Поиск и установление функции морфогенетических факторов головного мозга, сопряженных с развитием когнитивных и психических расстройств

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00125

НазваниеПоиск и установление функции морфогенетических факторов головного мозга, сопряженных с развитием когнитивных и психических расстройств

Руководитель Карагяур Максим Николаевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-226 - Психиатрия

Ключевые слова психические заболевания, шизофрения, депрессия, наследственная предрасположенность, рецептор урокиназы, Т-кадгерин, навигационные рецепторы, однонуклеотидные полиморфизмы, редактирование генома, органоиды мозга, морфогенез, диагностика, животные модели, генная терапия

Код ГРНТИ76.03.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Манифестация психических расстройств дебютирует, как правило, внезапно и может приводить как к инвалидизации самого пациента, так и трагическим социальным последствиям (террористические акты, приступы неконтролируемой агрессии, серийные убийства). Поскольку отсутствуют объективные критерии выявления лиц с предрасположенностью к развитию психических заболеваний, то их диагностика складывается преимущественно из вербального отчета пациента (его родственников) и клинической интерпретации данных опроса или приступа психоза. Существуют данные, свидетельствующие о наследуемой предрасположенности к развитию психических и когнитивных нарушений, обусловленной мутациями или полиморфизмами генов, участвующими в процессах морфогенеза головного мозга (навигационные молекулы, нейротрофины и их рецепторы). Одним из генов, нарушения которого ассоциируются с развитием широкого спектра психических расстройств (аутизм, шизофрения, депрессия), является ген рецептора урокиназы uPAR (PLAUR) - компонента фибринолитической системы крови, но механизм этого эффекта до последнего времени не был установлен. На протяжении 30 лет наша лаборатория под руководством академика РАН В.А. Ткачука на факультете фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова исследует функции урокиназой системы в организме. Нами впервые было обнаружено, что uPAR выполняет функции навигационной молекулы, играет ключевую роль в пролиферации и миграции эндотелиальных и нейральных клеток, а также в формировании, ветвлении и навигации капилляров и аксонов при росте и регенерации сосудов и нервов. uPAR локализуется на лидирующем крае мигрирующей клетки и конусе растущего аксона, способствует локализации внеклеточного протеолиза, опосредованного лигандом урокиназой, определяет внутриклеточную сигнализацию и стимулирует адгезию лидирующего края клетки к межклеточному матриксу, направляя траекторию ее миграции. В работах, которые были инициированы руководителем предлагаемого Проекта Карагяуром М.Н. на модели травмы нерва in vivo было показано, что экспрессия uPAR является необходимым условием для успешной его регенерации. Мы обнаружили, что блокирование uPAR или его лиганда uPA снижает миграцию нейральных клеток и нарушает нормальную траекторию роста аксонов, в то время, как добавление урокиназы, наоборот, ускоряет их рост. На основании этих данных мы предположили, что ген PLAUR может являться одним из ключевых в процессе формирования мозга, что и подтвердили на in vivo модели. Шмаковой А.А. было обнаружено, что гиперэкспрессия uPAR в мозгу эмбриона мыши (на сроке Е15.5) ускоряет миграцию кортикальных нейронов из субвентрикулярной зоны в сторону кортикальной пластинки и ускоряет формирование коры головного мозга. Логично предположить, что нарушение экспрессии или функции PLAUR приведет к снижению миграторного потенциала нейральных прогениторов, нарушит правильное формирование головного мозга и заложит материальную основу для развития когнитивных, неврологических и психических нарушений. Близкой по структуре и функции к uPAR молекулой является Т-кадгерин, навигационный рецептор и молекула межклеточной адгезии. Подобно uPAR Т-кадгерин является гликозилфосфатидил (ГФИ)-заякоренным белком, высокоподвижен в мембране клеток и играет важную роль в навигации эндотелиоцитов и нейральных клеток, но, в отличии от uPAR, он опосредует репульсивный эффект навигационных сигналов. Согласно данным литературы, делеции в гене T-кадгерина ассоциированы с развитием заболеваний аутистического спектра, но понимание механизмов возникновения подобного вида расстройств и роли конкретных геномных вариантов отсутствует. В целом, понимание роли навигационных молекул, в частности uPAR и T-кадгерина, а также классических навигационных рецепторов (Eph, Plx, Nrp, DCC, UNC5), их лигандов (uPA, адипонектина, эфринов, семафоринов и нетринов), нейротрофинов (NGF, BDNF, GDNF) и их рецепторов (trkA, trkB, GFRa1, ret) в процессах морфогенеза, а также знание о конкретных генетических вариантах данных генов, приводящих к неправильной закладке мозга, позволит не только предсказать вероятность развития психических нарушений, но и осуществлять их своевременную профилактику, определять наиболее подходящую терапевтическую стратегию в зависимости от формы заболевания (наследственная или приобретенная), и, что самое главное, разработать эффективные методы пренатального скрининга, этиотропной и патогенетической терапии. В Проекте впервые планируется изучить распространенность геномных вариантов uPAR, T-кадгерина, их лигандов uPA и адипонектина (ADIPOQ), а также ассоциированного с урокиназной системой тканевого активатора плазминогена tPA и др. генов (BDNF), в российской популяции среди пациентов, страдающих психическими заболеваниями (шизофрения, эндогенная депрессия) с помощью технологий NGS и аллель-специфичной ПЦР. Функциональная значимость результатов генетического скрининга далее будет подтверждена на модели органоидов головного мозга, полученных с помощью технологии индуцированных плюрипотентных клеток (IPSCs) из мононуклеаров периферической крови пациентов с наиболее распространенными геномными вариантами морфогенетических факторов и тяжелыми формами психических расстройств. На таких органоидах будет изучен профиль экспрессии целевых генов, изучены особенности их морфогенеза (скорость роста, количество слоев, клеточный состав) и спонтанной электрической активности (с помощью потенциал-чувствительных красителей); результаты будут сравниваться с результатами, полученными на “контрольных” органоидах с исправленной копией гена. В завершении Проекта, обнаруженные геномные варианты морфогенетических факторов мозга, обладающие наибольшей распространенностью и выраженным вкладом в развитие психических расстройств, будут воспроизведены на модели морфогенеза мозга мыши (E15.5) путем in utero инъекции соответствующих генетических конструкций в мозг развивающегося эмбриона мыши (для белков с высокой степенью гомологии между человеком и мышью (CDH13, PLAT, ADIPOQ и др.)) или на органоидах мозга, полученных из IPSCs здоровых пациентов, с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9, технологии siRNA или подходов генной терапии/транс-сплайсинга. Эффективность этих инструментов в наших руках была доказана путем подавления или усиления экспрессии широкого спектра генов (среди них PLAUR и CDH13) на разнообразных клеточных линиях человека и мыши: HeLa, 3T3-L1, Neuro2a, первичные культуры фибробластов человека и мезенхимных стволовых клеток мыши и т.д. (Karagyaur, 2018 - 2021). В ходе данного исследования будет сделан первый шаг в понимании роли морфогенетических факторов мозга и их различных геномных вариантов в развитии психических заболеваний. Согласно имеющимся у нас данным такие исследования будут проведены впервые. Результаты исследования впервые позволят различать врожденные и приобретенные формы психических заболеваний и заложат основу для будущей молекулярно-генетической диагностики представителей российской популяции на предрасположенность к развитию психических заболеваний (пренатальная диагностика, тестирование при получении разрешения на владение гражданским оружием и пр.), а в перспективе и основу для этиотропной и патогенетической терапии плода на ранних этапах развития.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Шмакова А.А., Семина Е.В., Нейфельд Е.А., Цыганков Б.Д., Карагяур М.Н. Анализ взаимосвязи генетических факторов с риском развития шизофрении Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 123, № 2, с. 26-36 (год публикации - 2023)
10.17116/jnevro202312302126

2. Шелег Д.А., Карагяур М.Н., Примак А.Л., Нейфельд Е.А. Роль урокиназы, Т-кадгенрина и адипонектина в развитии эндогенных депрессивных расстройств Уральский Медицинский Журнал, том 22, № 3, с. 96-107 (год публикации - 2023)
10.52420/2071-5943-2023-22-3-96-107

3. Цыганков Б.Д., Карагяур М.Н., Примак А.Л., Шелег Д.А., Нейфельд Е.А. Роль урокиназы, Т-кадгерина и адипонектина в развитии шизофрении, биполярного расстройства и болезни Альцгеймера Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии, том 22, № 3, с. 96-107 (год публикации - 2022)
10.52420/2071-5943-2023-22-3-96-107

4. Карагяур М.Н., Скрябина М.Н., Басалова А.А., Примак А.Л., Толстолужинская А.Е., Илларионова М.Е., Тюрин-Кузьмин П.А., Ефименко А.Ю. Клеточные модели в медицине: опыт создания и перспективы Цитология, 7,64, 623-624 (год публикации - 2022)

5. Примак А.Л., Басалова Н.А., Скрябина М.Н., Толстолужинская А.Е., Ефименко А.Ю., Карагяур М.Н. Адаптация технологии транс-сплайсинга для создания клеточных моделей Гены и Клетки - Материалы V Национального Конгресса по Регенеративной Медицине. Москва, 23–25 ноября 2022 года, 17, стр.192 (год публикации - 2022)

6. Карагяур М.Н., Примак А.Л., Нейфельд Е.А., Семина Е.В., Климович П.С., Скрябина М.Н., Самоходская Л.М., Попов В.С., Джауари С.С., Шелег Д.А., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А. Поиск и установление функции морфогенетических факторов головного мозга, сопряженных с развитием когнитивных и психических расстройств Гены и Клетки - Материалы V Национального Конгресса по Регенеративной Медицине. Москва, 23–25 ноября 2022 года, 17, стр. 101 (год публикации - 2022)

Публикации

1. Карагяур М.Н., Бозов К.Д., Примак А.Л., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Попов В.С., Рубина К.А., Парфененко М.А., Макусь Ю.В., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Идентификация геномных вариантов в генах морфогенеза нервной ткани, ассоциированных с развитием параноидной шизофрении в российской популяции Сибирский вестник психиатрии и наркологии, том 1, № 122, с. 37-50 (год публикации - 2024)
10.26617/1810-3111-2024-1(122)-37-50

2. Карагяур М.Н., Примак А.Л., Бозов К.Д., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Попов В.С., Рубина К.А., Парфененко М.А., Макусь Ю.В., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Ассоциация встречаемости однонуклеотидных геномных вариантов в генах морфогенеза головного мозга с предрасположенностью к эндогенной депрессии в российской популяции Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии, №1, с. 130-147 (год публикации - 2024)
10.33920/med-01‑2401‑13

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В третий год выполнения Проекта: 1. Собраны недостающие генетические конструкции, кодирующие потенциал-чувствительные сенсоры (Lenti-SLC17A7pr-jRGECO1a и Lenti-GAD2pr-GCamp6F) для прижизненного флуоресцентного мечения глутаматергических и ГАМКергических нейронов, соответственно, а также генетические конструкции, кодирующие флуоресцентные белки (Lenti-GFAPpr-BFP и Lenti-MAGpr-BFP) для прижизненного флуоресцентного мечения астроцитов и олигодендроцитов, соответственно. Корректность сборки была подтверждена рестрикционным анализом. 2. Получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), несущие искомые геномные варианты в обеих аллелях, что подтверждено секвенированием по Сэнгеру. 3. На основе исходной популяции иПСК и генетически модифицированных иПСК были получены соответствующие популяции нейральных прогениторных клеток (НПК), которые были использованы для сборки контрольных нейральных сфероидов и сфероидов, состоящих из клеток, несущих геномные варианты rs11935573 (ген DCHS2), rs11768549 (ген EPHA1), rs138175552 (ген NGF), rs139336954 (ген PLXNA3), rs736719 (ген CDH13) или rs1243306395 (ген PLAU). Установлено, что сфероиды, полученные из контрольных НПК или НПК, несущих исследуемые геномные варианты, содержат все ожидаемые типы нейральных клеток: глутаматергические, ГАМКергические и дофаминергические нейроны, олигодендроциты и астроциты. Преобладающей популяцией во всех изученных сфероидах являются клетки, экспрессирующие сенсор GCamp6F, которые могут быть отнесены к ГАМКергическим нейронам, при этом обсчет относительного содержания отдельных клеточных типов в изученных нейральных сфероидах не выявил различий между сфероидами полученными из контрольных немодифицированных НПК или НПК, несущих исследуемые геномные варианты. Клетки идентифицированных типов располагались в сфероидах относительно равномерно и каких-либо закономерностей отдельных типов клеток внутри всех изученных сфероидов установить не удалось. Через 7-8 недель после индукции сборки нейральных сфероидов в них регистрировались спонтанные изменения яркости флуоресценции потенциал-чувствительных сенсоров отдельных клеток, которые были идентифицированы, как явления «деполяризации». Такие изменения яркости флуоресценции были зафиксированы для всех типов закодированных потенциал-чувствительных сенсоров: GAD2pr-GCamp6F, THpr-Archon1 и SLC17A7pr-jRGECO1a, однако достоверно значимых различий в частоте деполяризации отдельных типов нейронов между сфероидами, полученных из интактных НПК и НПК, несущих искомые геномные варианты, отмечено не было. В результате ПЦР в реальном времени тотальной мРНК сфероидов было подтверждено повышение экспрессии мРНК, специфичных для нейрональных (SLC17A7, GAD2, TH, NEFH) и глиальных (GFAP, MAG, MBP) клеток относительно уровня таких транскриптов в иПСК (красная пунктирная линия), при этом достоверной разницы в экспрессии исследованных мРНК между контрольной и экспериментальной группами обнаружено не было. Совокупность полученных данных указывает на отсутствие значимого влияния исследуемых геномных вариантов rs11935573, rs11768549, rs138175552, rs139336954, rs736719 и rs1243306395 на процессы пролиферации НПК, их дифференцировки, а также электрической активности дифференцированных нейронов в модели нейральных сфероидов. По имеющимся у нас данным, такой системный анализ влияния геномных вариантов rs11935573, rs11768549, rs138175552, rs139336954, rs736719 и rs1243306395 на процессы нейрального развития проведен впервые, а полученные результаты являются новыми и представлены впервые. Предложенный комплексный подход можно использовать для всесторонней оценки функциональной значимости отдельных геномных вариантов от момента их идентификации. 4. В модели подкожной тератомы мыши (линия Nude) был подтвержден плюрипотентный статус полученных ранее иПСК. Срезы полученных тератом окрашивались антителами к маркерным белкам всех трех зародышевых листков: нестину - маркеру эктодермального, SOX17 - маркеру эндодермального и виментину - маркеру мезодермального зародышевых листков. Это свидетельствуют об истинной плюрипотентности ранее полученных иПСК. 5. Была получена генетически модифицированная линия мышей Plau-rs1243306395. Факт мутации был подтвержден секвенированием по Сэнгеру. У полученной линии мышей Plau-rs1243306395 проанализировали особенности поведения (эффективность адаптации к стрессу и эффективность преимпульсного торможения (стартл-рефлекс), социальное поведение, тревожность) и особенности строения головного мозга. В тесте “акустический стартл-рефлекс”, у мышей Plau-rs1243306395 наблюдали повышенную, нестабильную рефлекторную реакцию и отсутствие адаптации на звуковой стимул в 100 дБ, а также признаки дефицита преимпульсного торможения, что может свидетельствовать о наличии нарушений, характерных для расстройств шизоидного спектра. В тесте на социальное взаимодействия, мыши Plau-rs1243306395 мыши имели тенденцию к увеличению времени и частоты общения с живой незнакомой мышью, чем с новым неодушевленным предметом, по сравнению с мышами дикого типа. На втором этапе Plau-rs1243306395 мыши также чаще (статистически недостоверно) подходили к уже знакомой мыши, чем к новой незнакомой мыши. Анализ тревожной компоненты поведения, показал, что мыши Plau-rs1243306395 проявляют аномально низкую тревожность, что также может являться одним из признаков расстройств аутистического спектра. Предварительный сравнительный анализ гистологических срезов головного мозга мышей Plau-rs1243306395 и мышей дикого типа показал, что Plau-rs1243306395 мыши имеют большую толщину коры головного мозга, но меньшее число клеток на единицу объема коры головного мозга по сравнению с мышами дикого типа, что может свидетельствовать о нарушениях процесса клеточной миграции в ходе формирования головного мозга. Мы предполагаем, что фенотип мышей Plau-rs1243306395 может демонстрировать пограничный тип психических нарушений, который может более ярко проявиться в неблагоприятных условиях, например, хроническом стрессе.

Публикации

1. Шелег Д.А., Карагяур М.Н., Бозов К.Д., Примак А.Л., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Попов В.С., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Роль генов CDH2 и DCHS2 в классификации аффективно-бредового и галлюцинаторно-бредового психопатологического варианта параноидной шизофрении Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии (год публикации - 2025)

2. Карагяур М.Н., Примак А.Л., Толстолужинская А.Е., Решетнев А.В., Басалова Н.А., Джауари С.С., Бозов К.Д., Великанов А.Н., Ефименко А.Ю., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Попов В.С., Шелег Д.А., Нейфельд Е.А. Сравнительный анализ потенциала технологий геномного редактирования и транс-сплайсинга для моделирования искомых геномных вариантов Технологии живых систем (год публикации - 2025)

3. Карагяур М.Н., Примак А.Л., Бозов К.Д., Усатова В.С., Берестовой М.А., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Идентификация и установление функциональной значимости однонуклеотидных миссенс-вариантов в генах морфогенеза головного мозга в контексте развития психических и когнитивных расстройств Биоинформатика регуляции и структуры геномов / системная биология: Четырнадцатая международная мультиконференция : Тез. докл. (Россия, Новосибирск, 5–10 авг. 2024 г.), стр. 1698-1701 (год публикации - 2024)
10.18699/bgrs2024-9.3-02

4. Примак А.Л., Бозов К.Д., Рубина К.А., Джауари С.С., Нейфельд Е.А., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Шелег Д.А., Ткачук В.А., Карагяур М.Н. Morphogenetic theory of mental and cognitive disorders: the role of neurotrophic and guidance molecules Frontiers in Molecular Neuroscience, 17, 1361764 (год публикации - 2024)
10.3389/fnmol.2019.00136

5. Карагяур М.Н., Бозов К.Д., Примак А.Л., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Чечехин В.И., Попов В.С., Рубина К.А., Макусь Ю.В., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Поиск и установление функции морфогенетических факторов головного мозга, сопряженных с развитием когнитивных и психических расстройств Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, с. 413-415 (год публикации - 2024)
10.17816/morph.konf2024

6. Карагяур М.Н., Примак А.Л., Бозов К.Д., Шелег Д.А., Арбатский М.С., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Климович П.С., Величко А.Я., Драч М.Д., Сотская Е.А., Попов В.С., Рубина К.А., Парфененко М.А., Макусь Ю.В., Цыганков Б.Д., Ткачук В.А., Нейфельд Е.А. Novel missense variants in brain morphogenic genes associated with depression and schizophrenia Frontiers in psychiatry, 15, 1338168 (год публикации - 2024)
10.3389/fpsyt.2024.1338168

7. Карагяур М.Н., Бозов К.Д., Примак А.Л., Джауари С.С., Илларионова М.Е., Климович П.С., Семина Е.В., Самоходская Л.М., Попов В.С., Шелег Д.А., Нейфельд Е.А. Оптимизация технологии аллель-специфичной ПЦР для детекции однонуклеотидных геномных вариантов Технологии живых систем (год публикации - 2025)

8. Илларионова М.Е., Бозов К.Д., Нейфельд Е.А., Примак А.Л., Шелег Д.А., Цыганков Б.Д., Карагяур М.Н. Органотипические модели головного мозга млекопитающих в молекулярной психиатрии и неврологии Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии (год публикации - 2025)

Возможность практического использования результатов
В ходе реализации Проекта был применен комплексный подход, позволяющий установить функциональную значимость генетического варианта от момента его идентификации до оценки его влияния на формирование структуры и функционирование ткани, а также развитие патологических состояний. С помощью этого подхода была проведена оценка влияния вариантов генов морфогенеза мозговой ткани rs11935573, rs11768549, rs138175552, rs139336954, rs736719 и rs1243306395, идентифицированных у пациентов с ментальными расстройствами, на процессы нейрального развития. Данный комплексный подход может быть рекомендован для изучения вклада отдельных геномных вариантов с неизвестной функциональной значимостью в развитие патологий центральной нервной системы. В случае установления такой значимости геномный вариант может рассматриваться как один из диагностических/прогностических маркеров, а также как потенциальная мишень для терапевтической коррекции. Развитие и масштабирование этого подхода является неотъемлимой частью для расширения возможностей персонализированной высокотехнологичной медицинской помощи. В ходе реализации Проекта был разработан ряд молекулярных инструментов (генетически кодируемых потенциал-чувствительных сенсоров под контролем нейрон-специфических промоторов), которые могут быть использованы для прижизненного мечения нейральных и глиальных клеток в моделях in vitro и in vivo. Была создана линия мышей Plau-rs1243306395, которая воспроизводит один из вариантов гена PLAU человека и характеризуется аберрантным поведением (повышенной, нестабильной рефлекторной реакцией и отсутствием адаптации на звуковой стимул, дефицитом преимпульсного торможения и выраженно сниженной тревожностью). Мы предполагаем, что наблюдаемый фенотип мышей Plau-rs1243306395 может демонстрировать пограничный тип психических нарушений, который может более ярко проявиться в неблагоприятных условиях, например, хроническом стрессе. Потенциально, геномный вариант rs1243306395 может рассматриваться, как один из предикторов предрасположенности к развитию психических и когнитивных нарушений, а линия мышей Plau-rs1243306395 как модельный объект для изучения патогенеза развития шизоидных нарушений личности и/или нарушений аутистического спектра. Подтверждение функциональной значимости варианта rs1243306395 в развитии патологических состояний требует оценки сохранности памяти и расширенного тестирования социальных навыков, а также системного изучения особенностей строения мозга мышей Plau-rs1243306395 в норме, а также на фоне хронического стресса во взрослом состоянии и при внутриутробном развитии. Эти исследования запланированы на продолжение работ по Проекту.