КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 14-14-00487

НазваниеСтабилизация конформации рибосомных комплексов для обеспечения эффективной терминации трансляции эукариот

РуководительАлкалаева Елена Зиновьевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2014 г. - 2016 г.  , продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№1 - Конкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словарибосома, факторы терминации, трансляция

Код ГРНТИ34.15.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Стабилизация конформации рибосомных комплексов играет важную роль в регуляции трансляции. Довольно подробно описаны механизмы поддержания конформации инициаторных и элонгационных трансляционных комплексов, и практически ничего не известно про стабилизацию терминационных. Есть данные, что кроме факторов eRF1 и eRF3 в процессе терминации трансляции эукариот участвуют дополнительные белки, в том числе Dbp5 и Gle1, которые помимо этого выполняют и другие функций в клетке. Однако механизмы их действия в терминации до сих пор не раскрыты. Кроме того, имеется информация о возможной роли деацилированной тРНК в стабилизации посттерминационных рибосомных комплексов. Данный проект посвящен поиску факторов фиксирующих в ходе терминации функционально активную конформацию рибосом эукариот. Выявление таких факторов позволит существенно дополнить существующие представления о процессе биосинтеза белка в клетках эукариот. Поставленная в проекте задача никем ранее не озвучивалась, вероятно, из-за методической сложности изучения терминации трансляции эукариот. В ходе выполнения проекта планируется получить различные изодекодерные тРНК, а также рекомбинантные белки Dbp5 и Gle1. Далее будет протестировано их влияние на эффективность терминации белкового синтеза в реконструированной системе трансляции. Кроме того, будут проведены эксперименты по связыванию возможных стабилизаторов терминации с реконструированными претерминационными комплексами для выявления их влияния на конформационные перестройки в рибосоме, а также эксперименты по связыванию белков Dbp5 и Gle1 с факторами терминации eRF1/eRF3 in vitro. Итогом исследований должно стать описание молекулярного механизма действия этих белков и деацилированной тРНК в процессе терминации трансляции эукариот.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта будут собраны рибосомные претерминационные комплексы в реконструированной системе трансляции эукариот, которые в дальнейшем будут использованы для определения роли различных факторов на стабилизацию конформации рибосомы при терминации трансляции. Будут получены различные изодекодерные тРНК и исследована их роль в терминации трансляции. Также будут проэкспрессированы и очищены белки человека Dbp5 и Gle1, и их мутантные формы, и определена их активность в реконструированной системе трансляции. Ожидается выяснить, в каких условиях белок Dbp5 человека индуцирует конформационную перестройку в рибосоме при терминации трансляции, и какое участие в этом принимает Gle1. В экспериментах по связыванию белков Dbp5 и Gle1 с факторами терминации eRF1/eRF3 in vitro будет определено, способны ли эти белки образовывать комплексы в растворе. Анализ полисомных профилей покажет, связываются ли данные белки с рибосомами в клетках. В результате картирования мест связывания на рибосоме белков Gle1 и Dbp5 будет построена модель взаимодействия данных белков с рибосомой и факторами терминации трансляции. Ожидаемые результаты внесут существенный вклад в описание молекулярного механизма эукариотической трансляции и откроют широкие перспективы для разработки методов регуляции биосинтеза белка в клетке. Полученные данные планируется опубликовать в виде серии научных статей.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Нами описан один из механизмов тонкой настройки процесса терминации трансляции у эукариот. Мы показали, что некоторые деацилированные тРНК, находясь в Е сайте рибосомы, увеличивают стабильность терминационных и посттерминационных комплексов. При этом в А сайте рибосомы стабилизируется именно стоп кодон распознающая часть eRF1, и от гидролиза пептидил-тРНК это не зависит. Более того, детерминанты определяющие это свойство тРНК лежат в акцепторном стебле, что удалось продемонстрировать введением мутаций в тРНКVal и получением министруктуры, повторяющей акцепторный стебель тРНК. Механизм этой стабилизации вероятно отличается от механизма фиксации рибосомы в незакрученном состоянии с помощью ССА конца тРНК или циклогексимида, занимающих Е сайт рибосомы.

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В 2015 году нами описан еще один из механизмов тонкой настройки процесса терминации трансляции у эукариот. Для этого была использована реконструированная in vitro система трансляции эукариот. Мы продемонстрировали, что белок ассоциированный с ядерной порой DDX19 человека стабилизирует фактор терминации eRF1 в рибосоме на стадии распознавания стоп кодонов. При этом в А сайте рибосомы стабилизируется именно стоп кодон распознающая часть eRF1, и от гидролиза пептидил-тРНК и связывания с фактором терминации eRF3 эта стабилизация не зависит. Более того, активация распознавания стоп кодонов не зависит от способности белка гидролизовать АТФ и связываться с РНК, что удалось продемонстрировать введением мутаций в DDX19B. Однако, связывание этого белка с рибосомой в присутствии факторов терминации зависит от присутствия АТФ в реакционной смеси.

 

Публикации

1. Иванов А., Михайлова Т., Елисеев Б, Йерамала Л., Соколова Е., Сусоров Д., Шувалов А., Шафитцел К., Алкалаева Е. PABP stimulates translation termination by proper positioning of eRF3a on the ribosome. Nucleic Acids Research, 44(16):7766-7776 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1093/nar/gkw635

2. Сусоров Д., Михайлова Т., Иванов А., Соколова Е., Алкалаева Е. Stabilization of eukaryotic ribosomal termination complexes by deacylated tRNA. Nucleic Acids Research, 43(6):3332-43 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1093/nar/gkv171

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 году нами обнаружен еще один фактор стимулирующий терминацию трансляции человека – белок Gle1. Это белок описан ранее как белок способствующий переносу мРНК через ядерную пору. Он, связываясь с РНК-хеликазой DDX19, стимулирует ее АТФазную активность. Ранее было показано, что дрожжевой гомолог белка Gle1 вовлечен в трансляцию, но механизм его работы описан не был. Мы, использовав реконструированную in vitro систему трансляции млекопитающих продемонстрировали, что изоформа 1 белка Gle1 человека активирует факторы терминации трансляции как на стадии распознавания стоп кодонов, так и на стадии гидролиза пептидил-тРНК. А изоформа 2 не вызывает активацию терминации трансляции, но эффективно связывается с претерминационными комплексами.

 

Публикации

1. Михайлова Т., Шувалова Е., Иванов А., Сусоров Д., Шувалов А., Колосов П., Алкалаева Е. RNA helicase DDX19 stabilizes ribosomal elongation and termination complexes Nucleic Acids Research, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1093/nar/gkw1239

2. Алкалаева Е., Михайлова Т. Reassigning stop codons via translation termination: How a few eukaryotes broke the dogma BioEssays, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1002/bies.201600213

3. Алкалаева Е.З., Сусоров Д.С., Михайлова Т.В., Иванов А.В., Шувалова Е.Ю., Шувалов А.В. Факторы, обеспечивающие эффективную терминацию трансляции эукариот ACTA NATURAE СПЕЦВЫПУСК, том 2, стр. 19 (год публикации - 2016)

4. Михайлова Т., Шувалова Е., Иванов А., Сусоров Д., Шувалов А., Колосов П., Алкалаева Е. Human RNA helicase DDX19 stabilizes elongation and termination translation complexes The 7th EMBO meeting advancing the life sciences, p. 327 (год публикации - 2016)

5. - Исследован механизм работы полиаденинсвязывающего белка Газета.ru, Газета.ru 14.12.2016 (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
не указано