Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках работы над проектом мы продолжаем проведение запланированных исследований, направленных на изучение регуляторной роли функциональных детерминант мРНК в процессе трансляции. Мы изучаем влияние изменений в длине последовательности Шайна-Дальгарно на мРНК, ответственной за связывание с рибосомой; ее удаленности от инициаторного кодона, определяющей начало биосинтеза белка; вторичных структур, различающихся по своему расположению на мРНК, а также влияние типа кодона на процесс трансляции. На втором этапе реализации проекта одним из направлений нашего исследования являлось изучение влияния малых молекул, таких как алармоны (p)ppGpp и антибиотики на примере стрептомицина и касугамицина на процесс биосинтеза белка в условиях вариативности мРНК. Мы определили, что присутствие алармонов в среде приводит к снижению эффективности связывания элонгационной тРНК в А сайт рибосомы независимо от типа изучаемых кодонов на мРНК и зависит от вторичной структуры на мРНК. Любопытным оказался результат, отражающий возникновение сильного ингибирующего эффекта связывания элонгационной тРНК с рибосомой в присутствии pppGpp для мРНК с отсутствующим структурированным участком в 5´-нетранслируемой области (5´-НТО) ¬– SETI-элемента, придающего устойчивость к ингибирующему действию ppGpp (Vinogradova et al. 2020). Экспериментальные данные, полученные нами в процессе изучения влияния антибиотиков: стрептомицина и касугамицина на стадии инициации трансляции отражают мРНК-зависимую природу их действия. Стрептомицин оказывал влияние на все изучаемые промежуточные этапы образования инициаторного комплекса и зависел от присутствия IF1 и IF3 в системе. При изучении механизма действия антибиотика касугамицина нам удалось определить его мРНК-зависимое действие на процесс трансляции. Мы демонстрируем важный результат, описывающий различия в степени устойчивости природных мРНК (mTufA и mRnr), обладающих схожим структурированным SETI-элементом к ингибирующему действию касугамицина. Ранее мы показали, что данные последовательости на мРНК обладали равнозначной устойчивостью к ингибирующему действию ppGpp (Vinogradova et al. 2020). Наши данные несомненно расширяют имеющиеся представления о механизме действия антибиотика касугамицина и отмечают важную роль регуляторных участков мРНК в этом процессе. Дополнительно мы продолжили изучение механизма возникновения альтернативного декодирования в двух рамках считывания на мРНК и роли вторичных структур, а также типа второго кодона в этом процессе начатое в первый год выполнения проекта. Мы определили, что выбор рамки считывания на мРНК зависит от кодирующей последовательности второго кодона на мРНК, где UUC кодон стимулирует более эффективное привлечение элонгационной тРНК в А сайт рибосомы с последующим формированием пептидной связи по сравнению с GUU кодоном. Все заявленные к выполнению задачи второго этапа проекта были успешно выполнены. Кроме того, были реализованы дополнительные экспериментальные задачи, которые вызвали наш научный интерес в процессе выполнения проекта. Таким образом, дополнительно было выполнено: I. создана новая, быстрая и эффективная методика флуоресцентного мечения 70S рибосом и 30S/50S рибосомальных субъединиц; II. проведен анализ влияния дополнительных представителей «малых молекул» – ДНК-аптамеров, нацеленных на инициаторные факторы на процесс инициации трансляции; III. проведен анализ конформационной стабильности и агрегационной устойчивости бифункционального гомолога RelSeq, ответственного за синтез и поддержание уровня алармонов (p)ppGpp в клетке в условиях изменения ионного состава раствора и распределения концентрации нуклеотидов в среде. В отчетный период были подготовлены материалы проводимых исследований для публикации четырех статей: 1. Blocking IF3N delays bacterial translation initiation (материалы загружены в bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2025.03.14.643242, 16.03.2025; направлены в редакцию Nucleic Acids Research, NAR-00827-2025 (Q1, IF 16.6) – 13.03.2025 – Приложение Б). 2. Dissecting Bacterial Translation Initiation Ensembles at Microscale (готова к загрузке в bioRxiv, планируется подача в Scientific reports (Q1, IF 3.8) – Приложение В). 3. Связывание (p)ppGpp с бифункциональным ферментом RelSeq повышает его конформационную стабильность – принята в печать от 13.05.2025 в Российские нанотехнологии (IF 0.7) – Приложение Г. 4. Влияние последовательности Шайна-Дальгарно на стадию элонгации – опубликована в спец выпуске журнала Биотехнология в рамках участия в конференции от 25.12.2024 (IF 0.6) – Приложение Д.