Аннотация результатов, полученных в 2014 году
При реализации первого этапа проекта была изучена возможность создания дрожжевых клеток-киборгов, покрытых керамическими и кремниевыми наночастицами. С использованием гиперспектральной микроскопии было показано распределение наночастиц на поверхности клеток дрожжей. Кроме того расположение керамических и кремниевых наночастиц и их распределение было изучено с использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ). В рамках работы над проектом был разработан метод стабилизации серебряных наночастиц катионными полиэлектролитами. Серебряные наночастицы были синтезированы с использованием цитратного метода, а затем стабилизированы с применением PAH, PDADMAC и РЕI – положительно заряженных синтетических полимеров, часто используемых при изготовлении многослойных полимерных плёнок, в том числе для модификации клеточной поверхности. Были изучены изменения дзета-потенциала и гидродинамических размеров полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ. Наблюдалась реверсия дзета-потенциала на противоположно-заряженный в случае полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ по сравнению с цитрат-стабилизированными. Гидродинамические диаметры полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ, измеренные с помощью динамического рассеяния света, были значительно больше, чем основные размеры, измеренные с помощью электронной микроскопии, что объясняется некоторой агрегацией и формированием полимерной оболочки. Выявлено, что полиэлектролитное покрытие не влияет на морфологию металлического ядра. С использованием гиперспектральной микроскопии были получены гиперспектральные изображения и соответствующие спектральные библиотеки полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ. Выявлено, что наночастицы хорошо видны на гиперспектральных изображениях, в то время как их спектральные профили значительно отличаются, что позволяет дифференцировать различные типы покрытий. Было проведено одноэтапное покрытие клеток PE-AgНЧ для формирования клеток-"киборгов" – гибридных коллоидных микрочастиц, состоящих из микробных клеток и нанопленок\наночастиц, покрывающих клеточную стенку. Было выявлено, что положительно заряженные полиэлектролит-стабилизированные AgНЧ легко адсорбируются на клеточные стенки дрожжей и бактерий, изменяя при этом значения дзета-потенциала клеток. Определены оптимальные условия по модификации клеточных стенок (при мониторинге изменения дзета-потенциала клеток в реальном времени). С использованием темнопольной микроскопии для визуализации полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ, нанесенных на клеточные стенки дрожжей и бактерий, выявлено, что полиэлектролит-стабилизированные AgНЧ эффективно иммобилизовались на клеточных стенках. Плотность покрытия была явно выше в случае бактерий, что связано с более высоким общим отрицательным зарядом бактерий и пространственным соответствием объединения НЧ с клетками. Данные атомно-силовой микроскопии подтверждают сохранение морфологии AgНЧ-покрытых клеток, при этом наночастицы локализованы на клеточных стенках. Для определения биосовместимости полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ были использованы репрезентативные тесты оценки жизнеспособности. Эффекты полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ были протестированы с использованием двойного флуоресцентного окрашивания. Выявлено, что РАН-AgНЧ и PDADMAC-AgНЧ не оказывают какого-либо существенного токсического действия на микробные клетки по сравнению с контрольными образцами. Были обнаружены почкующиеся клетки, что указывает на то, что полиэлектролит-стабилизированные AgНЧ не образуют плотных оболочек, препятствующих почкованию клеток. Установлено, что максимальной токсичностью обладают PEI-модифицированные наночастицы. Результаты исследования кривых роста бактериальных клеток и дрожжей показали, что токсичность полиэлектролит-стабилизированных AgНЧ менее существенна, чем в случае цитрат-стабилизированных наночастиц. Кроме того, была исследована токсичность чистых полиэлектролитов и выявлено, что РАН не токсичен в концентрации 0,5-2% (типичной для методов покрытия поверхности клеток), и даже способен стимулировать рост клеток E. coli и дрожжей, в то время как PDADMAC и PEI подавляли рост клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что полиэлектролиты при низких концентрациях (необходимых для эффективного покрытия НЧ) не токсичны в отношении бактерий и дрожжей, и могут быть применены для инженерии клеточной поверхности жизнеспособных пролиферирующих клеток. Среди исследованных полимеров РАН представляется наиболее биологически совместимым, в то время как PDADMAC и PEI более токсичны, что должно быть принято во внимание при применении методов инженерии клеточной поверхности. Общая оценка токсичности, вызванной полиэлектролит-стабилизированными AgНЧ, с использованием ферментативного анализа/теста на целостность мембраны, и более сложный анализ роста показали, что их биосовместимость очень высока. Микробные клетки-«киборги», полученные с использованием полиэлектролит-стабилизированных наночастиц, были использованы в качестве «умной» пищи для нематоды C. elegans. Благодаря возможности их визуализации с применением темнопольной и гиперспектральной микроскопии и полученных ранее спектральных библиотек описано распределение функционализированных бактериальных клеток в организме микроскопического червя и их преимущественная локализация. Также были проведены работы по формированию клеток-«киборгов» на основе культивируемых клеток человека и изучена токсичность PAH-стабилизированных AgНЧ по отношению к данным клеткам. Гиперспектральная микроскопия функционализированных клеток А549 показала, что клетки покрыты однородным слоем PAH-стабилизированных AgНЧ. Наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между интенсивностью покрытия и концентрацией вводимых наночастиц. При максимальной концентрации PAH-стабилизированных AgНЧ (210 мкг/мл) клетки А549 покрывались полностью. По мере снижения количества вводимых наночастиц, уменьшалась и площадь покрытия клетки. При инкубации клеток А549 с наночастицами серебра в трех вариантах в диапазоне концентраций от 0.8 до 105 мкг/мл показано, что концентрация AgPAH, ингибирующая на 50% суммарную активность митохондриальных дегидрогеназ (IC50) составляет 52.5 мкг/мл, подавление активности наблюдается уже при короткой одночасовой инкубации. Наиболее сильное влияние на жизнеспособность клеток было выявлено при одновременном засеве клеток А549 и наночастиц серебра. По результатам исследований опубликовано две статьи в международных журналах, принята в печать одна статья в российском журнале, подана в печать одна статья в международном журнале. Результаты исследования представлены на международных и всероссийских конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Осуществлена детальная характеристика топографии и механических свойств ряда алюмосиликатов с использованием атомно-силовой микроскопии, в том числе определен характер формирования и установлены морфологические особенности структуры полости нанотрубок галлуазита. Впервые были проведены эксперименты по исследованию острой токсичности наноразмерных алюмосиликатов (керамических наночастиц - каолина, галлуазита, монтмориллонита, бентонита, а также наносфер оксида кремния) с использованием в качестве модельного объекта инфузорий Paramecium caudatum. В качестве наноматериала с высоким уровнем токсичности использовали гидрофильные наночастицы оксида графена. Выбор наноматериалов и концентраций обусловлен промышленным потенциалом указанных наночастиц, активно используемых в промышленности и биомедицине. Оксид графена является одним из наиболее перспективных углеродных материалов, в связи с чем необходимо осуществить детальное изучение его токсичности в отношении водных беспозвоночных. В работе определен характер поглощения, осуществлена характеристика распределения наноматериалов в организме инфузорий. Установлено, что некоторые из исследованных алюмосиликатов (галлуазит, каолин и монтмориллонит) не оказывают значительного токсического эффекта на организм инфузории P. caudatum даже в максимальных концентрациях. При этом клетки сохраняют жизнеспособность и нормальную двигательную активность. Однако наносферы оксида кремния и наночастицы бентонита оказывают слаботоксичное действие и вызывают резкое снижение двигательной активности. Оксид графена, при изучении в сравнимых концентрациях, оказывает токсичное действие. При оценке подвижности инфузории малоподвижны, единичные клетки лизировались, иногда полностью теряли подвижность. В более высоких концентрациях оксид графена оказывает острое токсичное действие на парамеции. При этом необходимо отметить, что в целом инфузории P. caudatum оказались значительно менее восприимчивыми к оксиду графена в сравнении с культурами клеток человека и микроорганизмами. Осуществлена оценка влияния алюмосиликатных наноматериалов на размножение инфузорий. В присутствии галлуазита скорость размножения инфузорий практически не отличается от контроля (во всем диапазоне концентраций. Однако каолин и монтмориллонит в максимальной концентрации вызывают угнетение размножения инфузорий. Особое внимание уделяли исследованию поведенческих реакций простейших. При изучении хемотаксиса у парамеций обнаружено, что инфузории демонстрируют положительный хемотаксис в отношении галлуазита, каолина и монтмориллонита, однако при этом наблюдается отрицательный хемотаксис в отношении бентонита и оксида кремния. В присутствии оксида графена инфузории, проявляют резко отрицательный хемотаксис, при этом необходимо отметить, что меньшие концентрации не вызывали резкого отрицательного хемотаксиса. Проведены пилотные эксперименты по изучению взаимодействия алюмосиликатов и оксида графена на генетический аппарат инфузорий. При исследовании макронуклеуса в присутствии алюмосиликатов деформаций ядра не выявлено, а в присутствии графена наблюдается незначительная деформация в виде растяжения ядра. При оценке перекисного окисления липидов и активности каталазы в присутствии алюмосиликатов не выявлено достоверных отличий, а в присутствии оксида графена наблюдается увеличение окислительного стресса и снижение активности каталазы. Фагоцитарную активность алюмосиликатов исследовали в максимальной концентрации. Наилучшим образом фагоцитарная активность у инфузорий выражена в отношении галлуазит, каолин и монтмориллонита, при этом в отношении оксида кремния и бентонита фагоцитарная активность снижена. Фагоцитарную активность парамеций в присутствии оксида графена оценить не удалось, так как под действием графена (в диапазоне исследованных концентраций) нарушается процесс формирования пищеварительных вакуолей. Аналогичные эксперименты были проведены с использованием олигохеты Aeolosoma hemprichi. Необходимо подчеркнуть, что ранее такого рода исследования (оценка токсичности наночастиц) с помощью данного организма не проводили. Например, нами была установлена продолжительность жизни эолосомы (33 дня), показано применение ингибиторов клеточного деления для предотвращения деления олигохет. Изучено влияние ряда модельных наноматериалов (наночастицы серебра, галлуазита, оксида графена и углеродных нанотрубок) на жизнеспособность, размножение и поведенческие реакции аэлосом. Разработан метод сочетанной доставки и визуализации наноматериалов в культивируемых клетках человека с использованием темнопольной и гиперспектральной микроскопии. Был изучен характер распределения широкого спектра наноматериалов (наночастицы благородных металлов, оксидные наночастицы, углеродные нанотрубки (одностенные и многостенные, солюбилизированные с использование ряда полимеров). Исходя из полученных данных можно предположить, что из всех представленных алюмосиликатов наименее токсичными являются галлуазит и каолин. Токсичность оксида графена должна быть исследована дополнительно, в последующих экспериментах в меньшем диапазоне концентраций, для детального определения механизма проникновения и воздействия на клетки. Получены сфероиды из культуры клеток А549, предварительно клетки были функционализированы магнитными наночастицами, стабилизированными положительно заряженным полиэлектролитом полиаллиламином (РАН). В рамках биомедицинского анализа токсичности наноматериалов была изучена цитотоксичность частиц нанокомпозита 3MTMESPETMFiltekTMUltimate в культуре клеток линии карциномы лёгкого человека (А549) в диапазоне концентраций от 10 до 0,009 мг/мл. Установлена линейная зависимость действия частиц нанокомпозита на выживаемость и функциональную активность клеток. Пограничной концентрацией цитотоксичности следует считать 0,313 мг/мл. При концентрациях 0,156 мг/мл и ниже исследуемое вещество не оказывает токсического эффекта на клетки А549. По результатам второго этапа проекта было опубликованы статьи в международных и российских журналах (Web of Science, Scopus, РИНЦ), а также международная монография (включая главу о токсичности алюмосиликатов). Результаты исследования представлены на международных и всероссийских конференциях и симпозиумах. http://rosnauka.ru/news/1064 http://innovanews.ru/info/news/nano/15718/ http://kpfu.ru/news/novosti-i-obyavleniya/materialy-buduschego-sozdajut-v-kfu-167416.html

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработана комплексная методика оценки токсичности ряда промышленно-используемых наноматериалов с использованием в качестве модельного объекта парамеций Paramecium caudatum. В рамках методики оцениваются морфологические, биохимические и поведенческие аспекты жизнедеятельности простейших при воздействии наноматериалов. При помощи темнопольной микроскопии впервые были получены изображения и видеозаписи, показывающие процесс поглощения наноматериалов в динамике и их распределение в в пищеварительных вакуолях. Разработана эффективная методика иммобилизации наночастиц оксида железа на клетки палочковидных галофильных бактерий Alcanivorax borkumensis. Данная бактерия рассматривается в качестве важного инструмента в рекультивации морских выбросов нефти и может использоваться в промышленных нефтеперерабатывающих биореакторах. В работе использовали PAH-стабилизированные магнитные 20 нм частицы для модификации поверхности клеток A. borkumensis. Поверхность исходно гладкой клеточной стенки была покрыта равномерным слоем наночастиц. Фотографии ультратонких срезов магнитно- модифицированных клеток бактерий A. borkumensis, полученные с использованием электронного микроскопа, указывают, что наночастицы не разрушают структуру клеточной стенки и не проникают в цитоплазму. Изучено токсическое воздействие магнитных наночастиц в отношении к грамотрицательным галофильным бактериям. Мониторинг роста клеток в реальном времени (в диапазоне концентраций наночастиц 0,5-2,5 мг/мл) осуществляли для исследования влияния PAH-стабилизированных магнитных наночастиц на пролиферацию планктонных клеток. Примечательно, что отсутствовала задержка начальной фазы роста, характерная для послойно-модифицированных клеток. Краситель резазурин был использован для анализа метаболической активности РАН-МНЧ-покрытых бактерий. Установлено, что частичное снижение метаболической активности наблюдалось при высоких значениях концентрации магнитных наночастиц (1,5-2,5 мг/мл), тогда как низкие концентрации не значительно снижали метаболическую активность. Также были изучены эффекты нанотрубок галлуазита на рост и ферментативную активность A. borkumensis. Атомно-силовую микроскопию (АСМ) использовали для оценки формирования биопленок у РАН-МНЧ-покрытых клеток. Формирование биопленок на гидрофобной поверхности является одной из важнейших функций клеток A. borkumensis, так как данные клетки закрепляются на каплях нефти в естественных условиях. Следовательно, любая модификация клеточной поверхности не должна снижать их способность закрепляться на поверхности и образовывать биопленки. При всех исследуемых концентрациях РАН-МНЧ было показано нормальное формирование биопленок. С помощью АСМ были визуализированы инвагинации на поверхности клеток, соответствующие внутренним хранилищам липидов, обычно наблюдаемые в живых клетках A. borkumensis. Также были получены данные о магнитной чувствительности клеток A. borkumensis, модифицированных РАН-МНЧ. Показано, что магнитные клетки могут быть аккумулированы в течение нескольких секунд при помощи постоянного магнитного поля. Разработан метод контролируемого формирования многослойных гибридных оболочек на поверхности клеток дрожжей, состоящих из полимер-стабилизированных наночастиц оксида железа и неорганических нанопелнок оксида кремния. Были получены магнино-модифицированные клетки, имеющие на поверхности от одного до семи слоев «магнетит\оксид кремния» . Процесс формирования и свойства нанопленок были изучены при помощи ряда физико-химических методов (спектроскопия, термогравиметрия, микроскопия). Были определены закономерности изменения толщины покрытия в зависимости от условий иммобилизации. С помощью микробиологических методов были изучены токсикологические аспекты формирования магнитно-восприимчивых пленок. С помощю магнетофореза установлено, что клетки с изменяемой магнитной функцией могут быть использованы в токсикологических исследованиях в качестве клетокных сенсоров. Впервые получены АСМ-изображения фиксированных взрослых нематод Caenorhabditis elegans в воздухе в режиме наномеханического картирования PeakForce Tapping (Bruker). АСМ-изображения высокого разрешения в воздухе наглядно демонстрируют типичные морфологические признаки эпикутикулы, характерные для нематод C.elegans. Были сопоставлены топографические АСМ-изображения вида колец, борозд, крыловидных структур и хвоста нематод с данными, полученными при помощи сканирующей электронной микроскопии. Установлена четкая корреляция между областями головы нематод, имеющими деформированные участки около сенсорных бугорков. Продольные сканы, сделанные максимальной силой, наглядно демонстрируют тонкую структуру боковой крыловидной структуры и кончика хвоста. Установлено, что режим сканирования PeakForce Tapping применим для получения изображений C. elegans с высоким разрешением иммобилизованных обезвоженных нематод на предметном стекле в воздухе. Этот метод представляет собой AСМ режим нерезонансного формирования изображения на основе прямого измерения силы. Полученные результаты указывают на то, что режим PeakForce Tapping в качестве нерезонансного метода изображения позволяет визуализировать нематод и в воде. Установлено, что личиночные (L1) нематоды обладают хорошо развитой поверхностью с многочисленными кольцами и очень глубокими (70-150 нм) бороздами. Эта особенность поверхностного слоя резко отличается от более поздних стадий личинок и взрослых животных. Вероятно, биологическое объяснение этого феномена связано с волнообразной локомоцией нематод при их нормальной активности (поиск пищи, таксис). Очевидно, что для обеспечения лучшего сцепления с мокрой поверхностью агара в лабораторных условиях (или частиц почвы в естественных условиях), кутикула личинок стадии L1 со слабой мускулатурой должна быть гораздо более шероховатой, чем у взрослых животных, имеющих хорошо развитую мускулатуру. Полученные результаты показывают, что нематоды на стадии L1 обладают кутикулой с увеличенным числом кольцевых каналов на единицу площади поверхности, кроме того, глубина борозды на 40% больше, чем у более поздних стадий личинок и взрослых особей. Подобная развитая топография личинок стадии L1 необходима им для эффективного ползания и плавания для поиска пищи в течение первых минут после вылупления из яиц. Качественное наномеханическое картирование C.elegans в воде показывает, что механические свойства кутикулы (модуль Юнга, адгезия, деформация) являются неоднородными и зависят от стадии развития. В дальнейшем, разработанный метод будет применен для оценки функционального состояния нематод при воздействии различных токсинов. В рамках третьего этапа проекта изучена цитотоксичность различных полиэлектролитов: PAH Mw15; 70; 900 kDa; PEI; PDADMAC с очень низким, низким, средним и высоким молекулярным весом способны оказывать цитотоксическое действие на перевиваемые линии клеток карциномы легкого человека А549. Модификация клеток при помощи полиэлектролитов в концентрациях 15 мкг/ 10-5 клеток и выше оказывает влияние на рост и деление клеток. Деструктивные изменения проявлялись в слиянии и образовании многоядерных клеток с ядрами разного размера и конденсацией хроматина, клетки имели неровные вогнутые контуры. Показано, что по мере увеличения концентрации полиэлектролитов наблюдается снижение интенсивности свечения бромистого этидия вплоть до полного гашения при максимальных концентрациях. Установлено, что нанотрубки галлуазита, а также галлуазита, стабилизированного полиэлектролитами (PAH, PDADMAC, PEI), способны оказывать цитотоксическое действие на перевиваемые линии клеток карциномы легкого человека А549. При этом отмечается ярко выраженный дозозовисимый эффект с увеличением цитотоксичности при повышении концентрации нанотрубок. Отмечено, что при увеличении концентрации во всех образцах, кроме образцов с галлуазитом, наблюдается изменение морфологии ядер (появляются многоядерные клетки; при концентрации 100 мкг происходит значительное уменьшение ядер в размере, имеются ядра бобовидной формы), что свидетельствует о повышении токсического эффекта HNTs, стабилизированного полиэлектролитами. Показаны ярко выраженные изменения морфологии ядер в суспензиях клеток при различных концентрациях HNTs и HNTs, стабилизированных полиэлектролитами. Наиболее токсичным полиэлектролитом является PEI, полиэлектролиты PDADMAC и PAH являются менее токсичными, при этом наиболее физиологичным для клеток является полиэлектролит PAH. По результатам третьего этапа проекта было опубликовано 6 статей в международных журналах, индексируемых в Web of Science: Langmuir, Clay Minerals, Advanced Materials Interfaces, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, Scientific Reports, Analytical Chemistry. Опубликована монография “Functional Polymer Composites with Nanoclays” (издательство Королевского Британского химического общества), одним из редакторов которой является Р.Ф. Фахруллин (руководитель проекта). В монографию включена глава Biosafety and toxicity of clay nanocomposites, посвященая изучению токсичности наноматериалов. Результаты исследования представлены на международных и всероссийских конференциях и симпозиумах. http://www.nanowerk.com/spotlight/spotid=45094.php http://www.nanowerk.com/spotlight/spotid=44584.php https://www.eurekalert.org/pub_releases/2016-07/kfu-a072216.php