Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Был оптимизирован протокол синтеза наночастиц в органической оболочке: подобрана температура, концентрации реагентов, pH, условия ультразвуковой обработки. Получены образцы наночастиц оксида железа в цитратной и цитрат-малатной оболочках. Полученные наночастицы были охарактеризованы по содержанию в них железа с использованием тиоцианатного метода. При одинаковых условиях синтеза и отмывки концентрация воспроизводилась с 10% точностью. Проверялось цитотоксическое действие НЧ на клетки при совместной инкубации в стандартных условиях без облучения. Токсичность НЧ в цитратной оболочке проявлялась уже при концентрации НЧ 50 мкг/мл. Более чувствительными оказались клетки А172. Для снижения токсического эффекта была использована комбинированная цитрат-малатная оболочка. При этом токсичность была приемлемой вплоть до концентрации НЧ 100 мкг/мл. Структура, состав и размер магнитных ядер наночастиц в цитратной и цитрат-малатной оболочках контролировались методом рентгеновской дифракции. Все отражения Брэгга были проиндексированы, что подтверждает образование четко определенной однофазной кубической шпинельной структуры Fe3O4 без каких-либо примесных пиков. Полученные средние размеры области кристалличности Fe3O4 ядра наночастиц (7(1) нм) были близки к размерам (8.7(1.3)нм) найденных ранее для НЧ в декстрановой оболочке. Были получены микрофотографии образцов наночастиц в цитратной оболочке методом просвечивающей электронной микроскопии. Распределение Fe3O4 ядер наночастиц по размерам описывалось логнормальным распределением со средним диаметром ядра 8.6(1.1) нм, совпадающим в пределах ошибок с размером области кристалличности, полученным методом рентгеновской дифракции. По данным ДРС гидродинамический радиус агрегатов МНЧ в цитратной оболочке составлял 32 нм. Для агрегатов наночастиц в малат-цитратной оболочке распределение радиуса по ДРС имело двухмодовый характер с пиками на 14 и 47 нм. Основная масса приходилась на пик 14 нм. Методом нелинейного отклика был установлен суперпарамагнитный режим поведения наночастиц как в цитратной, так и в цитрат-малатной оболочках. Магнитные и динамические параметры наночастиц определенные из обработки зависимостей фазовых компонент от магнитного поля на основе формализма кинетического уравнения Фоккера-Планка были близки для наночастиц в различных оболочках. Концентрация железа, определенная тиоцианатным методом, позволила вычислить концентрацию НЧ в суспензиях N_NP. По отношению N_NP к концентрации магнитных центров Nc было определено количество наночастиц в агрегате (магнитном центре). В концентрированных суспензиях, полученных при синтезе, количество наночастиц в агрегате Na составляло 4(1) для НЧ в цитратной и цитрат-малатной оболочке и Na = 6(1) для наночастиц в декстрановой оболочке. Образование агрегатов сопровождается уменьшением среднего момента агрегата по сравнению с суммой моментов, входящих в него наночастиц вследствие дипольных корреляций. Это приводит к уменьшению свободной энергии ансамбля наночастиц за счет снижения его магнитостатической энергии. 2) Исследование по поглощению НЧ клетками проводилось с использованием двух линий клеток глиобластомы человека – А172 и Gl-Tr. Для сравнения эксперименты проводились также на клетках нормальной морфологии – фибробластах легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Оценка накопления наночастиц в клетках A172 и Gl-Tr методом нелинейного отклика при временах инкубации 2 и 24 часа показала более эффективное накопление при 24 часах совместной инкубации. Контроль накопления наночастиц в клетках при разной плотности посева (2*10^4 клеток на лунку и 10^5 клеток на лунку) показал более эффективное накопление при плотности посева 2*10^4 клеток на лунку. Данные результаты вместе с результатами по цитотоксичности наночастиц позволили сформировать оптимальный протокол инкубации клеток с наночастицами перед облучением: 24 ч инкубации при плотности начального посева 2*10^4 клеток на лунку, концентрация наночастиц в декстрановой оболочке 100 мкг/мл, а концентрация наночастиц в малат-цитратной оболочке – 20 – 50 мкг/мл. 3) Проверка эффекта радиосенсибилизации наночастицами оксида железа в цитрат-малатной оболочке выполнена клетках A172 и Gl-Tr при облучении фотонами в рентгеновском и гамма-диапазонах. Клетки в рентгеновском диапазоне облучали в 24-луночных планшетах дозами 0, 1, 2, 3, 4 и 6 Гр. Мощность дозы составила 5.8 Гр/мин. Использовалось низкоэнергетическое рентгеновское излучение со спектром, близким к белому шуму. Фотоны, излучаемые рентгеновской трубкой, имели энергию до 35 кэВ. Облучение в гамма-диапазоне проводилось с использованием источника гамма-излучения 60Со с энергией фотонов 1.2 МэВ. Клетки глиомы облучали возрастающими дозами 0, 2, 4 и 6 Гр. Мощность дозы составляла 8.5 Гр/мин. Жизнеспособность клеток определяли через 6 дней после облучения, когда клетки в контрольных лунках практически достигали монослоя. Результаты эксперимента нормировали относительно контроля при нулевой дозе облучения: (i) для пробы с резазурином по среднему уровню флуоресценции и (ii) для кристаллического фиолетового по средней окрашенной площади контрольной лунки. Для оценки различий между группами (с МНЧ или без них) использовали критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считались результаты при p < 0.05. Оба теста на жизнеспособность подтверждают появление комбинированного эффекта при рентгеновском облучении (2 – 6 Гр) клеток, содержащих наночастицы. Максимальный эффект радиосенсибилизации наночастицами в цитрат-малатной оболочке зафиксирован при дозе 4 Гр на обеих клеточных линиях, как и для наночастиц в декстрановой оболочке. Эффект радиосенсибилизации также был несколько выше для клеточной линии Gl-Tr. Увеличение концентрации наночастиц в малат-цитратной оболочке с 20 до 50 мкг/мл в среде для культивирования не приводило к увеличению эффекта радиосенсибилизации. После гамма-облучения клеток не выявлено статистически значимой разницы между жизнеспособностью клеток, облученных после культивирования без и с наночастицами. 4) Для проверки гипотезы о разрушении цитратной или цитрат-малатной оболочки при облучении проведено измерение уровня активных форм кислорода, образующихся в клетках с и без НЧ после облучения. Статистически значимых отличий между продукцией АФК клетками, культивируемыми без/с наночастицами в цитратной и цитрат-малатной оболочках, после рентгеновского облучения не обнаружено. Сравнение данных по радиосенсибилизации наночастицами в цитрат-малатной и декстрановой оболочке вместе с отсутствием образования дополнительных АФК для обоих типов оболочки свидетельствует, что основным механизмом радиосенсибилизации при воздействии фотонного облучения на клетки с инкорпорированными наночастицами является генерация вторичных электронов. Разрушения цитратной оболочки наночастиц внутри клеток при воздействии фотонного облучения не происходит.