Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект направлен на разработку новых материалов и аддитивных технологий изготовления персонализированных генно-инженерных конструкций, предназначенных для замены костных дефектов критического размера. Специфика структуры и свойств костных тканей, а также процессов репаративного остеогенеза обусловливает высокие требования, предъявляемые сегодня, как к материалам (которые должны обладать выраженным остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом), так и к технологиям производства этих изделий. Одним из наиболее перспективных, на наш взгляд, вариантов решения этих проблем, является комбинация передовых аддитивных технологий, обеспечивающих послойный синтез неорганических (главным образом, на основе фосфатов кальция) матриксов заданной архитектоники, и биотехнологических подходов. В отчетном году изучены способы синтеза и изготовлены опытные партии мелкодисперсных порошков на основе нанодисперсных фосфатов кальция, обладающих требуемыми физико-химическими свойствами (структура и морфология поверхности частиц, химический и фазовый состав, кристалличность, реология и др.) для трехмерной струйной печати биоактивных керамических структур. Исследована взаимосвязь формы и дисперсности наночастиц фосфатов кальция в зависимости от условий и метода синтеза. Исследована реакционно-твердеющая система с мелкодисперсным порошком на основе трикальцийфосфата в качестве прекурсора кристаллизации дикальцийфосфат дигидрата и раствора солей ортофосфорной кислоты. Установлены закономерности фазообразования при схватывании и твердении реакционно-твердеющих смесей в такой системе, формирования микроструктуры и свойств при физиологических температурах. На разработанном нами экспериментальном 3D принтере успешно реализован процесс трехмерной струйной печати биокерамических матриксов заданной архитектоники и определены его оптимальные параметры. Исследовано взаимодействие между мелкодисперсным порошком (наполнитель) и жидким связующим в процессе трехмерной печати образцов биоактивных керамик. Разработанный метод адаптирован для работы с исходными данными, получаемыми с диагностического медицинского оборудования. Наработаны лабораторные партии образцов геометрически соответствующих реальным биологическим прототипам. Разработан способ модификации персонализированных матриксов посредством направленного синтеза кальцийфосфатных фаз заданного состава и морфологии (поверхность и объем). Выявлены кинетические особенности формирования микроструктуры и фазового состава разработанных материалов в жидкостях, обеспечивающих фазовую трансформацию трикальцийфосфата в дикальцийфосфат дигидрат и октакальциевый фосфат. Установлена возможность формирования положительно-заряженных комплексов (Са2+ и Mg2+) в системе для эффективной генной трансфекции. Полученные результаты соответствуют мировому уровню и последним тенденциям в области исследований и разработок изделий из биологически совместимых материалов, предназначенных для новых медицинских технологий регенерации поврежденных костных тканей. В 2015 г. результаты работы по проекту были опубликованы в отечественных журналах. Работа была отражена в отечественных и зарубежных средствах массовой информации – Forbes. Скелет в 3D: как напечатать кости. Опубликовано 03.10.2015. http://www.forbes.ru/mneniya-column/301913-skelet-v-3d-kak-napechatat-kosti и Materials News. Bio Focus: 3D-printed octacalcium phosphate bone substitutes reduce defect region, materials360 online. Published: 09 October 2015. http://www.materials360online.com/newsDetails/58900.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Ежегодное количество пациентов, нуждающихся в реконструктивно-восстановительных операциях в связи с повреждениями костей скелета, чрезвычайно велико. Эффективное лечение может быть достигнуто с применением стандартных методов и средств, однако у значительной части пациентов не удается добиться успешных результатов, восстановления исходного уровня качества жизни. Это обусловлено тем фактом, что при выраженных (объемных, протяженных) повреждениях тканей и органов, при наличии сопутствующей патологии и факторов риска, отягощающих клиническую ситуацию, в зоне дефекта количество камбиальных клеток и биологически активных веществ, индуцирующих репаративную регенерацию тканей, минимизировано и не позволяет реализовать полное гистотипическое восстановление. Эффективное лечение в таких случаях может быть обеспечено только методами и средствами, которые воздействуют на репаративную регенерацию тканей, восполняют утраченные структуры, камбиальный резерв, привносят факторы, регулирующие восстановительный процесс и т.д. Одним из путей решения проблемы является создание ген-активированных персонализированных имплантатов, которые представляют собой особый класс медицинских изделий для костной пластики. Отличительной особенностью является наличие генных конструкций – биологически активных нуклеиновых кислот – несущих гены терапевтических белковых факторов, которые объединены с матриксом-носителем, полученным по технологии 3D печати. В отчетном году разработан способ и определены условия инкорпорирования в структуру персонализированных матриксов на основе октакальциевого фосфата (ОКФ) и генных конструкций способных к транзиторному удержанию (связыванию) молекул нуклеиновых кислот (НК). Проведена оценка кинетики высвобождения НК из ген-активированных материалов на основе ОКФ, полученных путем прямого связывания с матриксом-носителем за счет комплексообразования и дополнительного размещение НК на поверхности матрикса-носителя. Установлено, что способ инкорпорирования НК в структуру матрикса-носителя, оказывает существенное влияние на кинетику ее высвобождения. Дополнительное размещение НК на поверхности матрикса-носителя приводит к высвобождению НК уже на 1-е сут. и увеличению их количества в 2 раза в модельном растворе достигая 100,22 нг/мг на 60 сутки эксперимента. Кинетика высвобождения описывается степенной функцией на начальном этапе, переходящей затем в экспоненциальную функцию. Известно, что помимо ангиогенеза в регуляцию репаративной регенерации костной ткани вовлечено множество других факторов и механизмов, которые способствуют привлечению камбиальных клеток в зону репарации, обеспечивающих индукцию, пролиферацию и дифференцировку остеогенных клеток-предшественниц, и стимулируют продукцию остеобластами компонентов костного межклеточного матрикса. В этой связи, нами предположено введение дополнительно в состав плазмидной ДНК с геном сосудистого эндотелиального фактора роста, кодирующим VEGF (pl-VEGF165), гена – последовательности, кодирующей фактор стромальных клеток (SDF-1). Совмещение персонализированного матрикса-носителя на основе ОКФ и каждого из вариантов генных конструкций выполняли с использованием разработанного нами способа прямого связывания и дополнительного размещения НК на поверхности. Проведена сравнительная оценка in vitro биологической активности персонализированных ген-активированных материалов на основе ОКФ, ОКФ/pl-VEGF165 и ОКФ/pl-VEGF165/SDF-1α, содержащих по 100 мкг биологически активных нуклеиновых кислот в 1 г матрикса-носителя. Показано, что разработанные ген-активированные материалы и их компоненты – ОКФ, pl-VEGF165 и pl-VEGF165-SDF-1α – не обладают цитотоксическими эффектами. Ген-активированный материал ОКФ/pl-VEGF165/SDF-1α на 24,3 % больше снижает пролиферативную активность ММСК костного мозга человека in vitro, чем ОКФ/pl-VEGF165. Механизм такого влияния может быть обусловлен индукцией дифференцировки клеток, что требует дальнейших исследований. Ген-активированные материалы приводят к повышению уровня экспрессии трансгенов с пиком на 5 сутки, но в случае ОКФ/pl-VEGF165/SDF-1α дальнейшее снижение уровня мРНК плавное и медленное, тогда как в группе с ОКФ/pl-VEGF165 – резкое. Вероятно, за счет матрикса-носителя на основе ОКФ увеличивается эффективность трансфекции клеток генными конструкциями. Наибольший прирост продукции терапевтического белка vegf наблюдалось в случае ОКФ/pl-VEGF165/SDF-1α по сравнению с ОКФ/pl-VEGF165, что может быть обусловлено различиями в посттранскрипционных механизмах регуляции полужизни мРНК трансгенов, кодируемых исследованными генными конструкциями. Проведены сравнительные испытания на резорбируемость персонализированных матриксов на основе ОКФ и генных конструкций (ОКФ и ОКФ/pl-VEGF165) при контакте с биологическими тканями в гетеротопическом тканевом ложе на сроки 15, 45, 60, 120, 150 и 180 суток. При исследовании биорезорбции персонализированных матриксов на основе ОКФ совмещенных с генными конструкциями, уже с первых недель (15 суток) после имплантации отмечается выраженное прорастание соединительной ткани в глубину имплантата. Капсула, покрывающая материал состоит преимущественно из активных фибробластов - клеток овальной формы, с крупными овальными ядрами, расположенными достаточно тесно друг к другу. В некоторых участках эта реактивно измененная соединительная ткань более соответствует понятию «грануляционная ткань», чем формирующейся плотной капсуле. Капсула интенсивно кровоснабжается, что выражается в большем количестве регистрируемых визуально полнокровных кровеносных сосудов. Следует отметить рыхлую структуру материала и меньшие по размеру плотные эозинофильные структуры по сравнению с матриксом-носителем на основе ОКФ. На сроках наблюдения 45-120 суток прослеживается дальнейшее разрыхление и истончения по краям материала. Характерной особенностью образцов на сроки 150-180 суток является их высокая пористость. Оптически пустые вакуоли занимают значительную по объему долю, при этом их размеры достигаю величины 200-250 мкм в диаметре. На некоторых участках на «растворенный» материал приходится до 60 % от объема. Глубина врастания соединительной ткани в материал достигает 100-150 мкм. Методом 3D микротомографии установлено, что биорезорбция in vivo материалов происходит в большей степени по поверхности образцов в зоне интимного прилегания к мягким тканям. Рассчитанные количественные параметры биорезорбции (общий объем, площадь и геометрические размеры) подтверждают результаты гистологического исследования. Персонализированные матриксы на основе ОКФ совмещенные с генными конструкциями имеют боле выраженный биорезорбционный профиль и большую скорость «растворения». На следующем этапе работы по проекту проведено исследование, направленное на оптимизацию фазового состава, морфологии поверхности и микроструктуры персонализированных матриксов с целью повышения минимальной дозы и точности дозирования связанной фракции нуклеиновых кислот. Нами был предложен способ модификации фосфатов кальция различными металлами, заключающийся в замещении Mg2+, Sr2+ и Ba2+ на Са2+, т.е. создание положительно-заряженных комплексов в процессе формирования структуры апатита (дикальцийфосфат дигидрат→ОКФ) для эффективной генной трансфекции. Особенностью данного способа изготовления оптимизированных ген-активированных материалов являлось гармоничное встраивание этапа обработки персонализированного матрикса раствором комплексообразователя в известный этап синтеза ОКФ (см. отчет за 2015 г.). Установлено, что модифицированные комплексообразователями (Mg2+, Sr2+ и Ba2+) матриксы носители с минимальными концентрациями генных конструкций (100 мкг на 1,0 г материала) связывают в 1,2-2,3 раза большее количество НК (plVEGF) по сравнению с «чистым» ОКФ. Более того, неожиданные результаты были получены при построении кривой высвобождения и при оценке эффективности трансфекции культур клеток in vitro генных конструкций из ген-активированных материалов содержащих ионы металлов. Модифицирование матрикса-носителя приводит к высвобождению НК (plVEGF) уже на 1-е сут. и увеличению их количества в 2 раза в модельном растворе достигая 99,67 нг/мг на 60 сутки эксперимента. Проведены эксперименты in vitro с мезенхимальными мультипатентными стромальными клетками, которые были инкубированы с ОКФ/plVEGF и модифицированными ген-активированными материалами (OКФ+Mg2+/plVEGF; OКФ+Sr2+/plVEGF; OКФ+Ba2+/plVEGF). С помощью ПЦР-РТ и ИФА была выявлена в 1,5-2,0 раза большая эффективность трансфекции на модифицированных ген-активированных материалах. Причиной такого эффекта стала, по всей видимости, обнаруженные на микроскопическом уровне в зоне с клетками микрочастицы материалов, расположенные как вне-, так и внутриклеточно. По всей видимости, микрочастицы диаметром менее 3 мкм представляют собой преципитаты фосфатов кальция и фосфатов других комплексообразователей (Mg2+, Sr2+ и Ba2+), которые связывают молекулы генных конструкций и поступают в клетки. Дополнительно к плану работ по проекту в 2016 г. реализована 3D печать объемных персонализированных матриксов носителей для проведения биологических испытаний в ортотопических условиях по моделям сложной структуры (работы 2017 г.). В работе были использованы две модели соответствующие реальному биологическому объекту, а именно модель участка трубчатой кости взрослой свиньи длинной 30 мм и диаметром 25 мм и модель ее нижний челюсти размером 15×25 мм2. Исходные данные были получены с помощью компьютерного томографа. Преобразование данных в трехмерную модель для печати осуществлялось при помощи оригинального, разработанного нами программного обеспечения, входящего в программно-аппаратный комплекс 3D принтера. Построение трёхмерного объекта в обоих случаях осуществлялось при установленных ранее параметрах. Полученные образцы индивидуальных объектов геометрически полностью соответствовали исходным цифровым моделям. Для предсказания поведения разработанных материалов в условиях in vivo проведено комплексное моделирование на основе использования ряда переменных параметров, таких как: характеристики матрикса (макро-, мезо-, микропористость, радиус частиц порошка), расчетные коэффициенты резорбции (kр) и костной регенерации (kк). Работа проведена совместно с Университетом Вены (Австрия). Результатом моделирования явился подбор оптимального соотношения указанных параметров в условиях, очерченных коэффициентами, для максимально быстрого достижения тканями, в зоне имплантации, нормального показателя модуля Юнга, т.е. нормальной "жесткости" и биостабильности. Предсказаны значения прочности материала в зависимости от времени имплантации с учетом биорезорбции. Показано, что механические характеристики регенерата быстро растут до пороговой точки (15 недель), после которой начинается плато и незначительное снижение вплоть до 20 недель. Объясняется это заполнением всех макропор костным регенератом (пороговая точка), а последующее минимальное снижение – биорезорбцией. Полученные результаты соответствуют мировому уровню и не имеют аналогов в мировой литературе. Данное направление работы соответствует последним тенденциям в области исследований и разработок в области биоматериаловедения и биотехнологий. В 2016 г. результаты работы по проекту были опубликованы в отечественных и зарубежных журналах. Проведены мероприятия по информированию общественности – Информационный портал профессоров РАН. Технологии персонализированных материалов медицинского назначения для восстановления и регенерации тканей. Опубликовано 27.06.2016. http://prof-ras.ru/index.php?option=com_k2&view=item&id=622:&Itemid=108; Лекция Комлева В.С. в Образовательном центре «Сириус» на тему: "Трехмерная печать тканевых эквивалентов человека". Опубликовано 14.07.2016. https://sochisirius.ru/news/391; Лекция Комлева В.С. Недели науки в МГУ в рамках XI Всероссийской Интернет-олимпиады по нанотехнологиям на тему: "Аддитивные технологии в тканевой инженерии". Опубликовано 01.12.2016. http://www.nanometer.ru/2016/12/01/nedela_nauki_526447.html.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект направлен на проведение комплексных исследований и разработку новых материалов и аддитивных технологий изготовления персонализированных генно-инженерных конструкций, предназначенных для замены костных дефектов критического размера. Основные решаемые в нем фундаментальные междисциплинарные задачи – это разработка материалов и технологии 3D печати индивидуальных матриксов и генно-инженерных конструкций для направленной регенерации костных тканей, а также установление процессов и механизмов формирования структуры и свойств последних. Междисциплинарность проекта обусловлена выполнением исследований в области неорганической и физической химии (фазовые превращения и химические свойства), материаловедения (структура и механические свойства), инженерных наук (3D принтинг) и биологии (биологические испытания). В результате выполнения проекта в 2017 г. разработаны и изготовлены методом струйной трехмерной печати прототипы биоинженерных конструкций на основе биокерамических матриксов и генно-активирующего компонента (плазмидные ДНК с генами ключевых остеоиндуцирующих факторов (VEGF)) по моделям костных тканей сложной структуры. Полученные образцы индивидуальных биокерамических конструкций геометрически полностью соответствуют их исходным цифровым 3D моделям и отражают собой успешное решение ключевой проблемы проекта, а именно «П7-4-8. Разработка аддитивных технологий для приготовления индивидуальных изделий медицинского назначения в области ортопедии, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, нейрохирургии, онкологии». Успешно проведены биологические испытания in vivo разработанных материалов и конструкций. Установлены механизмы трансфекции генов основанные на высвобождении генных конструкций из структуры матрикса-носителя, их проникновение в клетки реципиентного ложа посредством эндоцитоза, высвобождении из эндосом в цитоплазме и транспортировке в ядро клеток с последующей экспрессией трансгена. Показано, что разработанные материалы обеспечивают высокую интенсивность репаративного остеогенеза в случае восполнения костных дефектов критических размеров. В экспериментальных исследованиях восполнения диафизарного дефекта in vivo применение данных материалов позволило уменьшить объем костного дефекта почти на 90 %. На основании проведенных экспериментов проведен комплекс работ по оптимизации аддитивной технологии изготовления персонализированных генно-инженерных конструкций, который позволил: 1). увеличить скорость 3D печати практически в 10 раз; 2). сохранить высокую точность печати и упростить обработку готового изделия за счет улучшенных алгоритмов распределения связующего в слое керамического порошка; 3). увеличить воспроизводимость результатов печати за счет оптимизации методик подготовки материалов к процессу 3D печати; и 4). определить оптимальные степени замещения Mg2+, Sr2+ и Ba2+ на Са2+ при постобработке биокерамических конструкций, что повысило эффективность связывания нуклеиновых кислот в 2-3 раза. В ходе выполнения проекта получен целый ряд новых фундаментальных и прикладных результатов, внедрение которых обеспечит возможность эффективной 3D печати персонализированных биоинженерных конструкций для регенеративной медицины.