Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума STING (Stimulator of Interferon Genes), известный как молекулярный сенсор цитоплазматической ДНК, играет важную роль в распознавании внутриклеточных патогенов и активации интерферон (тип I) -зависимого пути в клетках миелоидного ряда. Наши исследования показали, что в Т-лимфоцитах обнаруживается высокий уровень экспрессии STING, однако, практически ничего не известно о его роли в процессах дифференцировки / активации Т-клеток, для которых не характерны продукция интерферонов (IFN) I типа и экспрессия IFN-зависимых генов. Эксперименты по определению молекулярного и механистического уровней взаимодействия STING с сигнальным каскадом, активирующим TCR, выполненные на Т-лимфоцитах, нокаутных по STING и обработанных частицами Dynabeads с анти-CD3/CD28 антителами, показали, что STING не является компонентом сигнального каскада, индуцируемого Т-клеточным рецептором, и не участвует в антиген-независимой активации Т-клеток. Существенной разницы в пролиферации в ответ на анти-CD3 / CD28-антитела между WT (C57Black6 – WT = wild type) и КО-типами Т-клеток обнаружено не было. Стимуляция PMA или иономицином не вносила корректировку в пролиферацию STING-/- Т-клеток. Результаты дают основание предполагать, что в Т-лимфоцитах STING может играть специфическую, ранее не известную роль. Такой ролью может являться роль основного детектора клеточной инфекции или другая дополнительная роль в активации врожденного иммунного ответа. С помощью флюоресцирующих компонентов микрокластеров, таких как SLP76 и Zap70, проведена оценка внутриклеточной локализации STING в Т-клетках, изучены условия активации STING (с использованием DMXAA – 5,6 dimethlyxanthenone-4-acetic acid) и их влияние на ко-локализацию. Результаты по активации Т-клеток DMXAA показали, что WT В6 Т-клетки быстро отреагировали на DMXAA повышенным фосфорилированием киназы р-TBK1 и фактора р-IRF3, в то время как в STING - / - Т-клетках подобного эффекта не отмечено. В Т-клетках КО-типа обнаружено почти идентичное WT Т-клеткам фосфорилирование TBK1 и IRF3. Вместе с тем, для Т-клеток характерна более быстрая активация STING: ТВК-1 фосфорилирование детектируется через 5-10 минут, IRF3 фосфорилирование – через 30 минут после обработки DMXAA, тогда как в макрофагах изменения в р-TBK1 и р-IRF3 начинаются только после 30-60 минут стимуляции. WT Т-клетки в ответ на DMXAA дозозависимо продуцируют IFNβ (IFN I тип) и IFNγ (IFN II тип), в STING - / - Т-клетках IFNβ не детектируется, хотя они производят небольшое фоновое количество IFNγ, сравнимое с нестимулированными WT Т-клетками. Различие в экспрессии генов между WT В6 и STING - / - Т-клетках до и после стимуляции DMXAA выявило значительную активацию нескольких интерферон-активируемых генов (ISG), в том числе IFN I типа, Ccl5, Cxcl10, Mx1, Ifit 1, Ifit2, Ifit3в WT B6, но не в STING - / - Т-клетках. CD4 + и CD8 + Т-клетки также ответили на DMXAA стимуляцией фосфорилирования TBK1 и IRF3 и синтезом IFNβ, но только CD4 + Т-клетки синтезом IFN-γ. Индукция пролиферации Т-клеток в ответ на анти-CD3/CD28 антитела в условиях активации STING-зависимого пути DMXAA показала, что в ответ на обработку анти-CD3 антителами, сорбированными в лунках планшета, пролиферировали только WT, но не STING-/- T-клетки, причем добавление DMXAA ингибировало пролиферацию WT-клеток. Аналогичный эффект отмечался при совместной обработке указанных Т-клеток сорбированными анти-CD3+анти-CD28. Наконец, обработка клеток микросферами, покрытыми анти-CD3/CD28 антителами, приводила к индукции пролиферации как WT, так и STING-/- T-клеток, однако, DMXAA подавлял пролиферацию только в WT, но не в STING-/- T-лимфоцитах. Данные позволяют с уверенностью утверждать, что утрата STING настолько негативно сказывается на пролиферации, что только покрытые анти-CD3/CD28 частицы предоставляют сигнал достаточной силы, чтобы индуцировать пролиферацию в STING-/- T-клеток. В то же время, активация STING под действием DMXAA приводит к ингибированию пролиферации WT T-клеток, простимулированных антителами, сорбированными на планшете или связанными с микросферами. Основываясь на полученных данных, мы предлагаем модель, в которой STING служит в качестве части платформы, вовлеченной в TCR-индуцированную активацию; в результате связывания DMXAA активирует STING, который отдаляется от платформы, нарушая при этом TCR сигнальный каскад и ингибируя пролиферацию. Модель объясняет, почему и генетический дефект, и DMXAA-индуцированная активация STING ингибируют Т-клеточную пролиферацию. Результаты по исследованию транскрипционного ответа на активацию STING DMXAA на геномном уровне (РНК-секвенирование) демонстрируют неожиданные различия в уровне экспрессии генов нестимулированных WT В6 и STING - / - Т-клеток: нестимулированные STING - / - Т-клетки показывают более высокие уровни CD8-хемокина Xcl1, гранзимов, TNFα, перфорина, LTA и транскрипционного фактора Eomes, то есть генов, ассоциированных с фенотипом цитотоксических Т-клеток. Учитывая тот факт, что у STING-/- мышей дифференцировка CD4 и CD8 T-лимфоцитов в тимусе протекает без видимых отклонений, можно предположить участие STING в модулировании процессов активации наивных CD8 Т-клеток. Однако, несмотря на ассоциацию STING с CD8-фенотипом, как CD4-, так и CD8-позитивные WT клетки, выделенные из периферических лимфоузлов, в равной степени отвечали на DMXAA фосфорилированием TBK1 и IRF3 и продукцией IFNβ. Обнаруженные различия требуют дальнейшего, более детального изучения.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В первой серии экспериментов данного этапа нами было продолжено изучение молекулярного и механистического уровней взаимодействия STING с сигнальным каскадом, активирующим TCR (T cell Receptor). Исследования показали, что генетическая делеция STING сильно замедляет Т-клеточную пролиферацию в ответ на активацию TCR. Интересно, что активация STING через DMXAA также ингибирует TCR-индуцированную пролиферацию. Оба наблюдения приводят к разработке новой модели, в которой STING способствует TCR сигналингу, возможно, взаимодействуя с одним из последующих компонентов пути, но диссоциирует от TCR вслед за узнаванием DMXAA и последующей активацией. Следовательно, DMXAA становится инструментом тонкой настройки при TCR-активации в Т-клетках. Далее была оценена тканевая специфичность экспрессии STING. Эксперименты позволили сделать вывод о преимущественной экспрессии STING в иммунокомпетентных клетках (макрофаги, дендритные клетки) и органах (тимусе, селезенке). Тот факт, что STING экспрессируется на высоком уровне в лимфоидных тканях и, конкретно, в Т-лимфоцитах, заставляет задуматься о том, что он может являться активным участником сигнальных Т-клеточных каскадов и играть незаменимую в определенных условиях роль. Тем не менее, другие клетки (эпителиальные, эндотелиальные, нервные и др.) также экспрессируют STING. В них роль STING вполне может объясняться участием в процессах пролиферации, дифференцировки, апоптоза. Нами показано, что клетки В6 мышей (гепатоциты) являются высоковосприимчивыми к Fas-индуцированному апоптозу, за счет продуцирования более высоких уровней cFLIPR (короткой изоформы белка) по сравнению с гепатоцитами линии MSM (продуцируют длинную изоформу cFLIPL). cFLIPL связывает каспазу 8, предотвращая апоптоз. На каком этапе в данный процесс может вовлекаться STING (и может ли) требует дальнейшего детального изучения. Наиболее интересными моделями в данном варианте нами рассматриваются искусственно зараженные бактериальной или вирусной инфекцией мыши дикого и нокаутного типа в условиях стимуляции STING. Вторая серия экспериментов включала исследование влияния STING на развитие Т-клеток. Исследовали популяции тимоцитов и периферических Т-клеток (CD4+, CD8+, популяции Treg), выделенных из лимфоузлов мышей дикого и/или нокаутного типа. Полученные данные показали, что отсутствие STING не влияет на развитие Т-клеточных органов. Между CD4 + Foxp3 + регуляторными Т-клетками из pLN у C57BL/6 и STING - / - мышей различий также не выявлено. Кроме того, дикие и STING дефицитные мыши одинаково экспрессируют Т-клеточный рецептор (TCR), и отсутствие STING не изменяет TCR-стимулированную экспрессию CD69 и CD25. Тем не менее, добавление DMXAA оказывает влияние на экспрессию данных маркеров у C57BL/6 мышей, особенно CD25 после 40 часовой стимуляции. Нами был обнаружен факт различного соотношения подтипов Т-клеток по уровню STING, и сделан важный вывод, подтверждающий предположение о ведущей роли STING в активации Т-клеток. Кроме того, мы сравнили уровень CD25 (рецептор для IL-2) у диких и конгенных мышей. MOLF Т-клетки в данном эксперименте производили более высокие уровни IFNβ и IL-2 по сравнению с WT B6 и MOLF STING. B6 конгенные Т-клетки продуцировали одинаковое количество этих цитокинов. В STING - / - Т-клетках синтезировалось больше IFNβ и IL-2, чем в WT, но меньше, чем в MOLF Т-клетках. Результаты проведенного сравнительного анализа транскриптомов стимулированных Т-лимфоцитов методом РНК-секвенирования показали, что Т-клетки дикого типа в ответ на стимуляцию STING с помощью DМХАА активируют ряд цитокинов из семейства интерферонов, в том числе IFN α1, 2, 4, 5, которые обычно не ап-регулируются миелоидными клетками. Анализ сигнальных путей выявил STING-специфическую активацию апоптозных путей в Т-клетках. Оказалось, что апоптозные пути характеризуются общим паттерном, так же как и продукция цитокинов. В частности, активация Т-клеток дикого типа DМХАА приводит к активации апоптоза, а в нокаутных клетках такой активации нет. На основе этих данных было сделано предположение, что активация STING в Т-клетках приводит к клеточной смерти. Поэтому далее мы проанализировали конкретные транскрипты генов, ответственных за клеточную смерть или пролиферацию, и обнаружили, что действительно основные регуляторы и индукторы клеточной смерти активируются в ответ на DМХАА. Подобная смерть характерна именно для Т-клеток, поскольку макрофаги не предрасположены к апоптозу. В итоге при стимуляции синтетическим агонистом DMXAA возможна принципиальная активация STING/TBK1/IRF3 сигналинга в мышиных CD4/CD8 Т-клетках с последующей индукцией экспрессии множества интерферон-стимулирующих генов (ISG), что ставит вопрос о подобной активации в физиологических условиях. Но даже если предположить, что STING-зависимая индукция IFN/ISG в Т-клетках не является физиологически значимой, она, тем не менее, приобретает особую важность при терапевтических воздействиях с использованием высокоаффинных синтетических агонистов STING. Третья серия экспериментов была направлена на изучение эффекта STING-опосредованной активации на функции Т-клеток. Оценена специфичность действия DMXAA на различные подтипы Т-клеток путем индукции дифференцировки Th1 клеток с помощью IL-12 (IL-4), Th2 клеток с помощью IL-4 (IL12) и Th17 с помощью IL-6, IL23 и TGF-β, с последующей обработкой DMXAA. Результаты показали, что STING/IFN-β зависимая продукция цитокинов индуцирует дифференцировку Treg лимфоцитов и подавляет Th1 ответ. Важным оказался и тот факт, что MOLF-линия характеризуется дефектами в отношении противовирусного иммунитета. Для определения гена, который несет IFN-дефект, нами была создана панель мышей F2 (B6xMOLF), и изучен их ответ на CDN, HSV и L. monocytogenes. Все исследуемые варианты были связаны с Tmem173 – геном, кодирующим STING. Мы обнаружили множественные полиморфизмы в STING MOLF – L47V, A48G, S53L, S103F, I114M, Y115C, Y126S и 6-аa делеций 116-122 в NTD, с одной заменой, N210D, в CTD STING. Структурный анализ с использованием Smart Motifs и ELM программного обеспечения показал, что эти полиморфизмы будут влиять на вторичную структуру белка и нарушать трансмембранные участки связывания STING. Так, удалось обнаружить естественный мутантный вариант STING, не отвечающий на активацию DMXAA запуском экспрессии IFN I типа. Весьма неожиданно, АК-замены (L47V, A48G, and S53L), делающие MOLF-вариант гена нефункциональным при стимуляции DMXAA, располагаются в N-концевом домене, а не лиганд-связывающем, и сопряжены с нарушением траффика STING из ЭПР в аппарат Гольджи. Более того, нами показано, что MOLF-аллель является гипоморфной, так как не влияет на уровень продукции IL-6 и некоторых других NFkB-регулируемых цитокинов, и не влияет на распознавание макрофагами РНК-вирусов, что указывает на значимость N-концевого домена не только в активации STING, но и в переключении сигнала, исходящего от ДНК-сенсоров. Проведенный генетический скрининг показал, что N-концевой домен отвечает не просто за заякоривание STING в мембране ЭПР, но также необходим для его правильной активации и транслокации, хотя ранее выполнение этой функции присваивали лиганд-связывающему CTD. Таким образом, все запланированные исследования данного этапа выполнены в полном объеме.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В первой серии экспериментов данного этапа был проведен биохимический анализ роли STING в TCR активации, в том числе с использованием DMXAA. Определили возможный эффект STING на активацию РLCγ и ERK киназ, регулируемых в ответ на анти-CD3 сшивание Т-клеточного рецептора. PLCγ является одной из самых ранних ступеней TCR–активации, ERK расположена ниже по пути передачи сигнала. Показано, что DMXAA, индуцируя фосфорилирование TBK1 и IRF3 в WT, но не STING-/- Т-клетках, повышает фосфорилирование p38 и p65, а также PLCγ. Полученные данные дополнены анализом NFкB активации. Изменений в фосфорилировании белка p105, ингибирующего NFкB, после активации STING зарегистрировано не было, но поскольку активация TCR вызывает фосфорилирование p105 и деградацию активного фактора транскрипции p50, было интересно, повлияет ли DMXAA также на этот путь. Фосфорилирование p105 было слабо индуцировано стимуляцией TCR через 60 мин, как в клетках дикого типа, так и в STING-/-, но было сильнее и быстрее в клетках дикого типа при добавлении DMXAA. Обнаруженная разница между Т-клетками дикого и нокаутного типа в активации пролиферации, позволяет сделать вывод о преимущественном участии STING в реализации сигналов от одного из рецепторов (CD3 или CD28), но не одновременном, поскольку Т-клетки от STING-дефицитной линии мышей при одновременной активации CD3 и CD28 могут пролиферировать. Но, ни о каком аддитивном эффекте при активации TCR и использовании DMXAA говорить не приходится. Таким образом, STING-/- и WT Т-клетки проявляли сходные уровни фосфорилирования ERK и p65 после стимуляции CD3 и CD28, то есть удаление STING не приводит к серьезным дефектам активации. Для исключения основных различий в развитии Т-клеток, сравнили CD4-CD8-, CD4+ CD8+ тимуса и периферических лимфатических узлов (pLN), одиночные положительные популяции Т-клеток CD4+ и CD8+, а также уровни экспрессии TCR в CD4+ и CD8+. Значительных различий между Т-клетками дикого типа и STING-/- мышами обнаружено не было. Также не обнаружено различий в интактных, регуляторных клетках и клетках памяти у диких и STING-/- мышей, все демонстрировали сравнимые уровни CD69 и CD25 после активации TCR. Вторая серия экспериментов была посвящена изучению регуляторных способностей DMXAA-активированных Т-клеток. В данной части эксперимента использовали IFNR-дефицитных мышей, что позволило установить роль аутокринного интерферона на TCR-индуцированную пролиферацию Т-клеток. Интерферон способен ингибировать TCR-пролиферацию, а IFNR-дефицитные мышиные Т-клетки не способны к пролиферации, поэтому предполагалось, что воздействие на STING в данном варианте будет оказывать внутренний IFN. Тем не менее, эксперименты показали, что в отличие от макрофагов, аутокринный IFN не влияет на передачу сигнала через STING в Т-клетках. Таким образом, хотя активация STING в Т-клетках запускает множество путей метаболизма, подобных описанным в клетках врожденного иммунитета, она также имеет уникальные воздействия, которые могут привести к специфичным для Т-клеток эффектам. Показано, что pLN T-клетки разрастались одинаково в ответ на стимуляцию TCR, DMXAA блокировал это размножение в WT, но не в STING-/- T-клетках. IFNAR-/- Т-клетки также не размножались в присутствии DMXAA, не реагируя на аутокринный IFN-I. Поэтому далее была изучена STING-зависимая активация IFN и индукция апоптоза в Т-клетках. Секвенирование РНК интактных WT B6 и STING-/- CD3+ Т-клеток, стимулированных анти-CD3 и анти-CD28, только DMXAA, или тем, и другим одновременно, показало, что DMXAA увеличивал экспрессию ISG в клетках дикого типа, но не в STING-/- Т-клетках. Анализ сигнальных путей показал STING-зависимое увеличение апоптоза и каспазного каскада, уменьшение индукции IL-2 и остановку клеточного цикла. Хотя активация TCR сама по себе в WT B6 и STING-/- Т-клетках вызывала увеличение активности антиапоптотических (BCL2) и уменьшение активности проапоптотических генов (BAX), введение DMXAA меняло эту картину. Активация STING привела к подавлению BCL2 и повышению BAX в T-клетках дикого типа. Поразительно, что ни один из этих путей не активировался DMXAA в макрофагах: сравнение между макрофагами и Т-клетками показало большее сходство между STING-/- Т-клетками и макрофагами, чем STING-/- и Т-клетками дикого типа. Предположили, что это может быть связано с тем, что макрофаги должны быть устойчивы к STING-инициированному апоптозу для инициации дальнейших иммунных реакций. Одним из механизмов DMXAA STING-инициированного апоптоза может быть накопление в ЭПР белков с дефектной структурой, поскольку обнаружили значительное повышение экспрессии генов, участвующих в реакциях сворачивания белков, в частности Bip / HSPA5 и GADD34. Далее TCR-активированные Т-клетки, обработанные DMXAA, были окрашены аннексином V и йодидом пропидия (PI). Добавление DMXAA к активированным анти-CD3 и анти-CD28 WT T-клеткам приводило к появлению высокого числа аннексин V+ PI+ клеток по сравнению с их аналогами без DMXAA, STING-/- Т-клетки были по большей степени аннексин V- PI-. Затем мы обработали клетки ингибитором панкаспазы zVAD-fmk и/или ингибитором некроптоза Nec1, чтобы охарактеризовать тип гибели. Результаты показали, что только при использовании комбинации ингибиторов, гибель Т-клеток была остановлена, что указывает на возможное переключение (в зависимости от условий) процессов гибели Т-клеток, обработанных DMXAA, с апоптоза на некроптоз. В третьей серии экспериментов изучена роль Т-клеточного ответа на DMXAA in vivo. Проведено внутривенное введение мышам DMXAA в течение двух дней с последующей изоляцией Т-клеток и их детальным анализом. Изменений в популяциях интактных Т-клеток и Т-клеток памяти из периферических лимфоузлов и селезенки, указывающих на их гибель, отмечено не было, но констатировался IFN-I ответ. Поэтому реакция Т-клеток на активацию STING in vivo требует дальнейшего детального изучения, а результаты нашего исследования еще раз доказывают то, что требуется тщательное изучение влияния агонистов STING на Т-клетки всякий раз, когда эти агонисты проверяются на возможный терапевтический эффект. Параллельно эксперимент был выполнен на мышах, зараженных Listeria monocytogenes. Данный паразит является внутриклеточным, высвобождает ДНК в процессе внутриклеточного размножения. Результаты показали, что листериоз провоцирует выработку циклических динуклеотидов, которые активируют STING, вызывают синтез IFNβ, негативно влияющего на развития клеточного иммунитета. Путь STING/IFNβ в данном контексте используется для дифференцировки Т-регуляторных лимфоцитов, повышения толерогенного микроокружения и снижения гипервоспаления в организме, т.е. бактерия пытается «обмануть» иммунную систему. Следует отметить, что в Т-клетках, имеющих мутацию в гене Tmem173, продукция IFNβ в ответ на инфицирование Listeria monocytogenes резко снижена. У STING-/- мышей по сравнению с диким типом обнаружен более сильный защитный иммунитет на инфицирование Listeria monocytogenes. Полученные результаты говорят о том, что STING-/- мыши благополучно запускают воспалительный ответ, размножение Т-клеток не прекращается, большая часть Listeria monocytogenes элиминируется, данные Т-клетки прекрасно реагируют на цитозольную (инфекционную) ДНК. Таким образом, исследования, проведенные нами в рамках проекта, доказывают, что STING имеет свои собственные уникальные функциональные эффекты в клетках адаптивного иммунитета, не свойственные таковым в клетках врожденного иммунитета. Все запланированные исследования данного этапа выполнены в полном объеме. Информационные ресурсы сети Интернет: http://rscf.ru/ru/node/2371 http://openscience.news/posts/935-rossiyskie-uchenye-issledovali-sting-oposredovannuyu-immunoterapiyu-raka https://scientificrussia.ru/articles/biohimiki-iz-rossii-i-ssha-obnaruzhili-pobochnyj-effekt-novogo-metoda-immunoterapii-opuholej http://fano.gov.ru/ru/press-center/card/?id_4=38342 http://www.sib-science.info/ru/institutes/uchenye-belok-sting-mozhet-21072017 http://www.nanonewsnet.ru/news/2017/belok-sting-mozhet-izmenit-immunoterapiyu-raka