Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Методом количественной ПЦР и Вестерн-блоттинга проанализирована экспрессия ряда компартмент-специфичных компонентов Chlamydomonas reinhardtii при действии низких температур и разном содержании кислорода в среде с целью выбора оптимальных «маркеров» для исследований стратегии выживания микроорганизма в условиях холода и гипоксии. В частности было установлено, что низкая температура индуцирует экспрессию трех генов, кодирующих шапероны семейства HSP70 - HSP70B, HSP70C и HSP70A, которые локализированы в хлоропласте, митохондриях и цитоплазме соответственно (Maikova et al., 2016). В работе показана также индукция холодом других компонентов, функционирующих с белками HSP70 - CGE1, CDJ1, HSP90C and HSP90A. Примечательно, что экспрессионные профили HSP70-генов в условиях гипер- и гипотермии значительно различаются. По нашим данным низкая температура контролирует не только транскрипцию, но и альтернативный сплайсинг: в условиях холодового стресса в клетках увеличивается уровень изоформы 1a CGE мРНК (Maikova et al., 2016). Впервые для представителя фотосинтезирующих эукариотических микроорганизмов выявлена индукция низкой температурой гена HSF1, кодирующего белок из консервативного семейства HSF. Кроме того, при холодовом стрессе зафиксирована индукция генов, кодирующих глутатионпероксидазы GPX1, GPX3 и GPX5, которые локализованы в хлоропласте (GPX1, GPX5) и митохондриях (GPX3), увеличение уровней транскрипции последнего происходит в 50 раз, на основании чего GPX3 выбран в качестве одного из маркеров ответа ни гипотермию. Подобно другим фотосинтезирующим организмам клетки Chlamydomonas регулярно испытывают воздействие гипоксии. В ходе изучения регуляции синтеза различных клеточных компонентов Chlamydomonas в условиях гипоксии был получен фактический материал, впервые показывающий, что альтернативная оксидаза 2, локализованная в митохондриях, индуцируется при снижении уровней кислорода в среде, при этом экспрессионные профили АОХ2-гена в условиях темновой и световой гипоксии значительно различаются (Ostroukhova et al., 2016). В отличие от АОХ2, ген АОХ1 не контролируется действием гипоксии. Поскольку транскрипционный фактор CRR1 регулирует в клетках Chlamydomonas транскрипцию ряда генов в условиях гипоксии, нами была проверена роль CRR1-регулятора в контроле экспрессии АОХ2. Для этой цели методом экспрессии искусственных микроРНК были получены amiRNA-CRR1-трансформанты со сниженными уровнями CRR1. Анализ полученных штаммов позволил доказать роль транскрипционного регулятора CRR1 в контроле экспрессии АОХ2 в условиях гипоксии (Ostroukhova et al., 2016). АОХ2 выбран в качестве маркера на действие гипоксии. Кроме того, сравнительный анализ транскрипции 12 ТНВ-генов, кодирующих «усеченные» гемоглобины показал, что в условиях световой гипоксии индуцируются гены ТНВ1, ТНВ2 и ТНВ12, а в условиях холодового стресса – ген ТНВ4. Подтверждено высказанное ранее предположение, о том, что разные ТНВ-гены, индуцируются в определенных стрессовых условиях и эти условия для них различаются. В результате исследований нами выбран ТНВ1, для последующего анализа его функций в условиях гипоксии. Кроме того, нами выявлены гены (GPX3, ТНВ1 и АОХ2), экспрессия которых индуцируется соединениями - донорами NO (DEA-NONOate и GSNO). Предварительные данные предполагают включение NO в контроль экспрессии указанных генов, индуцируемых холодом и гипоксией.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Впервые выявлены две группы генов Chlamydomonas reinhardtii, по-разному регулируемых в условиях, охарактеризованных в литературе как «световая аноксия» (голодание по сере на свету): (1) гены, которые контролируются в аддитивной манере двумя сигналами «отсутствие серы в среде» и «анаэробиоз» (Zalutskaya et al., 2017, Plant Physiol Biochem) или (2) гены, которые контролируются только сигналом «голодание по сере» (Minaeva et al., 2017, PLoS ONE). На примере гена-маркера условий анаэробиоза FDX5, кодирующего ферредоксин 5, установлено, что транскрипционный фактор CRR1, регулирующий экспрессию в условиях аноксии, не включен в транскрипционный контроль в условиях голодания по сере. Вместе с тем, сигнал «удаление серы из среды» запускает транскрипцию FDX5 с участием серин-треониновой киназы SNRK2.1 (Zalutskaya et al., 2017, Plant Physiol Biochem). Последнее обстоятельство позволяет рассматривать ферредоксин 5 не только как компонент ответа на аноксию, но и в качестве нового элемента общей регуляторной сети, контролирующей адаптацию одноклеточной водоросли к условиям недостатка/отсутствия серы. Изучение регуляции и функций представителя семейства «усеченных» гемоглобинов (ТНВ) Chlamydomonas, белка ТНВ1, в условиях световой гипоксии позволило выявить новую функцию белков семейства – контроль адаптивного клеточного ответа на удаление из среды источников серы (Minaeva et al., 2017, PLoS ONE). Установлено, что экспрессия генов, кодирующих транспортеры сульфата и внеклеточные арилсульфатазы, контролируется окисью азота в ТНВ1-зависимом сигнальном пути. Кроме того, доказано, что ТНВ1 выполняет двойную функцию: в детоксикации окиси азота и координации голодания по сере с ассимиляцией нитрата. Т.о., получены приоритетные данные, подтверждающие нашу гипотезу о том, что ТНВ-белки Chlamydomonas вовлечены в защиту клеток при комплексных стрессовых воздействиях. Проанализирована роль окиси азота в экспрессии альтернативных оксидаз Chlamydomonas при аэробных условиях (Zalutskaya et al., 2017, J Plant Physiol). Как и ожидалось, уровни индуцируемой в условиях аноксии АОХ2 (Ostroukhova et al., 2017, Europ J Protistol) в аэробных условиях были значительно ниже уровней АОХ1 даже при наличии генераторов окиси азота (Zalutskaya et al., 2017, J Plant Physiol). Анализ регуляции и функций представителя семейства глутатионпероксидаз, белка GPX3, в условиях гипотермии не выявил ключевую роль этого фермента в процессах выживания клеток и их защиты от перекиси в условиях холода, что предполагает участие дополнительных антиоксидантных систем в адаптации к действию низких температур. Кроме того, сравнительный анализ транскрипции пяти FXL-генов, кодирующих FixL-подобные белки Chlamydomonas, при действии на клетки низкой температуры и анаэробиоза показал, что в только в условиях темновой аноксии происходит транскрипция четырех FXL-генов, и наибольшие уровни экспрессии (15-25 раз) демонстрирует ген FXL8; последнее обстоятельство позволяет предполагать вовлечение FXL8 в восприятие уровней кислорода при переходе к анаэробным условиям в темноте.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Полученные в 2018 году данные свидетельствуют о том, что из трех проанализированных классов антиоксидантных ферментов в условиях гипотермии одноклеточная водоросль Chlamydomonas использует глутатионпероксидазы, которые функционируют в разных компартментах клетки (цитозоле, хлоропласте и митохондриях); представители семейств каталаз и аскорбатпероксидаз используются Chlamydomonas, по-видимому, при стрессовых условиях, отличных от гипотермии (Zalutskaya et al., 2019, Russ J Plant Phzsiol).. Впервые установлено, что при низкотемпературном воздействии Chlamydomonas аккумулируют пролин, который может функционировать как защитно-адаптивная молекула, и предположительно может быть вовлечен в защиту от АФК при гипотермии. Впервые изучены функции представителя семейства альтернативных оксидаз 2 в условиях гипоксии и подтверждена наша гипотеза о том, что АОХ2 Chlamydomonas вовлечен в адаптацию клеток при их переходе к анаэробиозу, снижая уровни перекиси. Полученные результаты позволяют пересмотреть существующую парадигму о белках АОХ2 фотосинтезирующих организмов, как компонентах митохондрий, не включенных в адаптацию к стрессам. Усеченные гемоглобины 1 и 2 не являются компонентами, вовлеченными общую регуляторную сеть ответа на световую гипоксию, а контролируются окисью азота, которая по нашим данным играет роль «триггера» регуляторной сети. В результате проведенных исследований охарактеризованы новые компоненты – ТНВ1 и NO, осуществляющие «тонкую настройку» результирующего ответа водоросли на первом этапе адаптивного ответа в условиях световой гипоксии (Zalutskaya et al., 2018). Впервые проведен анализ путей формирования окиси азота в отсутствие нитрата в среде и установлено, что система нитратредуктаза - NO-формирующая нитритредуктаза (NR – NOFNiR) вовлечена в процесс формирования окиси азота и индукцию ТНВ1 в клетках на первом этапе световой гипоксии (удаление серы на свету) (Zalutskaya et al., 2018); в условиях темновой гипоксии окись азота формируется независимо от системы NR – NOFNiR (Ostroukhova, Ermilova, 2019). Анализ трансформантов со сниженными уровнями FХL8 не подтвердил роль FХL8-белка Chlamydomonas как ключевого сенсора кислорода, вовлеченного в адаптивный ответ клеток к условиям гипо- и аноксии. Выполнение запланированных работ позволило нам охарактеризовать новые, неизвестные ранее функции усеченных гемоглобинов и выявить основные компоненты и сигнальные молекулы, вовлеченные в двух-этапный контроль адаптации к световой гипоксии, и в регуляцию ответов на гипоксию и гипотермию.