 протестирован на нескольких опухолевых и первичных линиях (RKO, A549, и др.). Показана высокая экспрессия БАК в течение 72 ч. Активность БАК подтверждена на репортерной линии HEK293T-VS и по снижению пролиферации HUVEC. Анализ экспрессии путем проведения ПЦР в реальном времени выявил подавление VEGF- и EGF-индуцированных генов (DLL4, DUSP1 и др.). Функциональность экспрессируемой MMP9 показана на клетках 4Т1 в тесте на инвазию через трансвеллы с Matrigel. Вирус, несущий MMP9-RFP, обеспечивал активную миграцию (150–400 клеток/лунку), тогда как контрольный штамм — единичные клетки. БАК с антиангиогенными свойствами (anti-VEGF(3), VSTAT) тестировались на модели куриных эмбрионов. Сначала на репортерном штамме, экспрессирющем люциферазу подтвердили продуктивную инфекцию. Начиная с 5-х суток эмбриогенеза наблюдалось достоверное угнетение ангиогенеза: изменение окраски, снижение плотности сосудов, остановка развития. Вирус с VSTAT вызывал выраженные морфологические изменения куриного эмбриона. Рекомбинантные штаммы протестированы на моделях подкожных ксенографтов RKO и MDA-MB-231-fluc на бестимусных мышах. В обеих моделях вирусы, экспрессирующие VSTAT и anti-VEGF(3), вызывали достоверное уменьшение опухоли по сравнению с контрольным штаммом, экспрессирующим только RFP. Проводилось исследование отдалённых эффектов на моделях 4T1 и CT-26 у мышей Balb/c. Эксперимент продемонстрировал значительное снижение сосудистого покрытия опухолей в группах, получивших терапию штаммами, экспрессирующими с anti-VEGF(3) и VSTAT. Запланирована оценка отсроченных системных эффектов и гистология органов после терапии.

Аннотация результатов, полученных в 2026 году
1. Оценена противоопухолевая активность рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего матриксную металлопротеиназу 9 (VV-MMP9) на модели иммунокомпетентных мышей линии Balb/c с подкожными ксенографтами аденокарциномы молочной железы 4T1 и колоректальной карциномы CT26. В модели CT26 введение VV-MMP9 приводило к достоверному снижению объёма опухоли по сравнению с контрольной группой (p < 0,05, средний объем опухоли 870 мм3 против 1640 мм3 в контроле), тогда как группа VV-RFP демонстрировала промежуточный эффект, статистически значимо не отличающийся от контроля (средний объем опухоли 1116 мм3) (Рис.1 А). Аналогичная закономерность наблюдалась в модели 4T1, где VV-MMP9 обеспечивал наиболее выраженное угнетение опухолевого роста: к концу наблюдения объём опухолей в группе VV-MMP9 был значимо меньше как по сравнению с контролем (194 мм3 против 927 мм3 , p < 0,01), так и по сравнению с VV-RFP (432 мм3 , p < 0,05) . Полученные морфологические данные коррелируют с динамикой роста опухолей и подтверждают, что терапевтический эффект VV-MMP9 реализуется через комплексный механизм: прямой онколиз, усиление некроза опухолевой паренхимы и нарушение опухолевого ангиогенеза. В группе мышей, получавших VV-MMP9, методом ПЦР в реальном времени выявлялась ожидаемая достоверная экспрессия человеческого MMP9. Одновременно наблюдалась значимая гиперэкспрессия мышиного Dll4 , что согласуется с гистологическими данными о нарушении сосудистой архитектуры опухоли и может отражать компенсаторную активацию Notch-зависимых механизмов в ответ на деградацию периваскулярного матрикса, индуцированную экспрессией MMP9. 2. Оценена онколитическая активность штаммов, экспрессирующих биологически активные комплексы anti-VEGF(3)/anti-EGFR(2)/IFNγ и VSTAT/anti-EGFR(2), на моделях иммунодефицитных мышах линии Balb/c nu/nu (возраст 8-10 недель) с ксенографтами MDA-MB-231 или RKO, экспрессирующих люциферазу светлячка под управлением CMV промотора. Динамика опухолевого роста свидетельствует о высокой эффективности штамма VV-VSTAT/anti-EGFR(2), терапия которым на линии MDA-MB-231-luc приводила к снижению объема опухоли более чем в три раза по сравнению с контрольными опухолями (256 мм3 против 886 мм3). Группы получавшие другие штаммы (VV-anti-VEGF(3)/anti-EGFR(2)/IFNγ , VV-RFP) также продемонстрировали значительное замедление опухолевого роста. 3. Проведена комплексная оценка безопасности и хронической токсичности сочетанного применения двух разработанных рекомбинантных штаммов вируса осповакцины. Исследуемый препарат представлял собой смесь штамма 1 (экспрессирующего нанотела anti-VEGF(3) и anti-EGFR(2) совместно с IFNγ) и штамма 2 (кодирующего васкулостатин VSTAT и нанотело anti-EGFR(2)). Эксперимент in vivo был выполнен на мышах, разделенных на три группы по 12 особей (по 6 самок и 6 самцов в каждой). Первая (опытная) группа получала внутрибрюшинную инъекцию смеси вирусных штаммов в дозе 2 * 10^8 инфекционных единиц каждого вируса. Вторая группа (отрицательный контроль) получала физиологический раствор. Третья группа (препарат сравнения) получала коммерческий антиангиогенный препарат бевацизумаб (Авегра®, ЗАО «Биокад») в дозе 5 мг/кг. Введение препаратов во всех группах осуществляли курсом из 6 инъекций с интервалом в 4 дня. Для оценки среднесрочных и отсроченных токсических эффектов половина животных из каждой группы была планово выведена из эксперимента путем эвтаназии через 30 суток после завершения курса терапии, а оставшаяся половина — через 90 суток. Был проведен детальный гистологический анализ внутренних органов (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, ткани ЦНС) с классической окраской гистологических срезов гематоксилином и эозином. Значительных структурных отклонений в головном мозге, печени, сердце, селезенке и почках не выявлено. Введение бевацизумаба приводило к увеличению клеточности в легких к 30-му дню после завершения инъекций, аналогичный эффект наблюдался при введении смеси штаммов. К 90-му дню у одной из мышей, получавших бевацизумаб внутрибрюшинно, развился пневмонит. У мышей, получавших смесь штаммов, к 90-му дню сохранялась повышенная клеточность легких, но других патологических изменений не было выявлено. Таким образом, доказано, что многократное курсовое системное введение смеси созданных антиангиогенных онколитических штаммов в высокой дозировке характеризуется благоприятным профилем безопасности, отсутствием острой и хронической органной токсичности, а также не уступает по профилю безопасности коммерчески доступным антиангиогенным препаратам. 4) на регистрацию был подан программный комплекс, предназначенный для анализа оцифрованных изображений гистологических препаратов опухолевого материала человека, окрашенных гематоксилином и эозином. На основе валидированной открытой модели нейронной сети с его помощью проводится предсказательная оценка степени инфильтрации опухоли и опухолевого микроокружения иммунными клетками и предполагаемых перестроек некоторых сигнальных путей, проводится оценка потенциальных уязвимостей опухолевых клеток для подбора максимально эффективных онклитических вирусов или их комбинации с химеотерапией. Заявка на регистрацию EA-186215 05.05.2026 «Программный комплекс для анализа изображений гистологических препаратов опухоли с помощью методов глубокого обучения для оценки потенциальной эффективности применения онколитических вирусов». Также был подан патент на биоселекционированный онколитический штамм энтеровируса, полученный методом направленной биоселекции, в результате чего вирус утратил зависимость от FcRn-рецептора для проникновения в клетку. Это позволило вирусу эффективно лизировать опухоли, не экспрессирующие данный рецептор (FcRn-негативные), что расширяет спектр уязвимых новообразований, в том числе резистентных к вирусу осповакцины. Это попоможет создать терапевтическую схему с высокой результативностью, выполняя глобальную задачу проекта по повышению эффективности виротерапии. Заявка №2025138765 от 26.12.2025 «Онколитический биоселекционированный штамм Эховируса 1 для терапии злокачественных новообразований с нарушенным путем проникновения вирусов через рецептор FcRn»