Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Оранжевый каротиноид-протеин (ОСР) служит белком-тушителем, уменьшающим на интенсивном свету передачу энергии от фикобилисом (ФБС) к хлорофиллу в пигментном аппарате фотосинтеза у цианобактерий. С использованием известной кристаллической структуры ОСР и белков, составляющих центральную часть (ядро) ФБС, методом компьютерного моделирования, включая докинг протеинов и фолдинг белковых доменов, построена пространственная модель взаимодействия ОСР и ФБС в процессе нефотохимического тушения. Найденный геометрический сайт связывания ОСР и ФБС образован центральной выемкой в молекуле ОСР и проникающим в выемку характерным выступом на поверхности ядра ФБС, принадлежащим PBLcm-протеину. Показано, что со стороны ОСР различение сайта связывания на обширной поверхности ядра ФБС происходит благодаря пептидной петле из 60 аминокислот, входящей в составе PBLcm. Полученная модель не требует нарушения известной по рентгеноструктурным данным пространственной структуры взаимодействующих белков. С помощью молекулярной динамики, используя суперкомпьютеры «Ломоносов» и «Чебышëв» НИВЦ МГУ методом MM–PBSA (Molecular dynamics Poisson-Boltzman surface area) рассчитана свободная энергия образования комплекса. Показано, что свободная энергия имеет величину не более нескольких десятков кДж/моль, что хорошо согласуется с наблюдаемой в эксперименте обратимостью процесса тушения и небольшой устойчивостью комплекса ОСР-ФБС. Удельная свободная энергия взаимодействующих весьма гидрофильных белков примерно вдвое превышает удельную энергию их взаимодействия с водой, что свидетельствует о высокой комплементарности контактирующих белковых поверхностей. Выявленная геометрия сайта представляется оптимальной, так как PBLcm является главным концевым эмиттером энергии в ФБС и содержит наиболее длинноволновый фикобилиновый хромофор, аккумулирующий перед тушением на ОСР энергию от нескольких сот коротковолновых хромофоров ФБС. Расстояние между центрами масс принадлежащего ОСР каротиноида 3’-гидроксиэхинено (hECN) и ближайшего к нему фикобилинового хромофора PBLCM составило 24.7 Å. Благодаря установленному расстоянию, проведению квантово-химических расчетов векторов дипольных моментов перехода хромомофоров и измерению спектров поглощения и флуоресценции ОСР и ФБС нам удалось впервые разработать теоретическую основу механизма тушения ФБС. Как оказалось, наблюдаемая скорость переноса энергии от ФБС на ОСР не может быть интерпретирована в рамках индуктивно-резонансного механизма миграции энергии по теории Фëрстера. Напротив, рассчитанная скорость тушения (36 пс) в рамках экситонного механизма переноса с участием запрещенного по симметрии для прямого поглощения S1 возбужденного состояния hECN полностью соответствует экспериментально наблюдаемой высокой скорости тушения, подтверждая высокую эффективность ОСР как тушителя энергии.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
За 2015 г. получены следующие научные результаты. 1) Основное внимание сотрудников научной группы, занимающихся компьютерным моделированием, было сконцентрировано на разработке модели ядра полудисковидных фикобилисом. В нашей работе в этом году впервые получена полная надмолекулярная модель трехцилиндрового ядра. Проведен сравнительный анализ рентгенгоструктурных данных для кристаллов аллофикоцианина , полученных из 7 различных видов цианобактерий и красных водорослей. Сравнение профилей полученных 3D структур с данными электронной микроскопии (Arteni et al., 2009) позволило однозначным образом выбрать вариант трехмерной структуры. Методом молекулярного докинга белков были определены наиболее вероятные положения линкерных доменов (REP) полипептида АрсЕ. Методом молекулярного фолдинга впервые показано, что функцией петли (Loop) в составе хромофорного домена АрсЕ является участие в связывании с ОСР. В итоге собственных экспериментов по выделению и связыванию ОСР и фикобилисом, измерению их спектральных характеристик (поглощение и флуоресценция) и создания квантово-химической экситонной теории тушения, соответствующей литературным данным по пикосекундным временам процесса, предложена общая схема развития тушения при фотоактивации ОСР и ревертировании процесса в темноте (Stadnichuk et al., Photosynth.Res. 2015). 2) Тушение флуоресценции фикобилисом является обратимым процессом. В клетках цианобактерий тушение развивается за 30-90 секунд с возвратом к прежнему уровню интенсивности флуоресценции примерно за 30 минут. Однако в растворе взаимодействие ОСР и фикобилисом является почти всегда необратимым. Обратимость процесса в клетках обеспечивает низкомолекулярный (13 kDa) белок, FRP (Fluorescence recovery protein). Механизм действия FRP далек от выяснения. Недавно (Sutter et al., 2013) были получены рентгеноструктурные данные для кристаллов FRP. Несмотря на то, что в кристаллической форме белок существует в виде димеров и тетрамеров, мы предположили, что биологически активным он должен быть в виде мономера. Методами компьютерного докинга нам удалось показать, что трехмерный объем мономера FRP идеально подходит для заполнения собой полости в молекуле ОСР, которая служит для взаимодействия с фикобилисомой. Данные свидетельствуют о конкурентном механизме действия FRP на проявление фотоактивности ОСР по отношению к фикобилисоме. Еще один белок, образуемый у ряда цианобактерий вместо ОСР (Leverenz et al., 2014), назван RCP (red carotinoid protein). По своей молекулярной массе и строению он соответствует N-домену ОСР и также способен вызывать тушение. Используя методы компьютерного моделирования, мы установили, что RCP может соединяться с фикобилисомой в том же участке связывания, что и ОСР. Единство функционирования в трехмерном объеме ОСР, фикобилисом, FRP и RCP, как мы полагаем, стало очевидным. Данные опубликованы (Zlenko et al., J. Biomol. Struct. Dyn, 2015). 3) Создан принципиально новый мутант ΔРВLcm цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 со сформированной делецией N-концевого пептидного домена длиной в 260 АМК в АрсЕ-линкерном полипептиде фикобилисом. Домен является содержащим хромофор участком наиболее крупного линкерного белка фикобилисом. АрсЕ выполняет в составе фикобилисом одновременно несколько важнейших функций, являясь терминальным акцептором энергии от многих десятков других фикобилиновых хромофоров и непосредственным передатчиком энергии к фотосистеме II. Кроме того, белок скрепляет отдельные цилиндрические элементы ядра фикобилисомы, участвует в связывания ядра с боковыми фикобилисомными цилиндрами и в соединении фикобилисомы как целого с тилакоидной мембраной. Ранее, используя различные спектральные и иные методы, нам удалось показать, что хромофорный РВLcm-домен является сайтом связывания фикобилисомы и ОСР при развитии эффекта нефотохимического тушения. Как оказалось, полученный мутант отличается резким снижением возможности тушащего действия. Данный результат является важнейшим указанием на роль РВLcm-домена как сайта связывания ОСР и фикобилисомы. 4) Выясняя механизм, при котором присоединение ОСР к хромофорному домену терминального эмиттера АрсЕ вызывает тушение флуоресценции всего аллофикоцианинового ядра фикобилисомы, надо иметь ясную картину миграции энергии между различными фикобилиновыми хромофорами, составляющими ядро. Нами разработана система кинетических уравнений на основе собственных экспериментальных данных. 1. Были биохимически выделены цельные ядра фикобилисомы и аллофикоцианин, составляющий основную часть фикобилипротеиновой массы ядра. 2) При комнатной и низкой температурах измерены спектры поглощения обоих объектов. 3) Измерены соответствующие спектры флуоресценции. 4) При 77 и 293 градусах К измерены квантовые выходы флуоресценции и показано, что они практически не изменяются при изменении температуры у обоих объектов. 5) Математическая система уравнений записана в идеализированном представлении о равных энергетических зазорах между хромофорами как ступенями в разветвленных цепочках миграции. 6) В итоге показано, что система хорошо описывает наблюдаемые спектры и их различия при смене температур, если число актов миграции к терминальному эмиттеру от других хромофоров не превышает трех или четырех. Из полученных уравнений вытекает наличие в фикобилисомах обратной миграции энергии, ограниченной больцмановским фактором. Статья опубликована (Стадничук и др., Докл. академии наук, 2015). 5) При использовании кинетической схемы передачи энергии в ядре фикобилисом, аналогичной рассмотренной выше (см. п. 5) в предположении индуктивно-резонансного механизма миграции оказалось возможным в первом приближении пренебречь ее ступенчатым характером за исключением последней ступени, где энергия передается через терминальные эмиттеры от фикобилисомы к фотосистеме II или перехватывается ОСР. Удалось создать и решить систему простых дифференциальных уравнений, оперирующих во временном диапазоне от нескольких пикосекунд до нескольких десятков пикосекунд, что неоднократно установлено для фикобилисом в различных экспериментах (см. обзор Kish et al., 2015). При этом показано, что число актов миграции от любого хромофора аллофикоцианина терминальным эмиттерам в соответствии с трехмерной моделью не превышает 3-4. Иные пути миграции также возможны, но крайне маловероятны из-за резкого возрастания времени переноса возбуждения по подобным «окольным» путям. Статья опубликована (Krasilnikov et al. Biophysics, 2015). 6) С помощью квантово-химических расчетов показана возможность действия различных циклических каротиноидов, имеющих 11 конъюгированных двойных связей в составе молекулы и дополнительно к своему углеродному скелету содержащих атом(ы) кислорода, как тушителей флуоресценции и фосфоресценции хлорофилла а in vitro. При этом каротиноиды с меньшим числом связей не способны к тушащему действию. Каротиноид 3’-гидроксиэхиненон в составе ОСР принадлежит к той же группе (циклический ксантофилл с 11 двойными связями и наличием атома кислорода в гидроксиле). Кроме того, положение красной полосы поглощения длинноволного фикобилинового хромофора РВLcm-домена АрсЕ находится в области 675 нм, т. е. там же, где у хлорофилла in vivo (678 нм). Поэтому сделан вывод, что ОСР и модельные каротиноиды обладают аналогичным или даже одинаковым механизмом тушащего действия. Результаты опубликованы: Yaroshevich et al., 2015 (Comp. Theor Chem.). 7) Как показано в наших работах последних лет, для развития нефотохимического тушения ОСР примыкает своей белковой поверхностью к аллофикоцианиновому ядру фикобилисом. Этот контакт предопределяет наличие коэволюции белковых ансамблей и означает, что трехмерная структура ОСР также как и форма цилиндров фикобилисом у разных видов цианобактерий, должна быть высокостабильной. С другой стороны, известно, что часть цианобактериальных видов не содержит ОСР, указывая на вопрос о последовательности формирования фикобилисом и ОСР и причинах эволюционной утраты последнего у ряда видов. Построение филогенетического древа предполагало возможность ответа на данный вопрос. Выравнивание набора аминокислотных последовательностей (Аlignment) осуществляли в программе CLUSTAL W; деревья выстраивали в программе Neighbor joining. Для нескольких видов цианобактерий с секвенированными геномами были выстроены деревья полипептидов аллофикоцианина (ядро фикобилисом), С-фикоцианина (боковые цилиндры фикобилисом), а также коровых белков D1 и D2 фотосистемы II и L и М белков фотосистемы I. Разная форма ветвления филогенетических древ свидетельствовала о вероятной разной частоте аминокислотных замен на эволюционной временной шкале. Мы рассматриваем полученные результаты как предварительные. 8) В ж. «Микробиология» в 2015 г. опубликован обзор, посвященный свойствам фикобилисом и фикобилипротеинов. Обзор состоит из 19 основных подразделов. 1) Фикобилины. 2) Распространение билиновых пигментов. 3) Химическое строение фикобилинов. 4) Биосинтез фикобилинов. 5) Биологическое разнообразие фикобилипротеинов. 6) Полипептиды фикобилипротеинов. 7) Хромофорный состав фикобилипротеинов. 8) Агрегаты и кристаллы фикобилипротеинов. 9) Надмолекулярная структура фикобилисом. 10) Линкерные полипептиды фикобилисом. 11) Морфологические разновидности фикобилисом. 12) Пигментные типы фикобилисом. 13) Передача поглощенной энергии в фикобилисомах. 14) Связь фикобилисом с фотосистемой I и фотосистемой II. 15) Световая регуляция активности фикобилисом. 16) Медленные световые адаптации. 17). Быстрые световые адаптации. 18) Филогенетическая световая адаптация. 19) Эволюционная судьба фикобилисом. В мире ежегодно выходит по несколько десятков работ, посвященных изучению фикобилисом и фикобилипротеинов. Обилие новых результатов требует их регулярного обобщения и осмысления, благодаря чему каждые несколько лет наряду с исследовательскими работами появляются обзорные публикации. Коротко упомянем лишь три последние, 2013 и 2015 года: Watanabe M. & Ikeuchi M., 2013; Kirilovsky D. et al., 2015; Kish et al., 2015). На русском языке журнальные обзоры по данной теме отсутствуют. Наша публикация позволяет отечественному читателю восполнить этот пробел, а нам обобщить собственные экспериментальные и теоретические данные. 8) С использованием методов молекулярной динамики проведена сборка и оптимизация структуры тримеров состава: (ApcA/ApcB)2-ApcD/ApcB и (ApcA/ApcB)2-PBLCM/ApcF. В состав обоих тримеров входят АрсА и АрсВ, которые являются «обычными» альфа- и бетта-полипептидными субъединицами аллофикоцианина, образующими димер в составе диска-тримера. Первый тример содержит дополнительно полипептид ApcD — одну из двух субъединиц фикобилисом, связывающих длинноволновый терминальный эмиттер, донирующий энергию на фотосистему II . Полипептид ApcD гомологичен альфа-субъединице аллофикоцианина. Второй тример содержит полипептид, связывающий длинноволновый кофактор (PBLcm, первый глобулярный домен белка ApcE), также гомологичный альфа-субъединице аллофикоцианина. Именно этот полипептид обеспечивает непосредственный контакт фикобюилисом с ОСР при нефотохимическом тушении. Кроме того, второй из собранных тримеров содержит ApcF, гомологичный бета-субъединице и образующий димер с PBLcm. В ходе компьютерной оптимизации показана устойчивость структуры тримеров. Также проведена сборка и оптимизация структуры гексамера состава (ApcA/ApcB)6-ApcC и трех структурных вариантов гексамеров состава [(ApcA/ApcB)2-ApcD/ApcB]-[(ApcA/ApcB)2-PBLcm/ApcF]-ApcC. В состав гексаметов введена структура АрсС – концевого линкера, лишенного собственного хромофора, который кэпирует структуру цилиндров ядра ФБС. Из двух гексамеров первого типа сформирован верхний цилиндр трехцилиндрового ядра ФБС, а также дополнительные цилиндры (по сути являющиеся отдельными гексамерами) пятицилиндрового ядра. Базальные цилиндры ядра ФБС сформированы каждый из двух гексамеров первого и второго типа и имеют антипараллельную структуру, то есть два соседних нижних цилиндра ядра фикобилисомы развернуты относительно друг друга на 180 град.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
По результатам выполнения проекта №14-14-00589 в 2016 г. опубликованы три новые журнальные статьи. Четвертая статья (Zlenko et al. J. Biomol. Struct. Dyn. 2016) в печатном варианте с полной индексацией страниц также опубликована в 2016 г., но с указанием DOI вошла в отчет 2015 г. Две статьи имеют выходные данные за 2016 г. Одна из них опубликована в ведущем международном журнале по фотосинтезу, Photosynthesis Research, и вторая как приоритетная – в Докл. РАН, сер. биология. Третья статья в качестве обзора открывает собой 1-й номер академического отечественного журнала за 2017 г. «Прикл. биохим. микробиол.» и уже имеет полное указание страниц и выпуска. В соответствии с заявленным планом проекта вышла в свет монография: П.М. Красильников, Д.В. Зленко, И.Н. Стадничук «Миграция и тушение энергии в фикобилисомах цианобактерий», М. 2016. Изд. «Научный мир», 121 с. Результаты работы представлены на двух международных конференциях: 1) “Photosynthesis Research for Sustainability”, 2016, Puschino, Russian Federation; 2) 17th International Photosynthetic Congress, 2016, Maastricht, the Netherlands. Основной экспериментальный результат работы в 2016 г. – получение биохимических и спектральных характеристик принципиально нового по своей конструкции фикобилисомного мутанта, что дало важные сведения о строении и функционировании ядра фикобилисомы. Мутант, обозначенный как ΔРВLcm, с делецией N-концевого хромофорного домена длиной в 234 аминокислотных остатка в главном линкерном Lcm, или АрсЕ, полипептиде фикобилисом у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 был создан нами к концу 2015 г. Генетическая конструкция мутанта подробно описана в отчете за 2015 г. АрсЕ в фикобилисоме является терминальным акцептором энергии от нескольких сот более коротковолновых хромофоров и переносчиком аккумулированной энергии к хлорофиллу. Кроме того, АрсЕ скрепляет три цилиндра ядра и присоединяет ядро фикобилисомы к тилакоидной мембране (отсюда аббревиатура Lcm – core-membrane Linker). Получение бесхромофорных или иных мутаций для АрсЕ ранее оканчивалось неудачей, так как генетическая инактивация цельного АрсЕ вела к нарушению самосборки и утрате фикобилисом в клетке, а точечные замены отдельных аминокислот сохраняли хромофор. Созданная конструкция мутанта с большим элиминированным хромофорным доменом привела к успеху. Проведенные спектральные измерения мутанта с утратившим хромофор АрсЕ-полипептидом выявили два его важнейших свойства. Как и предполагалось, в мутантных клетках утрачивается фотозащитное действие ОСР, что служит одним из решающих доказательств того, что удаленный РВLcm-домен является сайтом связывания ОСР и фикобилисомы. Кроме того, флуоресцентные измерения показали, что мутантные клетки избирательно теряют возможность передачи поглощенной энергии от фикобилисом к фотосистеме 2, сохраняя связь с фотосистемой 1, чем определяется вторая найденная функция РВLcm-домена. В качестве приоритетных результаты в кратком изложении опубликованы в статье: Еланская и др. (Докл. РАН, сер. Биология, 2016). Англоязычная полная версия статьи подготовлена для публикации в 2017 г. Еще один важный результат – создание виртуальной объемной конструкции ядра фикобилисомы и на этой основе – не имеющей стерических противоречий модели взаимодействия фикобилисомы с ОСР, с фотосистемой 2 и фотосистемой 1. Тушащее действие ОСР основано на быстром экситоном переносе энергии от терминального эмиттера фикобилисом к каротиноидному хромофору ОСР (Stadnichuk et al., Photosynth Res. 2015) в конкуренции с более медленной миграцией энергии по Ферстеру между фикобилиновыми хромофорами. Важнейшим параметром для любого механизма миграции служит расстояние между соседними хромофорами. Параметры известны для закристаллизованных тримеров аллофикоцианина, но не для трех цилиндров, составляющих ядро фикобилисомы, и не для расстояний между терминальными эмиттерами фикобилисомного ядра и молекулами хлорофилла фотосистем 1 и 2, куда должна перетекать энергия. В собранной из тримеров аллофикоцианина модели ядра были учтены особенности различных кристаллов аллофикоцианина, содержащихся в PDB (Protein Data Bank), варианты создания гексамеров, составляемых из парных тримеров, возможные сочетания гексамеров для создания из них трех цилиндров ядра и размещение терминальных эмиттеров в двух базальных цилиндрах. Созданная модель фикобилисомы с помощью докинга была присоединена на поверхности тилакоидной мембраны к димеру фотосистемы 2 и независимо – к пигмент-белковому комплексу фотосистемы 1. Расстояние от терминальных эмиттеров фикобилисомы до ближайших молекул антенного хлорофилла в обоих случаях не превысило 33-38 ангстрем, соответствуя возможностям ферстеровской миграции энергии и отсутствию стерических препятствий для размещения молекулы ОСР с сохранением возможности тушения. Важной особенностью модели стало заключение о том, что фикобилисомы присоединяются лишь к мономерным комплексам фотосистемы 1 и не способны из-за нарушения билатеральной симметрии в тримерах размещаться на их поверхности. Эти данные впервые представляют объяснение одновременному присутствию мономеров и тримеров фотосистемы 1 в тилакоидах цианобактерий. Подробно создание объемной модели фикобилисомного ядра излагается в работе Zlenko et al. (Photosynth. Res. 2016). 3) В монографии П.М. Красильникова, Д.В. Зленко, И.Н. Стадничука «Миграция и тушение энергии в фикобилисомах цианобактерий» (Изд. «Научный мир» М. 2016. 121 с.) излагаются собственные экспериментальные данные, полученные за три года выполнения проекта и за несколько предыдущих лет исследований, и данные мировой литературы по вопросам, вынесенным в заголовок книги. Книга состоит из пяти глав, содержит список литературы, схемы, рисунки, необходимые системы уравнений и теоретические выкладки. Первая глава имеет 19 разделов и описывает общие свойства фикобилисом и фикобилипротеинов. Во второй главе излагаются молекулярно-динамические расчеты устойчивости образуемого комплекса ОСР и фикобилисомы. В третьей - подробно описывается выявленный нами в спектральных экспериментах и обоснованный теоретически экситонный механизм передачи энергии от терминального хромофора в фикобилисомном ядре к молекуле каротиноида в составе ОСР и последующее тушение возбуждения в результате тепловой диссипации. Четвертая глава, имеющая 6 разделов, содержит сведения о надмолекулярном строении ядра фикобилисом и стратегии его компьютерной сборки. Излагаются особенности строения, позволяющие фикобилисомам взаимодействовать как с фотосистемой 2, так и с фотосистемой 1 и одновременно – с ОСР. В пятой главе анализируются пути прямой и обратной миграции энергии между отдельными хромофорами в составе фикобилисом. В разделе «Заключение» обрисовываются нерешенные вопросы изучения фикобилисом и возможные пути их решения. 4) В дополнение к заявленному на 2016 г. плану работы опубликован обзор, посвященный биотехнологическому использованию фикобилисом и фикобилипротеинов. В ходе сбора материалов было накоплено много дополнительных данных, выходящих за пределы заявленной темы монографии. В мире насчитывается более 200 патентов, связанных с использованием фикобилипротеинов в разных областях науки, медицины и промышленности. При почти полном отсутствии отечественной литературы в данной области собранный материал был принят к печати в журнале «Прикладная биохимия и микробиология». С тематикой проекта наиболее близко соотносится применение фикобилипротеинов как флуоресцентных зондов и меток, в частности в клеточных сортерах и в иммунодиагностике. Фикобилисомы, имея малые размеры и сотни фикобилиновых хромофоров, являются природными квантовыми точками с широкими биотехнологическими перспективами использования. Другой важной биотехнологической областью является применениеие, прежде всего С-фикоцианина, как иммунопротектора и иммуномодулятора, так как фикобилиновые хромофоры, сходные по строению с пигментами желчи, обладают антиоксидантыми свойствами, нейтрализуя активные формы кислорода. Исследователи, интересующиеся вопросами биотехнологии, могут подробно ознакомиться с изложенным материалом по ссылке: И.Н. Стадничук, И.В. Тропин. Прикл. биохим. микробиол. 2017. Т. 57. № 1. С. 5-15.