Роль дисфункции ферментов лизосом в олигомеризации альфа-синуклеина и накоплении его модифицированных форм в клетках крови при болезни Паркинсона и в экспериментах in vitro.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-25-00397

НазваниеРоль дисфункции ферментов лизосом в олигомеризации альфа-синуклеина и накоплении его модифицированных форм в клетках крови при болезни Паркинсона и в экспериментах in vitro.

Руководитель Емельянов Антон Константинович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" , Ленинградская обл

Конкурс №89 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-402 - Медицинская генетика

Ключевые слова глюкоцереброзидаза, клеточные модели, болезнь Паркинсона, мутации генов, лизосомные болезни накопления, аутофагия, альфа-синуклен

Код ГРНТИ34.15.00; 76.03.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Ключевую роль в патогенезе болезни Паркинсона (БП) играет накопление нейротоксичных форм белка альфа-синуклеина в тканях головного мозга. Показано, что ряд химических модификаций альфа-синуклеина способствуют его олигомеризации (Hodara et al, 2004, Biol Chem, 279:47746-53). При этом дисфункция лизосом рассматривается, как одна из возможных причин накопления альфа-синуклеина в клетках. К настоящему времени описан ряд генов лизосомных болезней накопления (ЛБН), мутации в которых ассоциированы с риском развития БП. Во многих популяциях, в том числе и в России, показано, что мутации в гене GBA, кодирующем лизосомный фермент глюкоцереброзидазу (GBA), являются фактором высокого риска БП (Emelyanov et al, 2018, doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2018.06.027; Ran C. et al., 2016, Neurobiol. Aging., V. 4. P. 212.e215–212.e211). Все больше появляется данных о кумулятивном вкладе мутаций генов ЛБН в риск развития данного заболевания. Показано, что дисфункция GBA приводит к нарушению процесса аутофагии и накоплению альфа-синуклеина в клетках, а также плазме крови у пациентов с ЛБН и БП (Magalhaes J, et al. Hum Mol Genet. 2016;25(16):3432-3445; Pchelina et al., Neuroscience Letters. 636:70-76. 2017, 58). Однако, остается неясным приводят ли другие мутации в генах ЛБН к нарушению процесса аутофагии и накоплению альфа-синуклеина. Целью настоящего проекта является изучение влияния дисфункции ферментов лизосом на олигомеризацию альфа-синуклеина, накопление его модифицированных форм и уровень аутофагии в различных клетках крови пациентов с БП с мутациями в генах, ассоциированных с ЛБН, а также в экспериментах in vitro на культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y. Ранее в рамках проведения секвенирования кодирующей области 44 генов, ассоциированных с ЛБН, среди пациентов с БП нами были выявлены пациенты с редкими патогенными вариантами в ряде генов, в частности у пациентов с БП были обнаружены мутации в генах ARSA (Senkevich K.A. et al., 2023, Movement disoders, in press), GLA, ASAH1, MAN2B1, GALC (Senkevich K.A. et al., 2023, Brain, 146;1859-1872), также за годы исследований нами сформирована группа пациентов с мутациями N370S и L444P в гене GBA. В рамках данного проекта нами впервые планируется проведение оценки олигомерного альфа-синуклеина, его модифицированных форм (фосфорилированный, нитрозилированный, сумоилированный, гликированный) и уровня аутофагии в клетках периферической крови пациентов с БП с различными мутациями в генах ЛБН (GLA, ASAH1, MAN2B1, GALC, ARSA, GBA), пациентов со спорадической формой БП (сБП) и индивидуумов контрольной группы методом дот- и вестерн-блоттинга, а также проточной цитометрией. На культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией альфа-синуклеина (SNCA) человека будет оценено влияние дисфункции лизосом на агрегацию альфа-синуклеина и уровень модифицированных форм альфа-синуклеина. Подавление активности лизосомных ферментов будет генерироваться с использованием малых интерферирующих РНК (миРНК). Впервые будет оценено влияние дисфункции ферментов арилсульфатазы А (ARSA), альфа-галактозидазы А (GLA), а также глюкоцереброзидазы на накопление указанных выше модифицированных форм альфа-синуклеина in vitro. У пациентов исследуемых групп в сухих пятнах крови, а в случае клеточной культуры – сухих пятен клеток, будет проведено измерение активности наиболее значимых ферментов лизосом (глюкоцереброзидаза, альфа-галактозидаза, альфа-глюкозидаза, галактоцереброзидаза, сфингомиелиназа, альфа-идуронидаза) и концентрации их субстратов (гексазилсфингозин, лизосфингомиелин, лизоглоботриаозилсфингозин, лизосфингомиелин-509) с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС, что позволит сопоставить данные показатели с уровнем оцениваемых форм альфа-синуклеина, а также аутофагии. Таким образом, выполнение проекта позволит прояснить влияние дисфункции ферментов лизосом на метаболизм альфа-синуклеина при БП, а также выявить потенциальные маркеры развития заболевания и молекулярные мишени для разработки потенциальной фармакологической терапии.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Данный проект посвящен изучению влияния дисфункции ферментов лизосом на олигомеризацию альфа-синуклеина, накопление его модифицированных форм и уровень аутофагии в различных клетках крови пациентов с болезнью Паркинсона с мутациями в генах, ассоциированных с лизосомными болезнями накопления, а также в экспериментах in vitro на культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y. В результате проведенного исследования было проведено уточнение частот генетических вариантов гена GBA1 (N370S, L444P, E326K, T369M) для пациентов с БП и контроля в Северо-Западном регионе России. В исследование была добавлена группа пациентов с мультисистемной атрофией (МСА.) Впервые в России выявлено, что риск МСА был в 3 раза повышен у носителей аллеля риска G генетического варианта E326K гена GBA1. Было обнаружено статистически значимое повышение относительного уровня общего альфа-синуклеина в лизатах эритроцитов периферической крови пациентов с БП с мутацией N370S в гене GBA1 по сравнению с пациентами со спорадической формой БП (сБП), БП с мутацией Е326К в гене GBA1, МСА с мутацией Е326К в гене GBA1 и контрольной группы. Показано статистически значимое повышение относительного уровня общего альфа-синуклеина в лизатах эритроцитов периферической крови пациентов с БП с мутацией Е326К в гене GBA1 по сравнению с пациентами с сБП и контроля. Также в настоящем исследовании с использованием дот-блоттинга был оценен относительный уровень общего и олигомерного альфа-синуклеина в нерастворимой фракции лизатов эритроцитов периферической крови у пациентов с БП, МСА, а также у индивидуумов контрольной группы. Статистически значимых различий между исследуемыми группами обнаружено не было. Были отработаны условия для оценки уровня фосфорилированного по тирозину 136, тирозину 133 альфа-синуклеина и относительного уровня сумоилированного и убиквитинированного альфа-синуклеина эритроцитов периферической крови методом вестерн-блоттинга с применением реагента для удаления гемоглобина из лизатов, а также термообогащения лизатов альфа-синуклеином. Проведена оценка уровня аутофагии по маркерному белку LC3B-II в макрофагах периферической крови пациентов с мутациями в гене GBA1, пациентов с сБП и индивидуумов контрольной группы. Показано повышение уровня белка LC3B-II в макрофагах периферической крови у пациентов GBA-БП (N370) и спорадической формы БП по сравнению с группой контроля, что свидетельствует об увеличении количества аутофагосом при БП независимо от вида мутации. При разделении пациентов с GBA-БП по тяжести мутаций в гене GBA, повышенный уровень белка LC3B-II наблюдался в макрофагах, полученных из мононуклеаров периферической крови, пациентов с мутацией N370S по сравнению с контрольной группой. Напротив, пациенты с мутацией L444P характеризовались отсутствием различий с группой контроля в уровнях белков LC3B-I и LC3B-II. Эти результаты позволяют предположить, что тяжесть мутаций гена GBA по-разному влияет на динамику образования аутофагосом. В частности, мутация N370S, по-видимому, способствует накоплению аутофагосом, в то время как мутация L444P не влияет на этот процесс. С использованием масс-спектрометрического анализа проведено изучение активности ключевых гидролаз лизосом (глюкоцереброзидазы, альфагалактозидазы, альфа-глюкозидазы, галактоцереброзидазы, кислой сфингомиелиназы и альфаидуронидазы) и концентрации их субстратов (гексазилсфингозина (смесь гликозилсфингозина и галактозилсфингозина, лизосфингомиелина, лизоглоботриаозилсфингозина, лизосфингомиелина-509) в сухих пятнах периферической крови пациентов с мутациями в гене GBA1, пациентов с сБП, МСА и индивидуумов контрольной группы. Данное исследование позволило уточнить полученные ранее результаты, а также впервые оценить изменение активности указанных выше гидролаз и концентрации их субстратов в группе пациентов с МСА с генетическими вариантами E326K и T369M гена GBA1. Полученные данные свидетельствуют о нарушении работы ферментов лизосом, а также метаболизма липидов, у пациентов с синуклеинопатиями (МСА и БП), включая пациентов с вариантами гена GBA1. В рамках выполнения проекта были получены лентивирусные частицы, несущие гены SNCA и EGFP. Проведены предварительные эксперименты с целью создания клеточной линии нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией данных генов. Показано увеличение уровня мРНК гена SNCA и белка альфа-синуклеина в лизатах трансдуцированных клеток. Также были созданы четыре варианта вирусных частиц, геномная РНК которых несет последовательность шпилечной РНК (шпРНК), специфичной к мРНК гена лизосомного фермента лизосом кислой сфингомиелиназы SMPD1. Показана способность полученного вируса, несущего один из четырех вариантов шпРНК, приводить к нокдауну гена SMPD1 в клетках линии SH-SY5Y и подавлять экспрессию данного гена на 94,4%.

Публикации

1. Журавлев А.С., Мультатули Л.А., Копытова А.Э., Лавринова А.О., Пидюрчина В.Н., Демидова Е.А., Милюхина И.В., Беркович О.А., Пчелина С.Н., Емельянов А.К. Уровень альфа-синуклеина в эритроцитах периферической крови при синуклеинопатиях Сборник тезисов XI Всероссийского молодежного научного форума с международным участием “Open Science ”, Гатчина, 13–15 ноября 2024 (год публикации - 2024)

2. А. К. Емельянов, А. О. Лавринова, А. С. Журавлев, Г. В. Байдакова, И. В. Милюхина, М. И. Шадрина, Е. Ю. Захарова, С. Н. Пчелина Генетические и эпигенетические факторы, влияющие на уровень α синуклеина при болезни Паркинсона Международный Конгресс "VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки и высшей школы" : Сборник тезисов, Саратов, 14–19 июня 2024 года, т.1, с.117 (год публикации - 2024)

3. Лавринова А.О., Журавлев А.С., Демидова Е.А., Пидюрчина В.Н., Милюхина И.В., Беркович О.А., Пчелина С.Н., Емельянов А.К. Ассоциация генетических вариантов гена GBA с риском развития мультисистемной атрофии в Северо-Западном регионе России Сборник трудов Курчатовского геномного форума 2024 : Международный форум природоподобных технологий, Москва, 21–22 октября 2024 года, с. 183-184 (год публикации - 2024)

4. А.О. Лавринова, А.С. Журавлев, Е.А. Демидова, В.Н. Пидюрчина, А.И. Безрукова, Т.С. Усенко, И.В. Милюхина, О.А. Беркович, С.Н. Пчелина, А.К. Емельянов Ассоциация генетических вариантов генов GBA и LRRK2 с риском развития мультисистемной атрофии в Северо-Западном регионе России Сборник тезисов XI Всероссийского молодежного научного форума с международным участием “Open Science ”, Гатчина, 13–15 ноября 2024 (год публикации - 2024)

5. А.К. Емельянов, М.В. Белецкая, К.А. Сенкевич, А.О. Лавринова, А.А.Тюрин, И.В.Милюхина, А.А.Тимофеева, С.Н. Пчелина Мутации в генах лизосомных болезней накопления как фактор риска развития болезни Паркинсона Ученые записки ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (год публикации - 2025)

6. Емельянов А.К., Журавлев А.С., Лавринова А.О., Николаев М.А., Демидова Е.А., Пидюрчина В.Н., Милюхина И.В., Пчелина С.Н. Роль дисфункции ферментов лизосом в накоплении альфа-синуклеина и его модифицированных форм в клетках крови при болезни Паркинсона и в экспериментах in vitro Объединенный научный форум. VIII Съезд физиологов СНГ. XV Съезд аллергологов и иммунологов СНГ. Симпозиум «Белки и пептиды»: научные труды. , с. 30-31 (год публикации - 2025)

7. Пидюрчина В.Н., Лавринова А.О., Демидова Е.А., Журавлев А.С. Уровень общего и фосфорилированного альфа-синуклеина в эритроцитах периферической крови при GBA-ассоциированной форме болезни Паркинсона. АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОМЕДИЦИНЫ - 2025. Материалы XXXI Всероссийской конференции молодых учёных с международным участием. Санкт-Петербург, 2025. Издательство: Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург, с. 237-238 (год публикации - 2025)

8. Емельянов А.К., Белецкая М.В., Сенкевич К.А., Лавринова А.О., Тюрин А.А., Милюхина И.В., Тимофеева А.А., Амелин А.В., Пчелина С.Н. Мутации в генах лизосомных болезней накопления как фактор риска развития болезни Паркинсона Ученые записки ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова, 32(1):52–58 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.24884/1607-4181-2025-32-1-52-58

9. Емельянов А.К., Усенко Т.С., Копытова А.Э., Бычков И.О., Лавринова А.О., Николаев М.А., Якимовский А.Ф., Милюхина И.В., Тимофеева А.А., Амелин А.В., Пчелина С.Н. Биохимические характеристики наследственных форм синуклеинопатий Медицинская генетика, 24(10):84-86 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.25557/2073-7998.2025.10.84-86

10. Безрукова А.И., Башарова К.С., Емельянов А.К., Рыбаков А.В., Милюхина И.В., Пчелина С.Н., Усенко Т.С. Autophagy Process in Parkinson’s Disease Depends on Mutations in the GBA1 and LRRK2 Genes Biochemical Genetics, 10.1007/s10528-025-11125-z (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.1007/s10528-025-11125-z

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Данный проект посвящен изучению влияния дисфункции ферментов лизосом на олигомеризацию альфа-синуклеина, накопление его модифицированных форм и уровень аутофагии в различных клетках крови пациентов с болезнью Паркинсона с мутациями в генах, ассоциированных с лизосомными болезнями накопления, а также в экспериментах in vitro на культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y. В рамках реализации второго года проекта были получены клеточные линии нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией гена SNCA и нокдауном гена SMPD1, а также клетки только с нокдауном гена SMPD1. Проведена оценка уровня мономерного и олигомерного альфа-синуклеина, а также его модифицированной формы (фосфорилированный по Ser-129), в клетках линии SH-SY5Y с гиперэкспрессией SNCA и нокдауном гена SMPD1 по сравнению с контрольными клетками. Также оценено влияние дисфункции глюкоцереброзидазы (GCase) на уровень мономерного и олигомерного альфа-синуклеина, а также его модифицированной формы (фосфорилированный по Ser-129), в клетках линии SH-SY5Y с гиперэкспрессией гена SNCA и нокдауном гена SMPD1. Показано, что нокдаун гена SMPD1 в клетках линии нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией гена SNCA способствует более выраженному накоплению альфа-синуклеина, включая его фосфорилированную по Ser129 форму. При этом на данных клетках не было показано влияния дисфункции GCase на уровень альфа-синуклеина, что может быть обусловлено малочисленностью исследуемых групп и требует проведения дальнейших экспериментов. В настоящем исследовании на клетках линии нейробластомы SH-SY5Y нами было оценено влияние гиперэкспрессии гена SNCA на уровень аутофагии. Кроме того, на данный показатель было оценено влияние дисфункции фермента GCase в клетках линии нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией гена SNCA и нокдауном гена SMPD1. Было обнаружено, что гиперэкспрессия гена SNCA в клетках способствует увеличению маркерного белка LC3II, свидетельствуя об увеличении количества аутофагосом и, как следствие, уровня аутофагии. Однако влияния дисфункции фермента GCase на данный показатель в указанных клетках нами обнаружено не было. В настоящем исследовании с использованием метода масс-спектрометрии на культуре клеток нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией гена SNCA, а также данных клеток с одновременным нокдауном гена SMPD1, мы оценили влияние ингибитора фермента GCase кондуритол-бела-эпоксида (CBE) на активность ферментов лизосом (GCase, альфа-галактозидаза А (GLA), кислая альфа-глюкозидаза (GAA), галактоцереброзидаза (GALC), кислая сфингомиелиназа (ASM), альфа-идуронидаза (IDUA)) и концентрацию их субстратов (HexSph, лизосфингомиелин (LysoSM), лизоглоботриаозилсфингозин (LysoGb3), лизосфингомиелин-509 (Lyso509)). Было показано, что добавление к клеткам CBE приводило к снижению активности GCase и повышению концентрации субстрата HexSph как в клетках с гиперэкспрессией гена SNCA, так и в клетках с гиперэкспрессией гена SNCA и нокдауном гена SMPD1. Было обнаружено повышение активности ферментов GALC и IDUA в клетках нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессией гена SNCA при добавлении в питательную среду CBE. Полученные данные свидетельствуют о том, что дисфункция GCase может влиять на метаболизм сфинголипидов. В рамках выполнения данного этапа проекта был расширен по сравнению с прошлым годом банк эритроцитов периферической крови группы пациентов со спорадической БП (БП), мультисистемной атрофией (МСА), GBA1-ассоциированной формой БП и МСА, а также индивидуумов контрольной группы. В термообогащенных лизатах эритроцитов индивидуумов указанных групп с помощью вестерн-блоттинга был впервые оценен относительный уровень альфа-синуклеина, включая его фосфорилированные формы, а также уровень нормированного на общий альфа-синуклеин сумоилированных и убиквитинированных белков. Было выявлено повышение относительного уровня мономерного альфа-синуклеина в лизатах эритроцитов периферической крови пациентов с БП относительно контроля, пациентов с БП и мутацией L444P в гене GBA1 и пациентов с БП и мутацией Е326К в гене GBA1. Также показано увеличение относительного уровня олигомерного альфа-синуклеина в лизатах эритроцитов периферической крови пациентов с БП и мутацией N370S в гене GBA1 относительно пациентов с МСА и контроля. В то же время было продемонстрировано повышение относительного уровня мономерного альфа-синуклеина, фосфорилированного по Ser-129 в лизатах эритроцитов периферической крови пациентов с БП и мутацией N370S в гене GBA1 по сравнению с пациентами с БП и мутацией L444P в гене GBA1. Обнаружено повышение относительного уровня нормированного на общий альфа-синуклеин сумоилированных белков в лизатах эритроцитов периферической крови пациентов с БП и мутацией E326K в гене GBA1 относительно пациентов с БП и МСА. Также выявлено снижение относительного уровня данного показателя, нормированного на мономерный альфа-синуклеин, в лизатах эритроцитов периферической крови пациентов с МСА относительно пациентов с БП и мутацией L444P в гене GBA1, БП и мутацией E326K в гене GBA1 и контроля. При сравнении исследуемых групп статистически значимых различий в относительном уровне нормированного на альфа-синуклеин убиквитинированного белка и альфа-синуклеина, фосфорилированного по тирозину 133, тирозину 136 обнаружено не было.

Публикации