Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Неинвазивная диагностика является наиболее перспективной областью клинической диагностики, поскольку она не допускает ни повреждения стенок кровеносных сосудов, ни нарушения целостности кожных покровов. Концентрация метаболитов в экскреторных жидкостях обычно ниже, чем в крови. Поэтому с целью повышения чувствительности используется созданный нами более 20 лет назад электрокатализатор восстановления пероксида водорода на основе берлинской лазури (БЛ). Электрокатализатор существенно улучшает аналитические характеристики (био)сенсоров, поскольку и по активности, и по селективности превосходит обычно используемую платину на три порядка. Основные работы и результаты 1 года выполнения проекта: 1.1.Оптимизация методики и изготовление планарных сенсорных структур методом трафаретной печати в качестве основы для разработки планарных сенсоров. Соисполнителем ООО Русенс выполнена оптимизация трафаретной печати сенсорных структур и разработана методика изготовления трехэлектродных планарных сенсорных структур. Планарные сенсорные структуры изготавливались методом послойной трафаретной печати на полуавтоматическом печатном станке SCF-300 (Technical Industrial Co. Ltd., Гонконг). Проведено изучение электрохимических свойств электродов, изготовленных с применением различных углеродных паст. Подготовлено 500 штук планарных структур. 1.2.-1.3.-1.4.Исследование новых протоколов со-осаждения наноструктур гексацианоферратов переходных металлов для разработки электрокатализатора восстановления пероксида водорода с улучшенной операционной стабильностью и каталитической активностью. Разработка и изготовление планарных сенсоров на пероксид водорода на основе трехэлектродных сенсорных структур, изготовленных методом трафаретной печати. Изучение аналитических характеристик сенсоров на пероксид водорода, основанных на улучшенном наноструктурированном электрокатализаторе. Разработана новая упрощенная методика модификации электродов сенсорным материалом на основе гексацианоферратов железа и никеля [Karpova E.V., Karyakina E.E., Karyakin A.A. Iron–nickel hexacyanoferrate bilayer as an advanced electrocatalyst for H2O2 reduction . RSC Advances. 2016. V. 6. P. 103328–103331, http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/ra/c6ra24128j/unauth#!divAbstract]. Высокостабильный сенсор для определения пероксида водорода получен на основе одного бислоя, состоящего из каталитического покрытия БЛ и стабилизирующего покрытия NiГЦФ, нанесенных послойно методом межфазного синтеза. Сенсор демонстрирует высокую операционную стабильность: в режиме непрерывного мониторинга 1 мМ H2O2 первоначальный отклик сохраняется в течение 80 минут. Чувствительность анализа составила (0,34±0,02 А·М-1·см-2); диапазон определяемых концентраций (1·10-7 – 1·10-3 М) [Карпова Е.В., Карякин А.А. Суперстабильный электрокатализатор восстановления пероксида водорода как основа высокоэффективного биосенсора. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 136]. Разработаны и изготовлены новые высокостабильные планарные сенсоры на пероксид водорода на основе гексацианоферратов железа и никеля. Совместно с соисполнителем ООО Русенс подготовлено 200 штук лабораторных образцов сенсоров. 1.5.Исследование структуры и морфологии наноструктурированных пленок гексацианоферратов переходных металлов на оборудовании ЦКП ФНМ МГУ имени М.В. Ломоносова и выявление структурно-функциональных зависимостей для понимания фундаментальных пределов их активности и операционной стабильности. Электрокатализатор был исследован методами электрохимической микроскопии [Komkova M.A., Maljusch A., Sliozberg K., Schuhmann W., Karyakin A. Scanning Electrochemical Microscopy: Visualization of Local Electrocatalytic Activity of Transition Metals Hexacyanoferrates. 2016. Russian Journal of Electrochemistry, V. 52, P. 1298-1304,DOI: 10.1134/S1023193516120065]. При помощи сканирующей капельной ячейки осуществлен электрохимический синтез геометрически идентичных образцов гексацианоферратов железа и никеля для измерений методом СЭХМ. Показано, что NiГЦФ обладает незначительной активностью как электрокатализатор восстановления пероксида водорода по сравнению с берлинской лазурью (БЛ). Предлагаемый подход, успешно примененный для модельных образцов, является перспективным для визуализации поверхностной активности с высоким пространственным разрешением для дизайна и разностороннего исследования электроактивных поверхностей, а также для разработки сенсоров и биосенсоров. Фундаментальные исследования электронтранспортных характеристик электро-катализатора методом импедансной спектроскопии выявили необычные свойства гексацианоферратов переходных металлов, в частности, сопротивления переноса заряда, не подчиняющееся закону Ома. Сопоставление спектров электрохимического импеданса с морфологией пленок гексацианоферратов позволило предложить способ оценки сплошности электроактивных неорганических без применения средств микроскопии [Komkova M.A., Karpova E.V., Sukhorukov G.A., Sadovnikov A.A., Karyakin A.A. Estimation of continuity of electroactive inorganic films based on apparent anti-Ohmic trend in their charge transfer resistance. 2016. Electrochimica Acta, V. 219, P. 588-591, DOI: 10.1016/j.electacta.2016.09.145]. 1.6. (Био)сенсоры на основе берлинской лазури, не требующие источника питания, для носимых устройств. В 2016 году показана возможность создания (био)сенсоров на основе электродов, модифицированных БЛ для носимых устройств, не требующих источников питания. Оптимальный потенциал функционирования амперометрических сенсоров на основе БЛ – около 0 В (отн. Ag/AgCl/1 M KCl). Сенсоры на основе БЛ функционируют в гальваническом режиме (рабочий электрод и ХСЭ замкнуты через амперметр). Генерируемый ток линейно зависит от концентрации H2O2, а аналитические характеристики сенсоров совпадают с таковыми для идентичных сенсоров, функционирующих по трехэлектродной схеме [Комкова М.А., Карякин А.А. Высокоэффективные (био)сенсоры на основе берлинской лазури для носимых устройств, не требующие источников питания. Acta Naturae, 2016. V. 2, P. 130]. Данная будет продолжена в 2017 году. 1.7.-1.8.Определение глюкозы и латата в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) с помощью нового сенсора на пероксид водорода. Исследование корреляции между содержанием глюкозы в крови и конденсате выдыхаемого воздуха для создания основ неинвазивной клинической диагностики гипо/гипергликемии и выявление наличия алгоритмов соответствия концентрации этих метаболитов в крови и КВВ. Анализ неинвазивно собираемого КВВ, диктует необходимость сопряжения биосенсора с устройствами концентрирования. Была разработана электроаналитическая установка, позволяющая сдвинуть диапазон действия лактатного биосенсора в сторону меньших концентраций на два порядка. Установка успешно применена для анализа КВВ [Karyakina E.E., Lukhnovich A.V., Yashina E.I., Statkus M.A., Tsisin G.I., Karyakin A.A., Electroanalysis, Electrochemical Biosensor Powered by Pre-concentration: Improved Sensitivity and Selectivity towards Lactate. 2016. Electroanalysis. V. 28. P. 2389 -2393, DOI: 10.1002/elan.201600232]. Проведено определение концентрации лактата в КВВ, собираемом неинвазивно. Лактат определяли у группы спортсменов в состоянии покоя и после тяжелой физической нагрузки, после которой концентрация лактата в крови повышается в несколько раз. Установлено, что после физической нагрузки концентрация лактата в КВВ также повышается, что свидетельствует о наличии корреляции КВВ с кровью в отношении гипоксии. [Карякин А.А., Карякина Е.Е. Неинвазивная диагностика гипоксии с использованием высокоэффективных биосенсоров на основе наноструктурированных электро- и биокатализаторов. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 129]. Для определения концентрации глюкозы в КВВ предложено использовать метод, основанный на амперометрическом измерении скорости гомогенной реакции окисления глюкозы под действием глюкозооксидазы в режиме постоянного перемешивания. В качестве рабочего электрода используется сенсор на пероксид водорода на основе планарного электрода, модифицированного БЛ. Аналитическим сигналом являлась начальная скорость реакции, пропорциональная тангенсу угла наклона кривой накопления продукта ферментативной реакции – пероксида водорода. В пробах конденсата, собранных с использованием хлорамфеникола у здоровых доноров, обнаружена глюкоза в концентрации около 10 мкМ – в 500 раз ниже, чем в крови. Для установления корреляции между изменениями концентрации глюкозы в крови и КВВ использовали глюкозотолерантный тест. Показана возможность использования КВВ для неинвазивной оценки концентрации глюкозы в крови [Вохмянина Д.В., Никулина С.В., Карякина Е.Е., Карякин А.А. Биоэлектрохимический анализ конденсата выдыхаемого воздуха как инструмент неинвазивной диагностики. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 137]. Основная часть исследований по данной теме исследования будет включена в отчет за 2 этап проекта (в 2017 году), так как основная публикация еще находится на рассмотрении в журнале (послана в печать в сентябре 2016 г). 1.9.Новый сенсорный материал с повышенной селективностью к лактату на основе темплатного синтеза боронат-замещенного полианилина. Разработаны новые сенсорные материалы на основе боронат-замещенного полианилина, обладающие высокой селективностью к сахарам и оксикислотам [Никитина В.Н., Зарянов Н.В., Карякин А.А. Высокоселективные синтетические рецепторы на основе поли(анилинборных кислот) для детекции сахаров и оксикислот. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 132]. Работы по созданию неферментивных сенсоров для определения лактата в поте были запланированы на 2 этап проекта, но уже начаты в 2016 г. и будут продолжены в 2017 г. Проведен импринтинг гидроксикислот в боронат-замещенный полианилин. Импринтинг позволяет направленно изменять аналитические характеристики синтетического рецептора. Чувствительность и селективность сенсоров к оксикислотам увеличивается в 10 раз при проведении полимеризации в присутствии молекул-темплатов (оксикислот) по сравнению с полимерами без молекулярных отпечатков [Зарянов Н.В., Никитина В.Н., Карякин А.А. Неферментативный сенсор на основе боронат-замещенных полианилинов для детекции лактата в поте в целях неинвазивной диагностики. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 136-137]. Более подробный отчет по повышению селективности боронат-функционализированных полианилинов за счет молекулярного импринтинга будет включена в отчет за 2 этап проекта (в 2017 году), так как основная публикация еще находится на рассмотрении (послана в печать в октябре 2016 г). Изготовлены лабораторные образцы планарных сенсоров на полиолы (оксикислоты и сахара) на основе трехэлектродных сенсорных структур, модифицированных новым сенсорным материалом, полученным в результате темплатного синтеза боронат-замещенного полианилина в присутствии лактата, 20 шт. Сенсоры включены в системы проточно-инжекционного анализа. Кроме того, синтетический рецептор на основе проводящего боронат-замещенного полианилина оказался пригодным для детекции микроорганизмов [Андреев Е.А., Комкова М.А., Карякин А.А. Новый принцип безреагентной регистрации аффинных взаимодействий на основе повышения проводимости проводящего полимера. Acta Naturae. 2016. V. 2. P. 130]. Используется новый принцип детекции, основанный на увеличении проводимости полимера в присутствии микроорганизмов. Такой принцип позволяет различать специфический и фоновый сигнал, поскольку в последнем случае проводимость всегда уменьшается. Сенсорный материал был успешно применен для электрохимического детектирования плесневых грибов Penicillium chrysogenum. Нижняя граница определяемого содержания микроорганизмов составила 600 колониеобразующих единиц в 1 мл (КОЕ/мл) [Андреев Е.А., Комкова М.А., Крупенин В.А., Преснов Д.Е., Карякин А.А.. Электрохимическое детектирование Penicillium Chrysogenum на основе повышения проводимости полиаминофенилборной кислоты. Электрохимия. 2017. V. 53. № 1. P. 1-5]. 1.10-1.11.Подготовка научных публикаций. Участие в Российских и Международных конференциях. В 2016 году опубликованы 14 статей, в печати еще находятся 3 статьи. В 2016 году подготовлены 2 заявки на патенты РФ. Члены научного коллектива, в том числе молодые ученые, аспиранты и студенты участвовали в российских и международных конференциях: сделано 28 докладов на 8 конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Неинвазивный мониторинг диабета посредством анализа конденсата (аэрозоля) выдыхаемого воздуха. Согласно Всемирной Организации Здравоохранения, 347 миллионов людей (около 5% населения Земли) страдают от сахарного диабета. Диабет, претендующий на седьмое место по смертности, опасен в основном, своими осложнениями: атеросклерозом, почечной недостаточностью, слепотой, риском ампутаций и пр. Концентрацию глюкозы в крови является ключевым параметром для диабетиков: поддержание ее на нужном уровне позволяет отсрочить упомянутые осложнения. Неинвазивно собираемый конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ), известный как экскреторная жидкость с высоким диагностическим потенциалом, не рассматривался как подходящий кандидат для мониторинга диабета ввиду, как сообщалось, низких концентраций глюкозы в КВВ (0.1–0.2 μM). Сообщаемые по глюкозе степени разбавления относительно крови находятся однако в противоречии со степенями разбавления по лактату и, что особенно важно, по неорганическим ионам, которые можно считать внутренними стандартами для экскреторных жидкостей. Мы показали, что конденсат воздуха, выдыхаемого здоровыми людьми, содержит глюкозу на уровне 0.01 мМ. Мы также установили причину, по которой сообщалось о заниженной на два порядка концентрации глюкозы: это поглощение (метаболизация) глюкозы в КВВ. Следовательно, корректный сбор КВВ возможен только в присутствии ингибитора метаболизации глюкозы. Следует отметить, что существующие малоинвазивные мониторы глюкозы требуют калибровки каждые один-два дня. Такая «калибровка» включает отбор крови с последующим анализом на содержание глюкозы. Таким образом, периодический отбор крови для калибровки не дезавуирует диагностического метода, который тем не менее может сохранять название «неинвазивный». Соответственно, достаточным для неинвазивной диагностики будет корреляция степени изменения концентрации метаболита в экскреторной жидкости с соответствующими значениями в крови. Мы показали, что увеличение концентрации глюкозы в крови вызывает соответственное повышение содержания глюкозы в КВВ. Установленная положительная корреляция между степенями увеличения глюкозы в КВВ и крови открывает перспективы создания метода для неинвазивного мониторинга диабета. A.A.Karyakin, S.V.Nikulina, D.V.Vokhmyanina, E.E.Karyakina, E.Kh.Anayev, A.G.Chuchalin Electrochemistry Communications 83 (2017) 81-84. Публикация пресс-релиза по данной статье пресс службой МГУ имени М.В. Ломоносова вызвала большой интерес средств массовой информации. В частности, соответствующий видеосюжет с интервью профессора А.А. Карякина передали в своих новостях телеканалы Россия-1 и НТВ. 2. Улучшенные аналитические характеристики (био)сенсоров на основе Берлинской лазури в режиме генерации мощности. В противовес самозапитываемым (“self-powered”) (био)сенсорам, целью которых является достижение максимальной мощности, мы предлагаем системы с минимальной разностью потенциалов между рабочим и вспомогательным электродом, которые в режиме гальванической ячейки должны обеспечить достижение наилучших аналитических характеристик. Сенсоры и биосенсоры на основе Берлинской лазури, которые, как известно, работают при потенциале 0.00 В относительно хлорсеребряного (Ag|AgCl) электрода сравнения, являются наилучшими кандидатами для этой цели. Преимуществами электродов, модифицированных Берлинской лазурью, по сравнению с платиной, наиболее широко используемой для детекции пероксида водорода, являются: (а) на 3 порядка более высокая активность в реакциях как окисления, так и восстановления H2O2, характеризуемая в 1000 раз большей электрохимической константой, что обеспечивает существенно более высокую чувствительность, и (б) на 3 порядка величины более высокая селективность к восстановлению пероксида водорода в присутствии кислорода. Эти уникальные свойства электрокатализатора позволяют разрабатывать высокоэффективные сенсоры и биосенсоры. Будучи закороченными через амперметр, (био)сенсоры на основе Берлинской лазури генерируют ток, пропорциональный концентрации анализируемого вещества. В дополнение к существенному упрощению процедуры измерения (использование амперметра вместо потенциостата), режим генерации мощности обеспечивает дальнейшее существенное улучшение аналитических характеристик. Чувствительность и диапазон определяемых концентраций (био)сенсоров на основе Берлинской лазури в режиме генерации мощности, соответственно, несколько выше и шире по сравнению с теми же биосенсорами, работающими в традиционном трех-электродном режиме, будучи включенными через потенциостат. Селективность (био)сенсоров в режиме генерации мощности сохраняется такой же высокой как по кислороду, позволяя детектировать H2O2 по его восстановлению, так и по отношении к восстановителям. Наиболее занчительным преимуществом предлагаемого режима генерации мощности является на порядок улучшенное соотношение сигнал : шум по сравнению с включением по трехэлектродной схеме через потенциостат. M.A. Komkova, E.E. Karyakina, A.A. Karyakin. Analytical Chemistry 89 (2017) 6290−6294. 3. Молекулярный импринтинг боронат-замещенного полианилина для неферментативного селективного детектирования сахаров и оксикислот. Недостатком подавляющего большинства безреагентных афинных сенсоров является практическое отсутствие селективности, поскольку и специфическое связывание, и неспецифические взаимодействия генерируют отклик в одну и ту же сторону, как правило, приводя к увеличению сопротивления. Нами с использованием молекулярного импринтинга синтезирован материал, генерирующий повышение проводимости в ответ на специфические взаимодействия, в то время как неспецифическое реакции и деградация материала приводят к откликам в противоположном направлении, понижения проводимости. Электрополимеризация 3-аминофенилбензойной кислоты (3-АФБК), приводящая, насколько было известно ранее, к синтезу проводящего полимера исключительно в присутствии фторид-иона (F−), была осуществлена заменой последнего на оксикислоту. Синтез электрон-проводящего полимера в процессе бесфторидной электрополимеризации 3-АФБК подтверждает успешный импринтинг оксикислот в полимер. Импринтинг поли(3-АФБК) обеспечивает как в 10–15 повышенные, так и пониженные константы связывания с полиолами, позволяя достичь требуемую селективность. Настраивая связывающие свойства боронат-замещенного полианилина, мы продемонстрировали возможность неферментативной селективной детекции сахаров и гидроксикислот по увеличению проводимости полимера. V.N. Nikitina, N.V. Zaryanov, I.R. Kochetkov, E.E. Karyakina, A.K. Yatsimirsky, A.A. Karyakin. Sensors & Actuators B 246 (2017) 428–433. 4. Неферментативный сенсор для определения концентрации лактата в поте. Неинвазивная диагностика крайне важна как для клинической, так и спортивной медицины. Ранее нами было показано, что увеличение лактата в крови в процессе теста «на отказ» вызывает соответствующее увеличение лактата в поте (D.A. Sakharov, M.U. Shkurnikov, M.Y. Vagin, E.I. Yashina, A.A. Karyakin, A.G. Tonevitsky. Bull. Exp. Biol. Med., 150 (2010) 83-85.), открывая возможность неинвазивной диагностики гипоксии. Несмотря на успешное детектирование лактата в поте при помощи биосенсоров, включая разработанный нами неинвазивный монитор гипоксии (M.M. Pribil, G.U. Laptev, E.E. Karyakina, A.A. Karyakin, Analytical Chemistry, 86 (2014) 5215-5219), низкая стабильность фермента лактат оксидазы стимулирует интерес к разработке химических сенсоров. Соответственно, для неинвазивной диагностики гипоксии мы разработали неферментативный сенсор на основе планарных структур с рабочим электродом, модифицированным электрополимеризацией 3-аминофенилбензойной кислоты (3-АФБК) с импринтингом лактата. Импедиметрический сенсор позволяет определять концентрацию лактата в диапазоне от 3 мМ до 100 мМ с пределом обнаружения 1.5 мМ; время отклика составляет 2-3 минуты. Чувствительность сенсора сохраняется неизменной при хранении будучи незапечатанным в сухом состоянии в течение 6 месяцев, что недостижимо для устройств на основе ферментов. Для сравнения, биосенсор на основе лактат оксидазы при аналогичных условиях хранения теряет 50% своей чувствительности уже через 10 дней. Анализ человеческого пота на содержание лактата при помощи сенсора на основе поли(3-АФБК) оказывается возможным благодаря (а) намного большей концентрации лактата по сравнению с другими полиолами и (б) высокой селективности сенсора (K < 3 × 10−2). Успешное определение концентрации лактата в человеческом поте с использованием сенсора на основе поли(3-АФБК) подтверждено применением независимого высокоспецифичного метода на основе фермента лактат оксидазы (коэффициент корреляции r > 0.9). Аналитические характеристики неферментативного сенсора на основе поли(3-АФБК) указывают не перспективность их применения для неинвазивного клинического анализа и спортивной медицины. N.V. Zaryanov, V.N. Nikitina, E.V. Karpova, E.E. Karyakina, A.A. Karyakin. Analytical Chemistry 89 (2017) 11198-11202. 5. Новые протоколы иммобилизации глюкозооксидазы и лактат оксидазы в пленки электрополимеризованных N-замещенных пирролов. Использование электрохимических реакций, нельзя считать целесообразным с точки зрения массового производства биосенсоров. Однако для создания микро-биосенсоров, когда сложно нанести каплю фермент-содержащего раствора на нужный участок сенсора, электрохимическая иммобилизация становится наиболее технологичным процессом. Преимуществами электрополимеризации являются как стабильность из-за включения фермента в полимер, так и адресность иммобилизации. Аналитические характеристики биосенсоров на лактат и глюкозу на основе соответствующих оксидаз, иммобилизованных в N-замещенные полипирролы, сравнимы с характеристиками биосенсоров, полученных по методике иммобилизации ферментов с экспозицией в водно-органические смеси с высоким содержанием органического растворителя. Чувствительность биосенсора на лактат для оптимального полипиррола составляет 0.19 ± 0.02 A ∙M-1 ∙см-2 , диапазон определения лактата 5·10-7 – 5·10-4 М. Для глюкозы, чувствительность биосенсора 0.044 ± 0.004 A ∙M-1 ∙см-2, диапазон определения глюкозы -5·10-6 –5·10-3М.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
3 этап. Тест-системы для неинвазивной диагностики гипоксии и гипо-гипергликемии по детекции лактата и глюкозы в КВВ и поте. Научной группой руководителя проекта на протяжении последних 25-и лет разработаны новые научные направления по ключевым аспектам создания биосенсоров. [Karyakin A.A. Advances of Prussian blue and its analogues in (bio) sensors. Current opinion in electrochemistry 2017, том 5, № 1, с. 92-98 DOI: 10.1016/j.coelec.2017.07.006)]. Проект продолжает исследования по внедрению биосенсоров в системы неинвазивной диагностики. Все заявленные работы выполнены полностью. 1.Создание лабораторного образца анализатора пота на содержание лактата, основанного на неферментативном сенсоре, для контроля гипоксии; Импедиметрический неферментативный сенсор на основе поли(аминофенилборной кислоты) с молекулярными отпечатками лактата был адаптирован для работы в режиме хроноамперометрии или хронопотенциометрии в проточно-инжекционном режиме. Замена импедиметрического детектирования повышает экспрессность и снижает стоимость анализа. Амперометрический сенсор испытан для определения концентрации лактата в поте в сравнении с высокоселективным биосенсором на основе лактат оксидазы. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0.95. При физических нагрузках повышается уровень лактата в 2-6 раз, что подтверждено независимым методом сравнения. Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке, поданной 25.04.2017 “Способ изготовления сенсорного материала и сенсора на его основе “ N2017114420/28. 2. Создание прототипа неинвазивного монитора гипоксии с использованием проточного потосборника с интегрированным биосенсором на основе инженерии лактатоксидазы; Изготовлен прототип потосборника, пригодный для интеграции планарных биосенсоров, функционирующих в проточном режиме, и электронного блока для записи и передачи сигнала. Также разработана проточная тонкослойная ячейка и планарный биосенсор на лактат. Потосборник может быть изготовлен как вручную из цельного оргстекла, так и, при помощи 3D-печати из пластика. В проекте ранее был продемонстрирован альтернативный принцип детекции аналитов в режиме генерации мощности, позволяющий отказаться от использования потенциостата и тем самым упростить процедуру регистрации сигнала. Новый принцип регистрации основан на использовании планарных структур в режиме двухэлектродной схемы, при этом аналитические характеристики биосенсоров не уступают таковым при использовании потенциостата, а соотношение сигнал/шум возрастает до 10 раз. Монитор представляет собой миниатюризированную проточную систему: через капилляр, одно из отверстий которого прилегает к коже пациента, а другое служит в качестве «отвода» жидкости, проходит пот, а вдоль капилляра располагается лактатный биосенсор. Прототип неинвазивного монитора осуществляет мониторирование содержания лактата в неразбавленном поте в диапазоне от 0.1 мМ до 80 мМ лактата в течение 2 часов непрерывных измерений без потери исходной активности. Работа монитора в поте апробирована в режиме реального времени в состоянии покоя и при физической нагрузке (контроль гипоксии). Результаты тестирования монитора сопоставлены с аналогичными данными, полученными альтернативным методом проточно-инжекционного анализа лактата биосенсором на основе БЛ. Наблюдается высокая корреляция результатов: коэффициент Пирсона составил 0.993 (P=0.95, n = 8). Прототип неинвазивного монитора гипоксии прошел клинические испытания с участием спортсменов (Институт физкультуры и спорта и Центр подготовки сборных команд Москомспорта). Подготовлено техническое задание на монитор гипоксии для последующих НИОКР (см. Приложение). 3. Выявление корреляции между концентрациями глюкозы в поте и крови для неинвазивного мониторинга диабета и создание прототипа монитора гипо-гипергликемии. Корреляция между изменениями концентраций глюкозы в поте и крови не имеет достоверного подтверждения в литературе. Установление этой корреляции позволит разработать прототип неинвазивного монитора гипо-гипергликемии на основе анализа пота на содержание глюкозы. Монитор даст возможность следить за содержанием глюкозы в крови больных сахарным диабетом, особенно во время сна, когда резкие колебания этого параметра становятся опасными для их жизни. Корреляция между концентрациями глюкозы в поте и крови исследована двумя альтернативными методами: в разбавленном поте - методом ПИА с включенными биосенсорами, разработанными на 1-2 этапах проекта и в неразбавленном поте – в проточной системе с тонкослойной ячейкой с глюкозным биосенсором. По данным, полученным для 19 добровольцев в режиме ПИА, концентрация глюкозы в поте в десятки раз ниже, чем в крови (от 30 до 200 мкМ глюкозы, медиана – 7·10-5 М глюкозы). Использование глюкозотолерантного теста позволило повысить концентрацию глюкозы в крови и поте добровольцев через 60 минут после его начала и выявить положительную корреляцию между изменениями концентрации глюкозы в крови и поте (r = 0.74). Конструкция неинвазивного монитора гипоксии использована для создания прототипа монитора гипо-гипергликемии с включением биосенсора на глюкозу. Монитор для непрерывного определения глюкозы в неразбавленном поте, имеет следующие аналитические характеристики: S = 24±2 мA·M-1·cм-2 (n = 3, P = 0,95), ДОК 5 мкМ – 1 мМ глюкозы, cмин = 4,5 мкМ. Для проверки правильности работы биосенсора в неразбавленном поте, выполнено сравнение результатов анализа глюкозы, полученных с помощью неинвазивного монитора и альтернативного метода (ПИА). rПирсон>0.99 (n=12, P=0.95). Подготовлена статья: Elena V. Karpova, Elizaveta V. Shcherbacheva, Andrei A. Galushin, Darya V. Vokhmyanina, Elena E. Karyakina, Arkady A. Karyakin*. Non-invasive monitoring of diabetes using advanced flow-through glucose biosensor. 4. Создание прототипа портативного устройства для отбора КВВ с интегрированным электрохимическим (био)сенсором. Разработана электроаналитическая система и изготовлен прототип портативного устройства для экспрессного определения концентрации глюкозы в КВВ. Для конденсации выдыхаемого человеком аэрозоля предлагается использовать элементы Пельтье, что позволит температурно-контролируемо и воспроизводимо осуществлять отбор КВВ. Для электроанализа предлагается интегрировать в ячейку для отбора КВВ высокоэффективные, т.е. чувствительные, селективные и стабильные биосенсоры на основе Берлинской лазури (БЛ), разработанные на 1 и 2 этапах проекта. Проведена апробация электроаналитической системы, совмещающей системы отбора образца и регистрации электрохимического сигнала, на примере определения глюкозы. Биосенсоры для определения глюкозы демонстрируют сходные аналитические характеристики при анализе в фосфатном буфере (с=1.4 мкМ) и неразбавленном КВВ (с=1,0 мкМ). Данные электрохимического определения концентрации глюкозы в КВВ коррелируют с данными метода ВЭЖХ МС: с использованием максимума тока в качестве аналитического сигнала – с линейным коэффициентом корреляции Пирсона 0.95 (P=0.95, f=4). Cледовательно разарботанный прототип может быть эффективно использован для определения концентраций ключевых метаболитов в выдохе человека при решении задач неинвазивной диагностики. 5. Исследование коммерческого потенциала разработанных биосенсоров и тест-систем. (Био)сенсоры на основе БЛ превосходят имеющиеся на рынке аналоги по аналитическим характеристикам, а также несомненно являются на несколько порядков более дешевыми в сравнении с использующимися в современных устройствах биосенсорами на основе платины. Несмотря на привлекательность использования БЛ в качестве трансдьюсера, новой разработке будет сложно найти здесь свою нишу, поскольку рынок глюкометров переполнен. Имеющиеся в продаже персональные устройства обладают примерно одинаковыми характеристиками (анализ капли крови объемом 1-2 мкл занимает чуть менее 10 секунд, точность анализа в среднем составляет 20%) и имеют стоимость около 1000 рублей. Что касается лабораторных анализаторов глюкозы и лактата, то отечественные практически не представлены на рынке, а в имеющихся используются зарубежные картриджи, цена которых варьирует от 5 до 10 тысяч рублей. Таким образом, в данном случае имеется возможность для внедрения биосенсоров на основе БЛ для замены импортных картриджей. Аналогов разработанным в проекте тест-системам для неинвазивной диагностики на данный момент не существует. 6. Синтез нанозимов «искусственная пероксидаза»: наночастиц (НЧ) берлинской лазури (БЛ) с ферментной активностью. Для имитации фермента пероксидазы синтезированы наночастицы БЛ, обладающие характеристиками, присущими природным ферментам: (I) высокой специфичностью, в том числе отсутствием оксидазной активности, (II) возможностью работы в физиологических рН, (III) сверх-высокой каталитической активностью. Каталитическая константа синтезированных наночастиц пропорциональна их объему, вплоть до двухсот раз превосходя таковую для природной пероксидазы: для частиц с d=80 нм kкат = 1.2·104·с-1. Наночастицы сохраняют до 80% первоначальной каталитической активности при хранении в растворе около года, а сухой препарат может храниться при комнатной температуре неограниченно долго. [Komkova Maria A., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A. Catalytically synthesized Prussian Blue nanoparticles defeating natural enzyme peroxidase. Journal of the American Chemical Society, 140 (2018) 11302]. 7. Подготовка научных публикаций и патентов. Опубликовано 8 статей. Статья по разделу 3.8. опубликована в журнале JACS с импакт- фактором 14.3. Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке, от 25.04.2017 “ Способ изготовления сенсорного материала и сенсора на его основе “ N2017114420/28 и заявки от 03.11.2017г. “ Способ определения концентрации пероксида водорода в растворе“. Поданы 2 новые заявки. 8. Участие в Российских и Международных конференциях, конкурсах работ молодых ученых. Защита кандидатских диссертаций Молодые ученые и студенты, приняли участие в конференции Ломоносов-2018, в 28 Менделеевской конференции (Новосибирск, май 2018г.), аспиранты Комкова М.А. и Карпова Е.В. стали победителями конкурса Умник-2017. Сделано по 6 докладов на международной конференции по электроанализу (Родос, Греция) в июне 2018 г. и IV конференции “Биотехнология: наука и практика” (Мисхор, Крым). Руководитель гранта Карякин А.А. (приглашенный доклад) и молодые ученые Комкова М.А. и Андреев Е.А. приняли участие в Совещании Международного электрохимического общества (Болонья, Италия). Никитина В.Н. участвовала в 38 Международной конференции по современным электрохимическим методам в Чехии (май, 2018 г.). Андреев Е.А. - победитель конкурса грантов РНФ для молодых ученых (2018 г.), Комкова М.А. – победитель конкурса грантов РФФИ для молодых ученых (2018 г). Студентка Вера Шавокшина (4 курс) получила повышенную академическую стипендию за успехи в учебе и научной работе. В 2018 году были представлены и прошли защиту диссертации: Комкова М.А. “Наноразмерные пленки и наночастицы катализаторов на основе гексацианоферратов переходных металлов для высокоэффективных (био)сенсоров”. Никитина В.Н. “Электрохимические cенсоры на сахара и гидроксикислоты на основе поли(аминофенилборных кислот) “.