Аннотация результатов, полученных в 2016 году
По направлению 1 (гистологическое исследование сетчатки воробьиных птиц с целью поиска магнетит-содержащих структур) проведена подготовка, сбор и первичная обработка гистологического материала, который может содержать структурные элементы магнитного компаса. Мы полагаем, что такие элементы – активируемые изменением магнитного поля светозависимые молекулы - могут быть локализованы в наружных сегментах синечувствительных колбочек сетчатки перелетных воробьиных птиц, таких как зарянки, пеночки-веснички, мухоловки-пеструшки. Материал от воробьиных птиц, находящихся в осеннем миграционном состоянии, собран, зафиксирован, препараты для гистологического исследования приготовлены. В настоящее время идёт проверка качества фиксации и заливки препаратов, а также подготовка блоков для резки с использованием алмазного ножа и ультрамикротома Leica. По направлению 2 (электрофизиологическое исследование магниторецепции сетчатки птиц) создана экспериментальная установка для регистрации электроретинограммы (ЭРГ) от сетчатки птиц в условиях заданного меняющегося магнитного поля (МП). При создании установки для регистрации электроретинограммы в рамках данного проекта возникла необходимость решить ряд новых для нас задач: а) Выбор помещения под экспериментальную установку с адекватными показателями магнитного поля. б) Конструирование частей установки и вспомогательных конструкций для размещения компонентов экспериментального оборудования из немагнитных материалов. в) Встраивание в установку для записи ЭРГ колец Гельмгольца для контролирования магнитного поля. г) Создание системы термостабилизации омывающего сетчатку раствора. Все эти задачи, имеющие ключевое значение для успешного выполнения проекта, были нами успешно решены. Установка создана, отлажена и готова для начала работы по регистрации ЭРГ от изолированной сетчатки птиц. По направлению 3 (проведение поведенческих экспериментов по ориентации птиц в круговых аренах при локальном приложении слабого переменного магнитного поля) созданы работающие образцы миниатюрных носимых магнитных катушек, с помощью которых возможно локальное приложение переменного поля амплитудой ок. 5 нТл. Проведены пилотные эксперименты, направленные на то, чтобы добиться нормального ориентационного поведения от мигрирующих птиц, несущих такие катушки. Это является нетривиальной задачей, т.к. необходимо минимизировать стрессорное воздействие носимой катушки на экспериментальное животное. Если стрессорное воздействие будет слишком сильным, птицы не будут проявлять спонтанную ночную локомоторную активность, и проведение ориентационных экспериментов окажется невозможным. Был создан вариант массогабаритной модели миниатюрной магнитной катушки и генератора синусоидальных колебаний и проведены поведенческие эксперименты с птицами, несущими такую модель. Наблюдения за поведением птиц проводили с использованием видеорегистрации в течение всех суток (24 ч), что дало возможность оценить поведение птиц в дневное и ночное время. Наблюдения в дневное время позволили отработать способ крепления миниатюрной магнитной катушки и генератора, наблюдения в ночное время – оценить влияние массогабаритной модели на проявление ночного беспокойства у птиц. Крепление генератора синусоидальных колебаний было осуществлено по типу крепления миниатюрных передатчиков, которые в настоящее время широко используются для изучения перемещений свободноживущих птиц локального и географического масштаба. Такое устройство крепится на спину птицы с помощью двух петель из эластичной тонкой резинки в тканевой оплетке, которые одеваются на ноги птицы. Ночное видеонаблюдение за птицами, несущими массогабаритные модели, показало, что такие птицы проявляют типичное поведение для ночного миграционного беспокойства птиц в неволе («wing whirring» и прыжки с жердочки на жердочку). В период развитого миграционного состояния птицы, которые проявляли миграционное беспокойство до прикрепления катушки, продолжают его проявлять в последующие ночи и после прикрепления массогабаритной модели. Таким образом, мы разработали новый не имеющий аналогов метод приложения переменных магнитных полей к тем органам тела мигрирующей птицы, которые преположительно могут быть ответственны за компасную магниторецепцию. В частности в рамках данного проекта мы можем прилагать переменные магнитные поля только к сетчатке, без воздействия на гипотетический надклювный орган или на лагену внутреннего уха. Нарушение магнитной ориентации при воздействии переменных магнитных полей считается диагностическим признаком химического механизма магниторецепции, основанного на реакции радикальных пар. По направлению 4 показано место магнитного компаса в системе ориентации птиц. Кроме того, выполнено теоретическое обоснование возможности существования гибридного магниторецептора, состоящего из фото- и магниточувствительной молекулы криптохрома и ферромагнитной микроструктуры. Проведена оценка возможности обеспечить наблюдаемую чувствительность к переменным магнитным полям с помощью простейшей модели гибридного магниторецептора, состоящая из магниточувствительной молекулы криптохрома и однодоменного нанокристалла магнетита, играющего роль магнитной антенны. Для этого мы рассчитывали магнитную восприимчивость такого нанокристалла и частотный спектр флуктуаций его магнитного момента. Показано, что необходимый коэффициент усиления по магнитному полю легко может быть реализован с помощью нанокристалла магнетита со слабой анизотропией формы. Однако спектральная плотность магнитных флуктуаций, создаваемых таким нанокристаллом в частотном диапазоне до 10 МГц, где наблюдается повышенная чувствительность магнитного компаса птиц к переменным магнитным полям, весьма высока. Сопоставление с результатами поведенческих экспериментов по дезориентации птиц широкополосными шумовыми магнитными полями показывает, что собственные шумы магнитной антенны оказываются выше, чем усиленный ей внешний шумовой сигнал, при любых реалистичных параметрах нанокристалла магнетита. Хотя эксперименты по влиянию шумовых электромагнитных полей на ориентацию птиц (Engels S., Schneider N.L., Lefeldt N., Hein C.M., Zapka M., et al. 2014. Anthropogenic electromagnetic noise disrupts magnetic compass orientation in a migratory bird. Nature 509, 353–356) потенциально были не вполне свободны от методических недостатков, нами сделан вывод, что для понижения уровня собственных шумов магнитной антенны гипотетический гибридный магниторецептор должен иметь более сложную структуру. В настоящее время мы анализируем свойства одной из перспективных структур, состоящей из нескольких анизотропных нанокристаллов магнетита.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
По направлению 1 (морфологическое исследование потенциально магниторецепторных структур в сетчатке птиц) был собран и зафиксирован материал от трёх видов мигрирующих птиц, имеющих магнитный компас: мухоловки-пеструшки, пеночки-веснички и садовой славки. Были продолжены поиски в сетчатке морфологических структур, которые можно подозревать в способности реагировать на изменение магнитного поля. Предполагалось, что эти структуры должны содержать молекулы, обладающие магнитными свойствами. Были получены изображения сетчатки куриц и мигрирующих воробьиных птиц с помощью методов электронной микроскопии. Полученные к настоящему моменту изображения пока не позволили установить наличие упорядоченных ферромагнитных структур ни в области наружных сегментов фоторецепторов, ни в области ганглиозных клеток. Однако на настоящий момент мы не готовы утверждать отсутствие таких структур; для такого утверждения необходимы дополнительные исследования как с помощью морфологических методов, так и с помощью физических методов исследования сетчатки. Кроме того, наши исследования показали, что методом масс-спектрометрии железо в тотальном препарате сетчатки цыплят не определяется. Методом атомно-эмиссионной спектроскопии удается надежно определить содержание железа в тотальном препарате сетчатки, что могло бы открыть перспективы для определения железа в срезах разных слоев сетчатки, т.е. в условиях, когда масса исследуемого образца станет в несколько раз меньше, чем используемая в описанных выше экспериментах. Однако для измерения концентрации железа в пробах необходимо получать их без применения железосодержащего инструментария. С другой стороны, единственный известный нам способ получения срезов сетчатки включает ее замораживание и применение криотома, где главным действующим элементом является стальной нож. Поэтому получение срезов сетчатки без привнесения туда значительного количества внешнего железа на данный момент не представляется возможным. По направлению 2 (электрофизиологическое исследование сетчатки глаза у цыплят) нам к настоящему моменту удалось установить, что направление магнитного поля не влияет на амплитуду и кинетику ответов сетчатки на одиночные вспышки света, а также что вращение магнитного поля при постоянной фоновой засветке не приводит к какому-либо отклику сетчатки, который можно было бы интерпретировать как магниторецепторный ответ. Таким образом, пока можно сделать предварительный вывод о том, что либо магнитное поле не модулирует электрические процессы в сетчатке цыплят, либо что наш экспериментальный метод (или конкретные протоколы) не позволяют выявить такое влияние. Проведены первые эксперименты на диких птицах (сизых голубях), интерпретацию результатов которых мы пока считаем преждевременной. По направлению 3 (проведение поведенческих экспериментов по ориентации птиц в круговых аренах при локальном приложении слабого переменного магнитного поля) нами ранее были созданы работающие образцы миниатюрных носимых магнитных катушек, с помощью которых возможно локальное приложение переменного поля амплитудой ок. 5 нТл. В отчётном году нам удалось добиться проявления нормального ориентационного поведения от мигрирующих птиц (садовых славок), несущих такие катушки. Поведенческие тесты, с помощью которых мы проверяем способность птиц в неволе ориентироваться по магнитному полю, основаны на анализе кругового распределения спонтанной ночной миграционной активности (Zugunruhe), которую проявляют воробьиные - ночные мигранты в миграционной период при содержащии в неволе. Если птицы испытывают слишком сильный стресс по тем или иным причинам (например, из-за того, что им не нравится прикреплённые к их туловищам и головам устройства), они просто не проявляют спонтанного ночного беспокойства, и проведение экспериментов оказывается невозможым. Нам удалось добиться того, что 95% содержащихся в неволе в миграционный период садовых славок проявляют нормальное ночное миграционное беспокойство с закреплёнными на них устройствами (мини-генераторами переменного магнитного поля). Нами также получены предварительные результаты поведенческих экспериментов, содержательное обсуждение которых мы, однако, считаем преждевременным из-за недостаточного размера выборки. В 2018 г. мы предполагаем провести массовые эксперименты для точной локализации в районе головы птицы рецептора, отвечающего за работу магнитного компаса.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
По направлению 1 (поиск потенциально магниторецепторных структур на основе частиц железа в сетчатке птиц) в 2018 году было определено содержание железа в разных слоях сетчатки методом электронно-зондового микроанализа. Работа была проведена на базе лаборатории функциональной микроскопии биоструктур (Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, Россия). Анализ проводился для залитых в смолу Epon 812 срезов сетчатки зарянки, с помощью сканирующего электронного микроскопа-микроанализатора JSM-U3 (JEOL, Япония), оснащенного кристалл-дифракционными спектрометрами рентгеновского излучения. Выбор подходящей подложки для закрепления срезов перед проведением микроанализа происходил путем ее проверки на содержание железа, которое могло бы давать фон и искажать результаты детектирования излучения от атомов, содержащихся в самом препарате. Это производилось путем сравнения интенсивности излучения на длине волны, характерной для К альфа линии железа и фона, определяемого как среднее между интенсивностями на длинах волн тормозного излучения, отстоящих от нее на одинаковое расстояние. Подходящей для анализа подложкой оказалась только медная сеточка для электронной микроскопии. Для срезов сетчатки был проведен анализ распределения железа, а также двух элементов, характерных для биологических образцов – фосфора и серы. Согласно полученным картинам распределения железа в сетчатке зарянки и прилежащих тканях, для этого элемента не наблюдается колокализации с какими-либо конкретными слоями клеток, более того, концентрация железа в препарате слишком мала, чтобы уверенно утверждать, что она отличается от фонового излучения. Также не удалось обнаружить локальных областей с высокой концентрацией железа, которые могли бы соответствовать комплексам нанокристаллов магнетита, чье существование предсказывается в рамках гибридной модели магниторецептора. Кроме того, была проведена серия экспериментов по поиску магнитных материалов в различных частях головы птиц методом нелинейного высокочастотного магнитного отклика в сотрудничестве с В.А. Рыжовым (Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова), с которым был заключён договор о проведении НИР. Выделяли образцы сетчатки глаз, мозга, аппарата внутреннего уха, надклювья, костей черепа. Образцы подвергали совместному воздействию параллельных переменного (на частоте 15,7 МГц) и постоянного магнитных полей. Детектировались синус- и косинус- компоненты второй гармоники высокочастотного магнитного отклика в зависимости от величины постоянного магнитного поля. Форма и амплитуда получающихся кривых дают информацию о виде и количестве магнитного материала в образце. В некоторых образцах лаген внутреннего уха славки-черноголовки и зарянки обнаружены интенсивные сигналы специфической формы, аналогичные наблюдавшимся ранее в ферроколлоидах на основе нанокристаллов магнетита. Проведённый нами теоретический анализ динамики намагниченности ферроколлоидов выявил специфический механизм формирования высокочастотного магнитного отклика в таких системах, обусловленный модуляцией спиновой температуры в ансамбле взаимодействующих магнитных моментов наночастиц. Этот механизм приводит к характерной дисперсионной зависимости амплитуды второй гармоники от постоянного магнитного поля в диапазоне нескольких десятков гаусс и к её отрицательному фазовому сдвигу, т.е. к противоположным знакам синус- и косинус- компонент (K.V. Kavokin, V.A. Ryzhov, «Spin thermodynamics of magnetic nanoparticles in ferrofluids probed by the nonlinear high-frequency magnetic response», статья находится на рецензии в журнале Physical Review B). Разработанная нами теория позволяет идентифицировать эти сигналы как исходящие от ферроколлоида, образованного суперпарамагнитными частицами магнетита или маггемита размером порядка 10 нм, с объёмной долей магнитного материала около 1%. Объём ферроколлоида в образце оценивается в сотые доли кубического миллиметра. Наши результаты согласуются с данными Харады и соавторов (Harada et al. 2001. Magnetic materials in otoliths of bird and fish lagena and their function. Acta Otolaryngol. 121: 590–595), ранее обнаруживших высокую концентрацию атомов железа в лагене птиц методом рентгенофлюоресценции, который не даёт информации о магнитных свойствах железосодержащего материала. Следует подчеркнуть, что интенсивность и характерная форма сигналов исключают их объяснение случайными магнитными загрязнениями или присутствием фоновых концентраций биогенных оксидов железа. По направлению 2 (электрофизиологические исследования) в 2018 г. были проведены эксперименты по регистрации электроретинограммы (ЭРГ) от изолированной сетчатки птиц в условиях модулируемого магнитного поля (МП). Ранее в поведенческих опытах было показано, что птицы способны ориентироваться при освещении коротковолновым, но не длинноволновым светом (Wiltschko et al. 2010. J. R. Soc. Interface 7: S163-S177). Можно ожидать эффекта изменения МП при синих вспышках/фоновых засветках, в то время как красные вспышки/засветки выступают в роли контроля, при которых эффекта изменения МП не ожидается. МП вокруг камеры с сетчаткой модулируется тремя парами взаимно перпендикулярных колец Гельмгольца. По результатам первой серии экспериментов было показано небольшое, но статистически значимое влияние инклинации внешнего МП на амплитуду полунасыщенных фотоответов изолированной сетчатки голубей на синие вспышки, которого не наблюдается при стимуляции красным светом. Данный результат согласуется с поведенческими данными о спектральной чувствительности магнитного компаса птиц. Выявленный эффект не воспроизводится при интенсивности МП в 300 мкТл, что может свидетельствовать о существовании функционального окна, т.е. специфической настройки магнитного компаса в сетчатке к интенсивности МП, характерной для геомагнитного поля. Вращение вектора МП не оказало воздействия на спектр мощности ответа сетчатки. Примененный метод позволяет регистрировать работу сетчатки в целом, но велика вероятность того, что на изменения МП реагируют только определенные клеточные элементы сетчатки, поэтому наблюдаемый эффект оказался невелик. Поэтому мы перешли к следующей серии экспериментов, в которой регистрировали отдельно выделенный потенциал фоторецепторных клеток, которые предполагаются наиболее вероятным местом локализации магниторецепторных структур. С этой целью регистрация ЭРГ проводится сходным образом, но фармакологически исключается вклад в ответ мюллеровских (глиальных) клеток сетчатки (добавление хлорида бария, блокирующего их калиевые каналы) и вклад биполярных и ганглиозных клеток (добавление аспартата натрия, пресекающего глутаматергическую передачу сигнала к ним от фоторецепторов). Амплитуда выделенных фоторецепторных ответов сетчатки голубей не продемонстрировала статистически значимой зависимости от инклинации МП, при этом сравнение амплитуд ответов на синие вспышки для препаратов «красного» поля, богатого длинноволновыми колбочками, где потенциально могут содержаться первичные сенсоры магнитного поля, дало также статически незначимое различие. Нельзя исключать, что количество фоторецепторов, которые генерируют сигнал в ответ на изменения направления МП очень мало относительно общего числа фоторецепторов, и обнаружение их отклика в общей ЭРГ может требовать очень большого объема выборки, которого при таких трудоемких экспериментах тяжело достигнуть. На основании полученных данных целесообразным представляется а) повторение такого же протокола на перелетных птицах, наличие магнитного компаса для которых надежно показано в поведенческих экспериментах, и б) переход к одноклеточным отведениям от фоторецепторных клеток при модуляции направления МП. Регистрация ЭРГ от изолированных сетчаток зарянок была начата в период весенней миграции 2018 г. Первые же эксперименты показали, что сетчатка зарянки более требовательна к условиям инкубации/перфузии и подготовки препаратов, чем сетчатка голубей. В результате интенсивной работы нам удалось подобрать среду, в которой препараты сетчатки зарянки продемонстрировали приемлемую кинетику фотоответов и хорошую переносимость протокола эксперимента. Удалось записать полный протокол (аналогичный описанному выше для голубей) для нескольких препаратов. Полученные результаты являются предварительными, объём материала следует увеличить в ходе дальнейших исследований. По направлению 3 (поведенческие эксперименты, направленные на выявление участия сетчатки в дезориентирующем эффекте переменного МП) исследования в 2018 г. показали следующее: 1) садовые славки способны ориентироваться по МП в закрытом помещении, которое было оборудовано для проведения данных работ; 2) птицы, тестируемые в круговых аренах, целиком помещенные в осциллирующее МП амплитудой в 5 нТл (диаметр катушки 0,75 м), были дезориентированы; 3) садовые славки, на которых надеты микрогенераторы, способны выбирать направление и демонстрировать соответствующее миграционному сезону направление активности в круговых аренах, когда генератор был выключен, т.е., без создания локального осциллирующего поля; 4) локальное приложение осциллирующего МП в области глаза выше пороговых значений амплитуды поля (2 нТл) и на Ларморовой частоте (1,403 МГц), нарушающих ориентацию садовых славок, не приводило к дезориентации птиц в нашем эксперименте. Птицы с включенными катушками показывали свойственное для этого вида в осенний период направление активности в круговых аренах. Направление активности, показанное садовыми славками с включенными генераторами переменного МП, статистически не отличалось от направления, которые показывали птицы без генератора (тест Мардиа-Уотсона-Уилера: W=0,15, p=0,93) и птицы с генераторами в положении выключен (Мардиа-Уотсона-Уилера: W=0,49, p=0,78). Мы показали, что эффект нарушения магнитной ориентации мигрирующих птиц в осциллирующем МП не связан с магниторецептором, наличие которого предполагается в сетчатке глаза, а имеет другие причины.