Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработан и апробирован пилотный вариант технологии переработки отходов птицефабрик культурами насекомых-сапрофагов семейства Calliphoridae (мясных мух), включающий полный цикл операций (поддержание маточной культуры насекомых, подготовка отходов к переработке, выращивание биомассы личинок, отделение личинок от переработанной среды, индукция биосинтеза, выделение, очистка и контроль качества целевых продуктов). В задачу технологии входит получение целевых продуктов с высокой добавленной стоимостью, а именно пептидов и белков медицинского применения. Основными целевыми продуктами технологии на данном этапе являются антимикробные пептиды, цитокиноподобные пептиды из группы аллоферонов, белки из группы арилфоринов. В дальнейшем список целевых продуктов планируется расширить за счет других биологически активных пептидов личинок, а также генно-инженерных белков человека и других животных. Оптимальным видом отходов является куриная кровь. Для переработки свежая кровь смешивается с инертным наполнителем (древесными опилками) и заселяется личинками I-II возраста. Цикл переработки отходов занимает около 5 суток, после чего зрелые личинки покидают питательную среду. В результате получается биомасса живых личинок и переработанный ими пищевой субстрат. Биомасса используется для извлечения целевых продуктов биологического синтеза из гемолимфы личинок, остатки биомассы могут использоваться в качестве источника кормового белка и жиров. Переработанные отходы могут быть использованы в качестве готового к употреблению органического удобрения. Таким образом, технология является полностью безотходной, не требует использования каких-либо дополнительных химических веществ или высокотемпературной обработки отходов. Все процессы проходят при комнатной температуре. Экспериментально установлено, что для переработки отходов по предлагаемой технологии могут использоваться личинки Calliphora vicina, C. vomitoria, Lucilia sericata. Культуры этих видов поддерживаются в лаборатории и доступны для промышленного использования. На данном этапе реализации проекта базовым методом является биосинтез in situ иммунизированными личинками C. vicina комплекса антимикробных пептидов. Этот вариант технологии апробирован в серии из16 независимых экспериментов. Во всех экспериментах получены образцы комплекса с заданными характеристиками антимикробной активности. Титр дефензинов (M. luteus тест) в серии опытов варьировал в пределах 3%, суммарный титр анти-грамотрицательных пептидов (E. coli тест) в пределах 5% средних значений. Таким образом, разработанная технология обеспечивает получение целевого продукта с заданными свойствами и минимальным уровнем варьирования. Состав антимикробных пептидов полученного комплекса изучен с использованием комбинации методов хроматографии, масспектрометрии, транскриптомного анализа и биотестирования антибактериальной активности. В результате установлены полные сиквенсы представителей четырех семейств антимикробных пептидов С. vicina: дефензинов, цекропинов, диптерицинов и пролин-богатых пептидов. Детально изучена антимикробная активность комплекса в отношении планктонных и биопленочных форм патогенов человека. Особо следует отметить результаты, полученные на резистентных к антибиотикам биопленкам кишечной палочки E. coli, Staphylococcus aureus и Acinetobacter baumannii. Эти формы бактериальных инфекций относятся к числу наиболее трудноизлечимых и требующих срочного поиска новых лекарственных веществ. Препараты этого типа крайне востребованы в медицине и могут найти применение при лечении широкораспространенных резистентных к антибиотикам заболеваний: раневых инфекций, язв, гнойных инфекций кожи, урогенитальных инфекций, инфекций полости рта и дыхательных путей. Кроме того, из гемолимфы личинок C. vicina выделен, очищен от примесей и охарактеризован белок арилфорин с молекулярной массой 500 килодальтон, состоящий из 7 субъединиц массой 70 килодальтон каждая. Белок относится к классу гемоцианинов, известному по литературным данным своими противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами. Этот белок может найти применение в медицине и биотехнологии, аналогичное белку KLH (keyhole limpet hemocyanin), ключевому компоненту для производства вакцинных препаратов (конъюгированных вакцин). KLH получают из природного сырья – одного из видов морских моллюсков, обитающих только в Калифорнии (США). В России отсутствует сырьевая база для производства вакцин на основе KLH, которые в массовом порядке разрабатываются и внедряются в медицину в США для лечения и профилактики рака и вирусных инфекций. Предлагаемая технология позволяет производить аналог KLH, не уступающий ему по качеству, но значительно более дешевый и с гарантированной доступностью. Создана база матричных РНК C. vicina, которая содержит информацию о полном спектре белков и пептидов, синтезируемых личинками в период иммунного ответа (№ SUB2063450, GenBank TSA название “Calliphora vicina Transcriptome”). Установлены сиквенсы более 500 пептидов четырех классов (дефензинов, цекропинов, диптерицинов и пролин-богатых пептидов). Установлена также структура ключевых доменов белка арилфорина. В перспективе база данных обеспечит быстрое установление структуры других целевых продуктов, которые могут получаться при помощи предлагаемой технологии. Среди продуктов, синтезируемых личинками C. vicina, нами ранее были обнаружено семейство иммуномодулирующих пептидов – аллоферонов. Синтетические аллофероны в настоящее время используются в качестве противовирусных лекарственных средств. Предлагаемая технология позволяет получать их методом биосинтеза, параллельно с другими продуктами. Проведенные исследования позволили уточнить механизм действия аллоферонов на клетки иммунной системы человека и показали, что аллофероны (применяемые отдельно или в составе получаемого из личинок комплекса пептидов, помимо известного применения для лечения вирусных инфекций, могут найти применение в качестве противоопухолевого препарата.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Основной целью проекта является создание биотехнологии комплексной переработки органических отходов пищевой промышленности с целью получения продуктов с высокой добавленной стоимостью, а именно биологически активных веществ, продуцируемых личинками насекомых-сапрофагов. На предыдущем этапе реализации проекта разработан базовый вариант технологии, в котором в качестве продуцента биологически активных веществ используется синяя мясная муха Calliphora vicina (семейство Calliphoridae), а сырьем для переработки служит кровь кур. Годовое производство крови кур составляет порядка 4.5 миллионов тонн, а ее утилизация представляет значительные технические и экономические трудности. Основным способом утилизации крови в настоящее время служит технология рендеринга – термической сушки, обеззараживания и превращения в кормовой продукт – кровяную муку. Технология рендеринга представляет крайне энергозатратный процесс, экономическая эффективность которого ограничена относительно низкой себестоимостью конечного продукта. Реализация настоящего проекта позволяет заменить технологию рендеринга на биологический процесс, используемый в природных экосистемах – утилизацию органических отходов личинками мух-сапрофагов. Этот процесс обеспечивает быструю биодеградацию отходов и получение двух видов продуктов – биомассы личинок и органического удобрения (зоокомпоста). Как и в случае рендеринга, основным ограничением биологической переработки является проблема экономической эффективности. В настоящем проекте впервые предлагается решение этой проблемы – использование личинок в качестве эукариотической системы для производства продуктов тонкого биологического синтеза. Предлагаемое решение позволяет получать известные продукты переработки отходов (белковые кормовые добавки и органические удобрения), но дополняет новыми продуктами с высокой добавленной стоимостью. На данном этапе реализации проекта наиболее перспективной группой таких продуктов представляются антимикробные пептиды, продуцируемые иммунокомпетентными клетками личинок в процессе иммунного ответа. Химическая структура, биологические свойства и методы управления биосинтезом антимикробных пептидов изучены авторами в серии многолетних исследований, лежащих в основе настоящего проекта. В отчетный период одной из задач проекта была разработка методов и средств масштабирования технологии получения комплекса антимикробных пептидов. Прежде всего, следовало решить две технические проблемы – массовой иммунизации (индукции синтеза антимикробных пептидов) и выделения из биомассы личинок гемолимфы, содержащей комплекс антимикробных пептидов. Эту задачу удалось решить, создав методы и устройства для введения иммуногена и сепарации гемолимфы. Найденные решения доступны дальнейшему масштабированию в процессе перехода к технологии промышленного уровня. Следующей задачей проекта в отчетный период было дальнейшее изучение комплекса антимикробных пептидов C. vicina как кандидата в лекарственные вещества, предназначенные для лечения резистентных к антибиотикам форм бактериальных инфекций. Созданная база мРНК личинок C. vicina, находящихся в состоянии иммунного ответа на бактериальную инфекцию, позволила уточнить структуру активных компонентов комплекса (антимикробных пептидов из семейств дефензинов, диптерицинов, цекропинов и пролин-богатых пептидов). При помощи комбинации методов хромато-масспектрометрии и биологического тестирования установлено, что основным фактором разрушения биопленок грамположительных бактерий являются дефензины, а грамотрицательных бактерий – диптерицины. Экспериментально доказана высокая антимикробная активность комплекса в отношении бактериальных биопленок, образуемых наиболее распространенными патогенами человека Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii. Биопленки служат причиной примерно 80% бактериальных инфекций человека, ряда форм рака и сердечно-сосудистых заболеваний. Большинство биопленок отличаются природной устойчивостью к антибиотикам. Установлено, что антибиопленочное действие комплекса направлено на уничтожение клеток-персистеров и разрушение матрикса биопленки, то есть нейтрализует два основных механизма устойчивости биопленок к антибиотикам. Показано, что комплекс нетоксичен для клеток человека и позволяет снизить терапевтически эффективную концентрацию большинства изученных антибиотиков до клинически достижимого уровня, необходимого для эффективного лечения биопленочных инфекций. Таким образом, комплекс антимикробных пептидов C. vicina может быть использован для лечения биопленочных инфекций самостоятельно или в качестве адъюванта (синергиста) антибиотиков. Создание подобных адъювантов считается одним из перспективных направлений повышения эффективности антибиотиков. В настоящее время эта ниша в медицине и ветеринарии остается практически незаполненной. В состав комплекса входит не менее 15 антимикробных пептидов четырех семейств, отличающихся сложной пространственной организацией (дефензины), посттрансляционной модификацией (диптерицины). Производство такого сложного комплекса (и даже его отдельных компонентов) методами химического или генно-инженерного синтеза практически невозможно с технической и экономической точек зрения и не имеет прецедентов. Предлагаемая технология эту задачу технически разрешимой и экономически целесообразной. Возможности предлагаемой биотехнологии не ограничиваются получением комплекса антимикробных пептидов. В частности, в отчетный период освоен метод получения и очистки одного из ключевых элементов комплекса – дефензина. В настоящее время на рынке присутствуют дефензины человека и некоторых других организмов, получаемые методами генной инженерии и используемые в научных исследованиях. Предлагаемая технология позволяет получать природный дефензин с более низкой себестоимостью и перспективой применения в качестве научного реактива и лекарственного препарата (например, для лечения стафилококковых инфекций). Параллельно из биомассы личинок можно получать и другие биологически активные белки и пептиды. Исследования в этом направлении планируется продолжить на третьем этапе реализации проекта. Информация о проекте в Интернет-ресурсах: Исследование иммунитета насекомых поможет создать новые антибиотики https://www.gazeta.ru/science/news/2017/04/28/n_9983489.shtml А.Яковлев Один в поле не воин: природная антимикробная система эффективнее антибиотика https://biomolecula.ru/articles/odin-v-pole-ne-voin-prirodnaia-antimikrobnaia-sistema-effektivnee-antibiotika

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Идея проекта состояла в конверсии отходов птицеводства в продукты с высокой добавленной стоимостью. Для её реализации была разработана технология перевода куриной крови в биомассу личинок синей мясной мухи Calliphora vicina. Опыт и знания коллектива лаборатории в области иммунологии насекомых были использованы для индукции синтеза во вновь полученной биомассе веществ с антимикробной (FLIP7) и иммуноадъювантной (арилфорин) активностями и их последующей экстракции. Отдельным направлением проекта стали исследования, направленные на изучение возможных областей практического применения этих веществ. За отчетный период была доработана масштабируемая технология перевода куриной крови в биомассу личинок C.vicina. Определены оптимальные диапазоны показателей, регулирующих жизненный цикл продуцента (фотопериод, температура, плотность заселения субстрата, влажность) и позволяющие полностью утилизировать пищевой субстрат. Конечной точкой этого этапа технологии является диапауза, позволяющая накапливать значительную биомассу продуцента. Возможность использования в качестве продуцентов личинок других видов мух-каллифорид позволяет смещать акцент технологии в сторону увеличения выхода биомассы продуцента либо утилизации больших объёмов субстрата. Решён вопрос с микробиологической безопасностью и воспроизводимостью биотехнологического процесса. Проведены расчёты экономической эффективности технологии. Обобщенные данные, касающиеся всех этапов разработанной технологии, включая детальные условия, параметры и расчёты, относящиеся к процессам получения биомассы и целевого продукта, изложены в рукописи статьи, поданной в Poultry Science (Oxford University Press) – журнал №1, посвященный проблемам птицеводства (https://academic.oup.com/ps/pages/About). Наиболее перспективными областями применения целевых продуктов определены борьба с резистентными микроорганизмами и повышение эффективности вакцинации в ветеринарии и медицине. Проведенные исследования показали прямую активность комплекса антимикробных пептидов FLIP7 в отношении биоплёночных форм бактериальных инфекций и его адъювантные свойства при комбинированном применении с антибиотиками. Подтверждена возможность элиминации клеток-персистеров, являющихся причиной неустойчивой эффективности активных антибиотиков. Определены синергические пары FLIP7 с представителями четырех классов антибиотиков и показаны возможности расширения для них «фармакологического окна». Полученные результаты были опубликованы в 2018 году в журнале Infection and Drug Resistance. За четыре недели после публикации статья была просмотрена на сайте журнала 723 раза, авторы проекта получили от редакции приглашение вступить в группу привилегированных авторов. На момент подачи отчёта статья была просмотрена более 6000 раз, pdf-файл статьи скачан более 600 раз (https://www.dovepress.com/article_metric.php?article_id=37655). Проведена оценка стабильности комплекса FLIP7 в предложенной гелевой форме. Совместно с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института птицеводства разработана и проведена программа по изучению адъювантных свойств арилфорина. В сравнительных опытах на моделях профилактики инфекционных заболеваний кур показана сопоставимая эффективность арилфорина, KLH («золотого стандарта» карьерных белков) и стандартного адъюванта, применяемого в ветеринарии. При этом появление специфичных антител и достижение их протективного уровня в группе с арилфорином происходило на неделю раньше. Данные по этому направлению проекта готовятся к публикации.