Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Картофель является интересным модельным объектом и одновременно экономически важной культурой, а клубнеобразование картофеля регулируется фитогормонами, в том числе цитокининами и ауксинами. Однако молекулярные основы этой регуляции остаются неизвестными. На основе расшифрованного генома картофеля мы провели поиск и идентификацию вероятных генов сигналинга, биосинтеза, транспорта и метаболизма цитокининов и ауксинов. Для белков, кодируемых обнаруженными генами, построены филогенетические древа, с учетом баз данных растительных протеомов, в первую очередь в сравнении с белками-ортологами арабидопсиса и томата. Параллельно для тех же белков начата работа по молекулярному моделированию их пространственных структур, на основе опубликованных ранее кристаллических структур гомологичных белков других видов. Особое внимание при этом уделено лиганд-связывающим белкам-рецепторам данных фитогормонов и их взаимодействию с белками сигнальной трансдукции. Из растений картофеля на различных фазах роста и из разных органов выделена и очищена РНК, синтезирована кДНК и начат систематический анализ экспрессии идентифицированных генов гормональных систем регуляции методом ПЦР в режиме реального времени. Также инициирована работа по созданию трансформантов картофеля с измененным сигналингом цитокининов или ауксинов, для чего подготовлены векторы для трансформации растений с генами биосинтеза/распада цитокининов и ауксинов под контролем клубнеспецифичного промотора. Трансформанты с повышенным синтезом ауксина в клубнях, выращиваемые в культуре, показали повышенную продуктивность. Главным итогом года стало создание общей картины генов систем гормональной регуляции цитокининов и ауксинов и подбор генов-кандидатов для последующей работы.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В 2015 г. продолжено исследование устройства и функционирования систем цитокининовой и ауксиновой регуляции картофеля. В результате исследования транскриптома тетраплоидного картофеля (сорт Дезире) впервые в мире клонирован ряд полноразмерных генов рецепторов цитокининов и ауксинов этого вида, при этом обнаружены новые версии рецепторов. Для отдельных генов получены также их геномные клоны. По своим основным характеристикам (доменный состав, консенсусные последовательности и др.) кодируемые этими генами белки вполне соответствуют классическим рецепторам этих фитогормонов. Гены цитокининовых рецепторов, представляющих все три основные семейства этих белков, были экспрессированы в листьях табака и в E. coli. Анализ лиганд-связывающих свойств подтвердил способность рецепторов специфично и с высоким сродством связывать цитокинины и выявил характерные особенности профилей лигандной специфичности и pH-зависимости связывания. Параллельно были клонированы и перенесены в векторы экспрессии картофельные гены ауксиновых рецепторов. С помощью ПЦР в режиме реального времени определен паттерн экспрессии генов рецепторов и других генов сигналинга цитокинина и ауксина в разных органах картофеля. Выявлены гены, экспрессия которых прямо или опосредованно регулируется цитокининами, обнаружены большие различия в экспрессии и ответе генов на цитокинин в зависимости от условий выращивания растений (содержания сахарозы в среде). С помощью методов биоинформатики уточнены и дополнены филогенетические древа для белков как цитокининовой, так и ауксиновой сигнальных систем; приближены к действительности модели взаимодействия рецепторов с белками трансдукции сигнала. Начата работа по проверке моделей с помощью точечных замен аминокислот в предполагаемом интерфейсе взаимодействия, эффект замен оценивали с помощью бимолекулярной флуоресцентной комплементации. Продолжено изучение трансформантов картофеля с введенными генами, специфически влияющими на гормональный статус растений. В частности, у растений картофеля с клубнеспецифичной экспрессией гена синтеза ауксина tms1 найдены изменения в содержании и распределении некоторых других фитогормонов (определенных форм цитокининов, а также салициловой и жасмониевой кислот), а также отличия от контрольных растений по свойствам крахмала клубней, что может иметь значение для практических целей. Таким образом, наши биоинформатические и экспериментальные исследования позволили впервые достаточно подробно охарактеризовать системы ауксиновой и цитокининовой регуляции у растений картофеля на генном и белковом уровнях. Показано, что картофель обладает полноценными системами биосинтеза, транспорта, метаболизма и сигналинга этих фитогормонов и что эти системы в целом подобны аналогичным системам других высших растений, в частности, арабидопсиса. При этом обнаружен и ряд особенностей, отличающих гормональный сигналинг картофеля от сигналинга других видов растений. Это касается, в частности, наборов рецепторов и фосфотрансмиттеров, лигандной специфичности отдельных типов рецепторов и др. Новым оказался также факт индукции экспрессии генов рецепторов ауксинов под влиянием цитокининов, что указывает на характер взаимовлияния этих гормональных систем. Будущие исследования помогут пролить свет на роль этих особенностей для роста и продуктивности картофеля.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Краткое содержание отчета 2016 года Создано около 40 различных генетических конструкций, несущих полноразмерные целевые гены белков сигналинга цитокининов и ауксинов, в первую очередь их рецепторов как ключевых белков трансдукции сигнала. Целевые гены были, как правило, соединены с последовательностями для маркерных белков/пептидов (GST, GFP, GUS, Myc или др.). С помощью данных векторов проводили экспрессию целевых белков в бактериях E. coli или транзиентную экспрессию в листьях табака N. benthamiana. В частности, функциональность одного из цитокининовых рецепторов картофеля (StHK4b) была подтверждена в результате экспрессии и анализа рецептора в бактериальной тест-системе. Созданы также конструкции в бинарном векторе pK7m34GW для стабильной трансформации растений картофеля с целью изменения сигналинга/действия цитокининов и ауксинов, содержащие гены: AHP6 (подавляет сигналинг цитокининов), ARR1 (усиливает действие цитокинина в присутствии гормона) , ARR1D94E (имитирует действие цитокинина вне зависимости от присутствия гормона), AXR3 (подавляет экспрессию ауксин-чувствительных генов в отсутствие ауксина), AXR3P88L (подавляет экспрессию ауксин-чувствительных генов вне зависимости от присутствия гормона). Целевые гены поставлены под контроль клубнеспецифичного В33-промотора гена пататина класса I для обеспечения умеренной клубнеспецифичной экспрессии. С помощью вышеуказанных векторов проведена трансформация растений картофеля сорта Дезире и начата работа по селекции и изучению трансформантов. Клонированы и секвенированы промоторы отдельных генов рецепторов цитокининов и подготовлены конструкции для анализа тканевой и органной специфики экспрессии рецепторов цитокинина в растениях картофеля, с применением репортерного гена бета-глюкуронидазы (GUS). Методами биоинформатики определены интерфейсы взаимодействия между ресиверными доменами рецепторов цитокининов и фосфотрансмиттерами для белков картофеля и арабидопсиса. Показано большое сходство интерфейсов взаимодействия указанных белков разных видов. Для ауксиновой сигнальной системы методом моделирования построены 3D-структуры белков-гомологов TIR1 (рецептор ауксина) и SKP1 (компонент убиквитин-лигазного комплекса) картофеля. Предложена модель интерфейса взаимодействия между этими белками, образованного 3-мя N-концевыми α-спиралями TIR1 и 3-мя N-концевыми α-спиралями SKP1. В случае как цитокининов, так и ауксинов смоделирован характер связей взаимодействующих белков и идентифицированы аминокислотные остатки - наиболее вероятные участники взаимодействия. Для проверки компьютерных моделей взаимодействия рецептор-фосфотрансмиттер произведен точечный мутагенез цитокининового рецептора AHK3, с заменой двух аминокислот в ресиверном домене, и фосфотрансмиттера AHP2, с заменой трех аминокислот. Взаимодействие мутантных белков исследовали методом BiFC после их транзиентной экспрессии в листьях N. benthamiana. Результаты подтвердили, что тройная мутация в AHP2 по биоинформатически идентифицированным аминокислотам ингибирует его взаимодействие с рецептором. С помощью ПЦР в режиме реального времени впервые дана количественная характеристика экспрессии генов сигнальной трансдукции (рецепторы, фосфотрансмиттеры, регуляторы ответа) и метаболизма цитокининов и ауксинов (рецепторы) в 4-х органах (листья, стебли, корни, клубни) растений картофеля при разных режимах выращивания in vitro: в условиях низкой (1.5%) и высокой (5%) концентрации сахарозы в среде. Также определена экспрессия тех же генов в органах растений, выращенных в почве. Выявлены различия генной экспрессии у трансформантов по гену tms1 синтеза ауксина по сравнению с контрольными растениями. Установлено, что у tms1-трансформантов картофеля меняется физиологическая реакция (интенсивность клубнеобразования) на обработки цитокинином или ауксином. Если у контрольных растений обработка этими фитогормонами приводила к стимуляции образования клубней, то у трансформантов реакция была противоположной, особенно при высокой концентрации (5-8%) сахарозы в среде. Исследовано влияние tms1 гена на структурные и термодинамические особенности крахмалов из клубней растений, культивируемых in vitro. Показано, что экспрессия tms1 приводит к повышению доли небольших крахмальных гранул овальной формы наряду с гранулами нерегулярной или кубической формы, характеризующимися большими размерами.