КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 16-15-10103

НазваниеКлеточные и молекулярные механизмы развития аутоиммунных заболеваний

РуководительНевинский Георгий Александрович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2016 г. - 2018 г.

Конкурс№13 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словааутоиммунные заболевания, костный мозг и различные органы, пролиферация и дифференцировка стволовых клеток костного мозга, пролиферация лимфоцитов в различных органах, каталитически активные антитела (ДНКазы, протеазы, амилазы), системная красная волчанка, рассеянный склероз

Код ГРНТИ76.03.55, 76.03.31

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Исключительно важным является исследование ряда социально значимых аутоиммунных и других заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы и развитием аутоиммунных патологий. Ранее нами были впервые детально исследованы антитела (АТ) из крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) с нуклеазными, протеолитическими и другими активностями (абзимы). Нами обнаружены и детально изучены антитела-протеазы гидролизующие основной белок миелина (ОБМ) при рассеянном склерозе (РС), системной красной волчанке (СКВ) и шизофрении, патогенез которых (напрямую или в той или иной степени) связан с демиелинизацией оболочек нейронов (для обзора см. главы монографий и обзоры журналах: Невинский и др. 2000- 2014, Nevinsky et al., 2000-2015). Кроме того показано, что АТ из крови и ликвора костного мозга больных РС эффективно гидролизуют ДНК, а клетки, синтезирующие анти-ДНК АТ обнаружены в бляшках мозга и костном мозге (Parkhomenko et al., 2014; Doronin et al., 2015). Участие абзимов в патогенезе ряда АИЗ следует из большого числа публикаций (обзоры: Nevinsky et al., 2000-2015). Однако до сих пор не известны факторы, стимулирующие “начало” и механизмы последующего развития АИЗ. Некоторые наблюдения позволили предположить, что АИЗ могут быть следствием дефектов гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) (Ikehara et al., 1990). Нами было впервые показано, что IgGs крови неаутоиммунных CBA и BALB мышей и 2-3 месячных аутоиммунных MRL-lpr/lpr мышей (условно здоровых мышей) являются каталитически неактивными (Andryushkova et al., 2006, 2007, 2009). Cпонтанноe развитие СКВ у MRL-lpr/lpr мышей приводило к появлению АТ, гидролизующих ДНК, АТР и полисахариды с низкой каталитической активностью (начальная стадия заболевания). Значительное повышение этих активностей было связано с переходом мышей из предболезни в глубокой патологии, что коррелировало с дополнительными изменениями в дифференцировке и пролиферации ГСК костного мозга мышей (erythroid burst-forming, erythroid burst-forming granulocytic-macrophagic, early erythroid burst-forming, and granulocytic-erythroid-megacaryocytic-macrophagic colony units) и возрастанием пролиферации лимфоцитов в разных органах. Максимальная активность абзимов была обнаружена у здоровых MRL-lpr/lpr мышей, иммунизированных ДНК. При этом не было обнаружено изменения профиля дифференцировки ГСК, но наблюдалось резкое возрастание пролиферации лимфоцитов в различных органах (селезенка, тимус, лимфоузлы и др.) и мощное подавление клеточного апоптоза. Это указывало в пользу того, что развитие СКВ в первую очередь связано с изменением профиля дифференцировки стволовых клеток костного мозга, а у здоровых мышей заметных изменений профиля не происходило (Andryushkova et al., 2006, 2007, 2009). При исследовании АТ из крови пациентов с различными АИЗ нами было показано, что статистически достоверное появление абзимов обнаруживается на самых ранних стадиях различных патологий, когда изменение титров антител к специфическим антигенам различных заболеваний, например ДНК (СКВ, РС, и др.), основному белку миелина (РС, СКВ), тиреоглобулину и другим белкам, еще соответствует диапазону изменения титров этих АТ у здоровых доноров (главы нескольких монографий и обзоры журналах: Nevinsky et al., 2000-2015). Анализ развития СКВ у MRL-lpr/lpr мышей показал, что появление абзимов является наиболее ранним и статистически значимым маркером появления и развития СКВ, а дальнейшее значительное увеличение их активности коррелирует с дополнительными изменениями профиля дифференцировки стволовых клеток костного мозга, что ведет к увеличению концентрации белка в моче, анти-ДНК антител в крови, появлением типичной розовой бабочки и облысению мышей (Andryushkova et al., 2006, 2007, 2009). Однако вопросы о возможности различий и подобия в механизмах возникновения и развития различных АИЗ требуют дальнейших более детальных исследований. Известно, что после заражения вирусами сначала происходит наработка АТ против компонентов некоторых вирусов, которые могут иметь структурное сходство с компонентами крови и клеток человека (Keinan, 2005). Затем, вследствие мимикрии некоторых белков вирусов и человека, может произойти сбой иммунной системы, ведущий к наработке АТ против собственных компонентов организма человека и, как следствие, развитию АИЗ. Известно, что кровь здоровых людей и животных содержит в хорошо тестируемых количествах ауто-АТ против ДНК, различных белков и ферментов, которые, однако, не обладают каталитическими активностями (см. обзоры). Согласно нашим предварительным данным начало развития АИЗ может быть связано не только с указанной выше мимикрией, но и гомологией между некоторыми белками непосредственно человека. Например, при апоптозе клеток в кровь попадают ядерные белки, некоторые последовательности которых имеют гомологию с другими белками человека. В целом, исследование механизмов “запуска” и развития АИЗ представляется исключительно важным для поиска методов ранней диагностики и новых лекарственных средств против АИЗ. Конкретной задачей настоящего проекта является детальное исследование механизмов “запуска” и развития АИЗ у людей и животных с использованием крови и ликвора здоровых доноров, больных АИЗ, а также мышиных моделей СКВ и РС. Планируется анализ механизмов демиелинизации головного и костного мозга с помощью различных подходов. Будут исследованы профили дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов разных органов в случае мышиных моделей РС и СКВ в условиях спонтанного развития этих патологий, а также их активации при иммунизации мышей основным белком миелина, олигодендроцитным гликопротеином ОБМ (МОГ; стимулирует развитие РС) и ДНК. Параллельно на разных стадиях развития указанных АИЗ будет проведен анализ относительных активностей абзимов в гидролизе ОБМ, МОГ, ядерных гистонов, ДНК, олигосахаридов, АТР и сравнение их свойств с таковыми у классических ДНКаз, протеаз, амилаз. Анализ протеолитической активности АТ против гистонов имеет особеое значение. Гистоны и их пост-трансляционные модификации играют ключевую роль в ремоделировании хроматина и транскрипции генов. Кроме внутриядерных функций, гистоны могут быть вредными, когда они попадают в межклеточное пространство (Chen et al., Cell Death Dis. 2014). Введение экзогенных гистонов животным приводит к системным воспалительным и токсическим реакциям через активацию Toll-подобных рецепторов. Лечение животных с помощью анти-гистоных препаратов (например, нейтрализующие антитела, активированный протеин С, рекомбинантный тромбомодулин, и гепарин) защищает мышей от летальной эндотоксемии, сепсиса, ишемии реперфузионного повреждения, травм, панкреатита, перитонита, инсульта, коагуляции и тромбоза. Кроме того, гистоны и нуклеосомы в повышенной концентрации в сыворотке влияют на некоторые патофизиологические процессы и прогрессирование заболеваний, включая аутоиммунные патологии, воспалительные процессы и раковые заболевания. Таким образом, внеклеточные гистоны могут служить в качестве биомаркеров и новых терапевтических мишеней в ряде заболеваний человека. Будет выявлен тип протеолитической активности абзимов-протеаз. Кроме того, будут идентифицированы и сравнены сайты гидролиза ОБМ и гистонов АТ против этих белков. Будет изучена цитотоксичность изучаемых препаратов АТ крови больных и мышей с АИЗ. Детальное изучение механизмов индукции АИЗ, свойств и биологической роли абзимов при АИЗ, является, несомненно, чрезвычайно актуальной проблемой фундаментальной и практической медицины. Это, с одной стороны, позволит выяснить механизм индукции наработки клеток продуцирующих абзимы в ликворе и органах млекопитающих, а также оценить роль различных абзимов в патогенезе АИЗ, что отражает научную значимость и новизну полученных результатов. С другой стороны, полученные результаты позволят оценить возможность получения препаратов нового поколения для подавления изменения профилей дифференцировки стволовых клеток костного мозга, ингибирования пролиферации специфических лимфоцитов органов, а также поиска путей возвращения профилей дифференцировки к норме, что важно для лечения больных АИЗ.

Ожидаемые результаты
Будут исследованы профили дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов в разных органов в случае мышиных моделей РС и СКВ в условиях спонтанного развития патологии, а также ее активации при иммунизации мышей различными антигенами. Параллельно на разных стадиях развития АИЗ будет проведен анализ веса мышей, протеинурии, относительных титров АТ против важных антигенов, активностей абзимов в гидролизе ОБМ, МОГ, ядерных гистонов, ДНК олигосахаридов, АТР и сравнение их свойств с таковыми в случае классических ферментов. В указанных выше экспериментах будут использованы модели: мышиная линия C57BL/6 – модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), модель человеческого РС; мышиная линия MRL-lpr/lpr – модель СКВ у людей: 1. Будет проведено детальное исследование (детали указаны выше) после иммунизации ЭАЭ C57BL/6 мышей основным белком миелина и олигодендроцитным гликопротеином ОБМ (МОГ) в сравнении с неаутоиммунной линией мышей CBA. 2. Будет проведено детальное исследование (детали указаны выше) после иммунизации ЭАЭ C57BL/6 мышей комплексом ДНК с метилированным бычьим сывороточным альбумином (м-БСА), моделирующим комплекс ДНК с гистонами в сравнении с MRL-lpr/lpr мышами и неаутоиммунной линией мышей CBA. Это необходимо для понимания различий в развитии АИЗ разного типа при иммунизации мышей антигеном, стимулирующим синтез анти-ДНК антител и абзимов. 3. Купризон-индуцированная демиелинизация является широко используемой экспериментальной моделью для изучения процессов де- и ремиелинизации центральной нервной системы. После обработки ЭАЭ и СКВ мышей купризоном будет проведено исследование демиелинизации мозга и сравнение профилей дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов, а также активности абзимов после обработки купризоном, при спонтанном развитии аутоиммунного энцефаломиелита, его стимуляции с помощью МОГ. Аналогичные исследования будут проведены в случае неаутоиммунной линии мышей CBA. 4. Как было указано выше, нами проведено исследование изменение профилей дифференцировки стволовых клеток костного мозга и пролиферации лимфоцитов в различных органах, а также активности абзимов после обработки мышей MRL-lpr/lpr (мышиная модель СКВ) с помощью комплекса ДНК с м-БСА. При этом изменение профиля дифференцировки коррелировало с наработкой абзимов, гидролизующих ДНК, АТР и полисахариды. MRL-lpr/lpr мыши будут иммунизированы с помощью МОГ и проведено полное сравнение изменения параметров указанных выше с таковыми для MRL-lpr/lpr мышей обработанных ДНК и ЭАЭ мышей иммунизированных с помощью ДНК и МОГ. Для сравнения аналогичные исследования будут проведены в случае неаутоиммунной линии мышей CBA. Эти данные позволят понять возможные различия или сходство в развитии АИЗ у мышей, предрасположенных к развитию различных АИЗ (СКВ и ЭАЭ) и не склонных к развитию АИЗ мышей, при их обработке одним и тем же антигеном – ДНК или МОГ. 5. Согласно нашим предварительным данным небольшая фракция АТ против ОБМ из крови больных РС и СКВ эффективно гидролизует не только ОБМ, но и гистоны ядер клеток человека и наоборот. Будет проведен детальный анализ расщепления абзимами из крови больных СКВ и РС против гистонов пяти гистонов (H1 +H2а+H2b+H3+H4), а также ОБМ. В литературе описана полиреактивность АТ в перекрестном связывании различных антигенов (см. обзоры). Будут определены и сравнены сайты расщепления абзимами против гистонов – ОБМ и, наоборот, с помощью MALDI TOF масс-спектрометрии для выявления природы пока еще пока неописанной в литературе возможности существования каталитической полиреактивности абзимов против разных белков. Такое исследование представляется важным для понимания возможной роли каталитической полиреактивности абзимов в развитии АИЗ. 6. Будут получены моноклональные АТ против ОБМ и против гистонов и проведен анализ их полиспецифичности в комплексообразовании, а также каталитической кросс-реактивности в гидролизе ОБМ и гистонов (и возможно других белков). 7. Согласно нашим предварительным данным моноклональные АТ, соответствующие крови больных СКВ, могут иметь в своем составе больше одного активного центра, например два или три, которые катализируют гидролиз ДНК и специфических белков в присутствии (металлопротеазы) или отсутствии (сериновые протеазы) ионов металлов. Будет проведен анализ ферментативных свойств гистон-гидролизующей активности препаратов IgG крови больных АИЗ и их сравнение со свойствами абзимов-протеаз при РС и СКВ, а также с каноническими протеазами. Будет проведен анализ наличия нескольких активных центров у моноклональных АТ с помощью различных физико-химических методов, установлены ДНК последовательности, кодирующие эти моноклональные АТ и белковые последовательности, гомологичные последовательностям классических протеаз, которые ответственны за разные ферментативные активности абзимов. 8. Нами показано, что удельные ферментативные активности АТ из ликвора больных РС в гидролизе ДНК, ОБМ и олигосахаридов примерно в 30-50 раз выше, чем из сыворотки крови этих больных (Parkhomenko et al., 2014; Doronin et al., 2015). В то же время АТ из сыворотки крови этих больных не гидролизуют АТР. Будет проведен поиск абзимов с другими возможными каталитическими активностями в ликворе и сыворотке крови этих больных. Высокие активности абзимов с ДНКазной, ОБМ-гидролизующей и амилазной активностями указывают в пользу того, что первичная дифференцировка и пролиферация стволовых клеток костного мозга, ведущие к наработке клеток, продуцирующих абзимы, происходит уже в ликворе больных РС (и возможно других АИЗ), а дополнительная додиференцировка - дополнительно в различных органах. Одной из задач этого исследования является установление типа клеток костного мозга, продуцирующих абзимы и анализ возможных путей подавления их пролиферации. 9. Нами показано, что на ранних стадиях АИЗ – в дебюте, репертуар абзимов обычно сравнительно узкий, но он сильно разрастается с прогрессированием заболевания, ведущим к генерации очень большого числа АТ с самыми разными каталитическими функциями и многообразием абзимов с одной и той же ферментативной функцией (см. обзоры). Двадцать два из 72 моноклональных АТ, соответствующих 72 индивидуальным колониям, выбранным случайным образом, эффективно гидролизовали ОБМ, демонстрируя различные оптимумы рН, зависимость от солей, сродство к субстрату и т. д. (Timofeeva et al., 2015). Четыре препарата имели активность протеаз серинового типа, три были тиоловыми протеазами, одиннадцать АТ - металлопротеиназами. Активность трех химерных моноклонов ингибировали PMSF и ЭДТА, два других ЭДТА и йодацетамид, а один - PMSF, ЭДТА, и йодацетамидом. 33 из 78 моноклональных АТ (42 %), не содержащие канонических ДНКаз, продемонстрировали самые разные ферментативные свойства в гидролизе ДНК (Botvinovskaya et al., 2013; Kostrikina et al. 2014). Учитывая это, представляется важным изучить различие и сходство в появлении ранних абзимов в дебюте спонтанного развития АИЗ у модельных ЭАЭ и СКВ мышей, а также после иммунизации их с помощью ДНК и МОГ. Затем необходимо сравнить титры АТ против ДНК и МОГ, а также активности абзимов, гидролизующих эти субстраты, на последующих стадиях развития АИЗ вплоть по глубокой патологии. Эти данные могут помочь понять особенности перехода от дебюта заболевания, когда у больных СКВ обнаруживаются только АТ с ДНКазной активностью, а у больных РС – только гидролизующие ОБМ, к последующим стадиям, когда кровь больных, как СКВ, так и РС содержит АТ, гидролизующие не только эти два субстрата, но большое число других белков, включая гистоны. 10. Тонкие механизмы узнавания антигенов, включая вклад специфических и неспецифических взаимодействий в узнавание антителами ДНК и белков пока не известны. С помощью разработанного нами метода последовательного усложнения структуры лиганда будет проведен детальный анализ механизмов узнавания АТ против ДНК и ОБМ (из сыворотки больных РС) как ДНК, так и ОБМ молекул. 11. С нашей точки зрения, обобщение совокупности полученных данных может помочь понять особенности и возможное различие в развитии не только СКВ и РС, но и выявить общие закономерности появления и углубления сбоев иммунной системы при различных АИЗ. Кроме того, будут получены данные о структуре различных вредных для человека абзимов, необходимые для конструирования их специфических ингибиторов. 12. Мы уже начали такую работу в сотрудничестве с группой А. Х. Веньяминовой (ИХБФМ) по поиску специфических ингибиторов абзимов, гидролизующих ОБМ. Впервые был найден 2'-фтор-содержащий РНК-аптамер с высоким сродством и специфичностью к анти-ОБМ антителам (Vorobjeva et al., Anal Chem. 2014). Был получен ковалентный конъюгат аптамера с Cа2+-регулируемым флуоресцирующим белком, который был использован для биолюминесцентного анализа АТ против ОБМ. Разработанная модель твердофазной микроанализа является простым, быстрым и высокочувствительным методом обнаружения специфических АТ против ОБМ, образующихся в крови больных РС. Возможно, что такого рода аптамеры можно в будущем будет использовать для ингибирования протеолитической активности анти-ОБМ антител. Научная значимость результатов работы состоит в абсолютно новом направлении исследования механизмов возникновения и развития АИЗ, основанном на анализе изменения профилей дифференцировки и пролиферации стволовых клеток костного мозга с использованием моделей аутоиммунных мышей, соответствующих РС и СКВ человека. Параллельно будет проанализировано, какие клетки ликвора костного мозга и различных органов синтезируют вредные для организма абзимы, стимулирующие развитие аутоиммунных процессов и АИЗ. Параллельно будет установлено, какие абзимы и с какими активностями есть в ликворе костного мозга и сыворотке крови больных РС, СКВ и СПИД, в чем их возможное сходство и различие и какая их биологическая роль в индукции, развитии и осложнениях анализируемых патологий. Будет сформулирована концепция роли дифференцировки стволовых клеток костного мозга и каталитических антител в патогенезе этих АИЗ. Исходя из выше изложенного, можно заключить, что аналогов нашей работы в литературе пока нет – данный проект соответствует мировому уровню исследований и носит пионерский характер. Общественная значимость работы заключается в том, что по результатам исследования будут получены данные о механизмах развития АИЗ, что исключительно важно для поиска новых лекарственных средств, подавляющих изменение профиля дифференцировки стволовых клеток костного мозга людей и возвращения его к норме. Эти данные будут основаны на проведенной оценке клинико-диагностической значимости относительной активности АТ для развития аутоиммунных реакций у людей и у модельных линий мышей. Кроме того, полученные результаты позволят создать базу для новых подходов к диагностике АИЗ на ранних стадиях их появления и научно-обоснованного поиска биопрепаратов и терапевтических средств, а также методов контроля развития болезни в каждом отдельном случае, что делает возможным их использование в практическом здравоохранении. Нами обнаружены отдельные случаи исчезновения аутоиммунных процессов у некоторых пациентов с АИЗ. Учитывая это, мы планируем в будущем провести анализ какие компоненты их крови ответственны за возвращение профиля дифференцировки стволовых клеток к норме.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---