Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В рамках заявленной темы по гибридогенному видообразованию исследования проводились на двух модельных системах: партеногенетические виды ящериц рода Darevskia и паразитические черви – трематоды рода Trichobilharzia. Для решения вопроса о том, какие изменения генома ассоциированы с переходом от бисексуального к однополому (партеногенетическому) способу воспроизводства, нами впервые поставлена и решалась задача по секвенированию de novo геномов трех видов ящериц рода Darevskia: партеновида D. unisexualis и двуполых родительских видов D. nairensis (материнский вид) и D. valentini (отцовский вид). Были приготовлены 9 образцов ДНК,- по три каждого вида,- и на их основе сконструировано 9 shotgun библиотек с размером фрагментов 350 п.н. (Illumina TruSeq DNA PCR Free). На ДНК партеновида D. unisexualis были также сконструированы две инвертированные (mate-pair) библиотеки с размером фрагментов 3 т.п.н. и 8 т.п.н. (Illumina Nextera). Секвенирование бибилиотек проведено на приборе Illumina Hiseq 2000, используя набор реагентов 100 bp PE reads v3. Секвенирование shotgun-библиотеки D. unisexualis проведено с 54-кратным покрытием и генерировало 145 Гб «сырых» сиквенсов. Секвенирование инвертированных библиотек было проведено с 16-кратным покрытием. Секвенирование библиотек двуполых ящериц D. nairensis и D. valentini было сделано с 34-кратным покрытием и генерировало по 93 Гб «сырых» данных для каждого вида. Для остальных 6 shotgun библиотек (по 2 образца каждого вида) секвенирование сделано с 5-кратным покрытием. На базе Центра геномной биоинформатики им. Ф.Г. Добржанского была проведена оценка качества полученных данных с использованием программ FastQC. Все риды со значением качества Q˂20 после фильтрации и нормирования были исключены из дальнейшего анализа. По данным K-mer размерностей в данных по секвенированию был построен график качества PE-чтений, демонстрирующий высокую гетерозиготность генома D. unisexualis. Сборку генома проводили с помощью программы Platanus Genome Assembler, v1.2.1. К настоящему моменту проведена сборка генома D. unisexualis на уровне 1.4 млрд.п.н. В целом, уже полученные данные говорят о высокой гетерозиготности генома партеновида и подтверждают его гибридное происхождение. С целью определения клонального разнообразия партеногенетических ящериц D. rostombekovi (n=42) и D. armeniaca (n=128) было проведено микросателлитное генотипирование их популяций из различных регионов Армении. По каждому микросателлитному локусу были выявлены и секвенированы аллельные варианты, которые различались по строению микросателлитных локусов и фиксированными однонуклеотидными вариациями вне кластера. Используя комбинации аллелей каждого локуса были установлены генотипы для каждой особи популяций D. rostombekovi и D. armeniaca. В результате было детектировано 5 и 24 генотипов в выборках D. rostombekovi и D. armeniaca, соответственно. Особи с одинаковыми генотипами составляли индивидуальные клональные линии. Среди них у D. rostombekovi был выявлен один мажорный, два редких и один интермедиатный клон. У D. armeniaca детектировано 3 мажорных, 20 редких и один интермедиатный клон. Мажорные клоны представлены большим количеством особей из разных популяций. Редкие клоны представлены одной или несколькими особями и ограничены одной или двумя популяциями. С целью определения структуры и полиморфизма ретротранспозона Bov-B LINE у видов с клональным типом размножения, проведено клонирование, секвенирование и сравнение гена обратной транскриптазы (RT-домена) этого элемента у трех видов ящериц – партеновида D. unisexualis и двуполых родительских видов D. nairensis и D. valentini. Всего было секвенировано 94 последовательности трех видов. Геномы каждого из трех видов не отличались между собой по соотношению транскрипционно активных и неактивных копий RT-домена. На основании полиморфизма 69 потенциально активных копий RT-домена трех видов было построено дерево, отражающее их генетические различия. Все копии RT формируют один большой кластер, что подтверждает монофилетическое происхождение видов. Внутри основной группы были выделены обособленные кластеры родительских видов и распределение среди них последовательностей партеновида, подтверждающее гибридное происхождение последнего. Для дифференциации четырех европейских видов птичьих шистосом Trichobilharzia franki, T. regenti, T. szidati и T. sp. Var narochanica были разработаны ПЦР-праймеры, амплифицированы, клонированы и секвенированы последовательности, храктеризующие изменчивость каждого вида (всего 89 последовательностей). Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей показало значимое сходство этих последовательностей с известными аминокислотными последовательностями ревертазного домена двух видов шистосом млекопитающих – S. mansoni и S. japonicum, относящихся к классу Penelope-like мобильных элементов. Филогенетическое дерево, построенное на основе полученных нами RT-like последовательностей позволяет дифференцировать все четыре вида птичьих шистосом.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В рамках заявленной темы по гибридогенному видообразованию работа проводилась на двух модельных системах: партеногенетические виды ящериц рода Darevskia и паразитические черви-трематоды рода Trichobilharzia. Для выявления геномных изменений, сопровождающих переход от бисексуального к однополому (партеногенетическому) способу воспроизводства были продолжены эксперименты по секвенированию de novo геномов трех видов ящериц рода Darevskia: партеновида D. unisexualis и двуполых родительских видов D. nairensis (материнский вид) и D. valentini (отцовский вид). Для образца D. unisexualis была сконструирована библиотека с размером фрагментов до 20 т.п.н. (SMRTbell Template Prep Kit 1.0). Секвенирование библиотеки проводили на приборе PacBio RS (Pacific Biosciences of California, Inc., USA) с использованием реагентов DNA Sequencing Kit 4.0 (PacBio). Для видов D. valentini и D. nairensis сконструировано по две инвертированные (mate-pair) библиотеки с размером фрагментов 3 т.п.н. и 8 т.п.н. (Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit). Качество приготовленных библиотек контролировали при помощи биоанализатора 2100 Bioanaliser (Agilent, США). Секвенирование полученных инвертированных библиотек проводилось на приборе Illumina HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA) с использованием набора реагентов Illumina 100 bp PE reads v3. Оценка качества полученных данных осуществлялась с использованием программы FastQC. Все последовательности со значением качества ниже Q<20 после фильтрации и нормирования исключены из дальнейшего анализа. Используя эти и ранее полученные данные секвенирования в общей сложности 6 библиотек партеновида и по 5 библиотек каждого двуполого родительского вида, была выполнена работа по сборке de novo геномов трех видов ящериц. Сборку геномов партеновида D. unisexualis и двуполых видов D. nairensis и D. valentini проводили с помощью программы для анализа гетерозиготных геномов Platanus Genome Assembler (version 1.2.1)(Kajitani R. Et al. Efficient de novo assembly of highly heterozygous genomes from whole-genome shortgun short reads. Genome Research 24: 1384-95). Таким образом, на данном этапе выполнена сборка de novo геномов трех видов ящериц. Это позволяет на следующем этапе начать аннотацию генов и различных генетических элементов в геноме этих видов. Эксперименты по генотипированию однополых и двуполых ящериц выполнялись с целью определения генетической и клональной (для однополых) структуры этих видов и популяций. Это является базисом для последующих полногеномных исследований наиболее интересных видов, клональных линий однополых и родительских популяций, участвующих в межвидовых гибридизациях. Определение клонального разнообразия партеновида D. unisexualis проведено с помощью генотипирования 68 особей из 5 популяций Армении по трем микросателлитным локусам. Были выявлены и секвенированы аллели каждого локуса и на основе их комбинаций установлены генотипы для всех особей. В результате было детектировано 7 клонов, различающихся по генотипам и по распределению в популяциях. Кроме того, были выявлены и секвенированы аллели гомеологичных локусов у двуполых родительских видов D. raddei и D. valentini и установлено какие из них наследованы партеновидом D. unisexualis. Были также выявлены и секвенированы аллели гомеологичных локусов у двуполого вида D. portschinskii, который, как и D. raddei является родительским видом для другого партеновида – D. rostombekovi. Сравнительный анализ аллелей трех локусов партеновида и родительских видов позволил и в этом случае определить, какие из родительских аллелей наследованы D. rostombekovi. Полученные данные могут быть использованы для определения клональной структуры D. rostombekovi, изучения филогенетических связей между партеновидами и остальными представителями рода Darevskia, оценки дивергенции этих видов. Была продолжена работа по определению структуры и полиморфизма ретротранспозона Bov-B LINE у партеновида D. unisexualis и его родительских видов. Ранее (2014 г.) были клонированы и секвенированы последовательности ретротранспозона Bov-B LINE размером 1.8 т.п.н., содержащие ген апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы. Всего было секвенировано 38 копий D. unisexualis, 27 копий D. nairensis и 29 копий D. valentini. Фрагменты АП-эндонуклеазы (0,348 kb) в составе ретротранспозона выявляли, используя алгоритмы blastn, blastx и tblastx (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и программы MEGA6 (Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729). Для анализа полиморфизма последовательностей АП-эндонуклеазы генетическую дивергенцию копий для каждого вида рассчитывали в программе для статистических расчетов R (https://www.r-project.org). Были получены гистограммы, которые показывают распределение частот значений попарных дистанций нуклеотидных последовательностей АП-эндонуклеазы каждого вида. Отцовский и материнский виды образуют одиночные пики с одинаковыми средними значениями попарных дистанций. У D. unisexualis обнаружено два четких пика, что соответствует его гибридной природе, т.к. одну часть последовательностей он получает от отцовского вида, а другую часть – от материнского. Полученные данные о полиморфизме ретротранспозона Bov-B LINE, в частности, последовательностей АП-эндонуклеазного домена, могут быть использованы для определения филогенетических связей в группе рептилий. Популяционные и полногеномные исследования птичьих шистосом направлены на выявление возможных событий межвидового скрещивания в группе кровяных сосальщиков птиц рода Trichobilharzia, а также на получение новой информации о формировании гостальной специфичности в системе паразит-хозяин. Изучение ревертазных генов птичьих шистосом было продолжено на примере вида Trichobilharzia szidati. Основной задачей было выяснение особенностей внутригеномной, гостальной и географической специфичности в распределении копий этих генов с разной структурой, относящихся к семейству Penelope-like элементов. Были клонированы и секвенированы 40 таких последовательностей при использовании свободных церкарий или отдельных спороцист 6 изолятов T. szidati, которые инфицировали трех моллюсков L. stagnalis и трех моллюсков L. palustris. Оценки генетической гетерогенности инфрапопуляций T. szidati, полученные на основе расчета генетических дистанций для каждой пары последовательностей показали, что значение дивергенции между парами варьирует от 0 до 21%. Анализ структурных особенностей 40 RT-like копий генома птичьей шистосомы T. szidati показал, что все они относятся к неактивным копиям, так как содержат либо стоп-кодоны, либо делеции, которые могут нарушать рамку считывания RT. Сравнивая генетическую гетерогенность церкарий из одной спороцисты мы показали, что в составе одного генома птичьей шистосомы T. szidati могут одновременно присутствовать три группы копий близкородственных последовательностей. Максимальная внутригеномная дивергенция достигает 9% и характерна для инфрапопуляций паразита из двух моллюсков L. palustris (Карелия). Распределение этих копий в шести инфрапопуляциях моллюсков свидетельствует об отсутствии гостальной специфичности, т.е. приуроченности копий с определенными генотипами к одному из двух видов промежуточных хозяев-моллюсков. В отчетный период были выполнены задачи по получению клеточных РНК и ДНК из церкариальных изолятов птичьих шистосом. За период с 1 по 15 июля нами собраны и зафиксированы 12 изолятов шистосом, принадлежащих к видам B. polonica (n=2), T. szidati (n=3) и 10 изолятов шистосом рода Trichobilharzia, паразитирующих на моллюсках рода Radix. Видовая идентификация изолятов последней группы проводилась на основании последовательности ITS2 рДНК. Шистосомы вида B. polonica (которые являются внешней группой при изучении других шистосом) были использованы для получения клеточной ДНК. Shortgun библиотеки ДНК B. polonica получали при помощи набора NEB E6000. Качество библиотек оценивали на биоанализаторе 2100 Bioanalyser (Agilent, США). Секвенирование проводили на секвенаторе HiSeq 1500 (Illumina) в режиме RAPID run 2х150+6 с 54-кратным покрытием. Все последовательности со значением качества Q<20 после фильтрации и нормирования были исключены из дальнейшего анализа. Полученные сиквенсы планируется использовать для выявления последовательностей митохондриального генома B. polonica и для сравнения с сиквенсами шистосом T. szidati, T. franki и T. narochanica (планируемые работы 2016 г.). Это позволит определить возможные пути предполагаемых межвидовых скрещиваний в этой группе птичьих шистосом. Шистосомы T. szidati были использованы для выделения клеточной РНК и получения кДНК-библиотеки. РНК выделяли из фиксированных церкарий шистосом при помощи реагента Trisol с последующим использованием набора Ribo zero (Epicenre, USA). Библиотеку кДНК получали при помощи набора NEB E6100 (NEBNext® mRNA Library Prep Reagent Set for Illumina, Sigma-Aldrich) согласно протоколу производителя. Секвенирование кДНК проводили на HiSeq 1500 в режиме RAPID run 2x150+6. Для кДНК T. szidati было получено 121447031 пар ридов. Для сборки последовательностей использовали ассемблер Trans-ABySS 1.4.4 (de novo assembly of RNA-Seq data using ABySS). Полученные сиквенсы кДНК предполагается использовать для выявления транскриптов различного типа (например, ретроэлементов) и определения их структурных особенностей.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В рамках заявленной темы по изучению гибридогенного видообразования на этапе 2016 года была продолжена работа по структурно-функциональному анализу геномов двух модельных систем: партеногенетических и двуполых видов ящериц рода Darevskia и паразитических червей-трематод рода Trichobilharzia. С использованием комплексного подхода - поиск гомологии с известными генами и предсказание de novo - аннотированы белок-кодирующие элементы генома ящериц рода Darevskia. После проверки по базам данных белковых последовательностей (Pfam, Swiss-Prot) обнаружено 27079 и 25256 белок-кодирующих генов в геномах ящериц D.nairensis и D.valentini соответственно. Проведён поиск и первичная классификация консенсусных последовательностей повторяющихся элементов генома партеновида D.unisexualis и двуполых родительских видов D.valentini и D.nairensis. В геноме D.unisexualis было обнаружено 4 430 457 последовательностей повторяющихся элементов, в геноме D. valentini - 1 578 898 последовательностей, в геноме D. nairensis — 1 718 593, занимающих соответственно 30.07%, 33.44%, 34.37% генома. GC-состав повторяющейся фракции примерно одинаков во всех трёх геномах и составляет 43.9%. Проведена сравнительная оценка встречаемости длинных диспергированных элементов (LINEs) семейства RTE. Во всех трёх геномах существенных отличий по частоте встречаемости RTE-ретротранспозонов не наблюдается. В представленности различных семейств LINEs (в пересчёте на 1 Gb) между видами рода Darevskia различия минимальны. Среди семейств чаще встречаются L2 и CR1 (245-260 тыс. копий на 1 Gb и 242-249 тыс. копий на 1 Gb, соответственно), очень редко встречаются ретротранспозоны семейства Jockey — 356-446 копий на 1 Gb. Ретроэлементы семейства BovB встречаются в геномах D.unisexualis и D.nairensis в количестве 137.5 тыс. копий на 1 Gb, а в геноме D.valentini — 119.4 тыс. копий на 1 Gb. На основе анализа структурного полиморфизма ретроэлемента Bov-B LINE были рассмотрены филогенетические взаимосвязи между ящерицами рода Darevskia и другими рептилиями. Топология деревьев, построенных на основании нуклеотидных или транслированных аминокислотных последовательностей гена обратной транскриптазы (RT) Bov-B LINE, сходна для всех ящериц и не противоречит основным результатам генетической дифференциации змей и ящериц из отряда Squamata. Таким образом, последовательности гена RT ретротранспозона Bov-B могут быть использованы для родовой и видовой диагностики ящериц и змей, а также для выяснения филогенетических связей в группе рептилий. Для выявления генотипов гибридного и мутационного происхождения и определения сценария возникновения генотипического разнообразия у партеновида D.rostombekovi проведено генотипирование 42 особей D. rostombekowi из 4 популяций Армении с использованием трёх микросателлитсодержащих локусов ядерного генома. Выявлено 5 генотипов (клонов), различающихся по частоте и географическому распространению и имеющих общее происхождение – как результат одного акта межвидовой гибридизации родительских двуполых видов. Предполагается, что отдельные особи с идентичными генотипами представляли отдельные клональные линии. Проведена работа по определению взаимосвязей между выявленными генотипами, используя изменчивость нуклеотидных последовательностей микросателлитных ДНК. Отличия между особями клональных линий касались только строения микросателлитных областей аллелей изученных локусов. Согласно имеющимся представлениям о происхождении клонального разнообразия у видов с однополым типом размножения, наиболее географически распространенный клон считается исходным, от него в результате различных мутаций в микросателлитах возникают другие, менее распространенные клоны. На основании впервые полученных нами данных полногеномного секвенирования партеновида D.unisexualis по технологиям Illumina HiSeq 2000 и PacBio RS II была определена структура митохондриального генома, представляющего собой кольцевую ДНК длинной 21 433 bp. с 13 предсказанными белок-кодирующими генами, двумя генами рибосомальной РНК – 12s и 16s, 20 тРНК, двумя псевдогенами тРНК и сложным тандемным повтором с мономером 59 bp, повторяющимся 70.6 раза и расположенном в начале контрольного региона (CR). Это первый представитель митохондриальных геномов у Кавказских скальных ящериц рода Darevskia (семейства Lacertidae) и новый пример структурных вариаций в митогеноме ящериц гибридного происхождения. В рамках анализа геномов паразитических червей-трематод рода Trichobilharzia получены и секвенированы shotgun библиотеки птичьих шистосом T. szidati, T. franki и T.narochanica. Проведена предварительная сборка митохондриального генома всех трёх видов и показано, что его размер составляет 14543 bp (T. mergi), 14131 bp (T. franki) и 14303 bp (T. szidati). Все три вида не отличаются между собой по числу и взаиморасположению кодирующих участков. Они содержат два гена рРНК (rrnaS, rrnaL), гены 23 тРНК и 12 белок-кодирующих генов. Аналогичный состав и аранжировку имеет единственный известный митохондриальный геном еще одного вида этого рода – Trichobilharzia regenti (Ac.number NC_009680.1). Различия в длине сравниваемых митогеномов у четырех видов одного рода связаны с вариабельностью длины некодирующих участков, содержащих до трех тандемных или диспергированных повторов. Определена последовательность митохондриального генома птичьей шистосомы B. polonica, размер которого составил 14336 bp. По своему составу и аранжировке генов исследуемый вид также не отличается от близкородственного вида Trichobilharzia regenti. Установлены канонические последовательности и дана характеристика структурных особенностей мобильных элементов группы Penelope-like ретроэлементов (PLE) в известном геноме азиатской шистосомы млекопитающих Schistosoma japonicum. Предложен подход к поиску PLE обнаруживший в данном геноме новую, неизвестную ранее группу последовательностей Penelope. Все обнаруженные нами PLE принадлежат семейству Penelope/Poseidon. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей канонических PLE (RT-, линкерный и EN-домены), показал, что весь их массив надежно разделяется на две клады. Межгрупповые различия сосредоточены преимущественно в последовательности ревертазного домена.