Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Сформирована контрольная группа из 60 индивидов, не имеющих признаков органического заболевания сердца. Соотношение по полу М:Ж = 28:32. Средний возраст составил 59.2 лет. У лиц из контрольной группы собраны формы информированного согласия на участие в исследовании. Проведен анализ литературных данных об известных генетических причинах дилатационной кардиомиопатии. Были отобраны кандидатные гены, которые были сгруппированы в 4 таргетные панели для одновременного поиска мутаций методом полупроводникового капиллярного секвенирования на приборе IonTorrent PGM (Personal Genome Machine). В панель #1 «Саркомерные гены, ответственные за ДКМП», вошли 10 генов: MYBPC3, TAZ, TPM1, LDB3, MYL2, ACTC1, MYL3, MYH7, TNNI3, TNNT2. Суммарный размер анализируемых фрагментов составил 28770 bp (28.77 Kb). Суммарная длина непокрытых фрагментов, требующих дополнительного капиллярного секвенирования по Сэнгеру составила 1310 bp. В панель #2 «Десмосомные гены, ответственные за ДКМП», вошли 16 генов: LMNA, CTNNA3, LDB3, CRYAB, PKP2, TGFB3, JUP, DSG2, DSC2, DES, TMEM43, SCN5A, DSP, PLN, FLNC, EMD. Суммарный размер анализируемых фрагментов составил 94010 bp (94.01 Kb). Суммарная длина непокрытых фрагментов, требующих дополнительного капиллярного секвенирования по Сэнгеру составила 1739 bp. Панель #3 “Титин” представлена самым большим геном человека, TTN, содержащим 363 экзона. Суммарный размер анализируемых фрагментов составил 104040 bp (104.04 Kb). Суммарная длина непокрытых фрагментов, требующих дополнительного капиллярного секвенирования по Сэнгеру составила 1402 bp. В панель #4 «Гены, ответственные за другие формы синдрома ДКМП», вошли 54 гена: NEXN, PSEN2, NOTCH2, ACTN2, VCL, MYPN, NEBL, BAG3, RBM20, ANKRD1, CSRP3, ILK, TMPO, ABCC9, SGCG, MYH6, PSEN1, SMAD6, FOXC2, TCAP, SGCA, DTNA, MIB1, GATA6, FHOD3, CALR3, MYLK2, JPH2, GATA5, SNTA1, TNNC1, CAV3, DLG1, MYOZ2, PDLIM3, SGCB, NKX2-5, SGCD, SDHA, LAMA4, FOXC1, PRKAG2, HSPB1, SGCE, GATAD1, GATA4, MURC, NOTCH1, FKTN, LAMP2, FLNA, DMD, FHL1, EYA4. Суммарный размер анализируемых фрагментов составил 257360 bp (257.36 Kb). Суммарная длина непокрытых фрагментов, требующих дополнительного капиллярного секвенирования по Сэнгеру составила 6067 bp. Таким образом, в состав 4 панелей для поиска мутаций в генах, ответственных за ДКМП, вошёл 81 ген. Дизайн олигонуклеотидов Ampliseq был выполнен при помощи программы AmpliSeq Designer. Был также выполнен дизайн праймеров для капиллярного секвенирования по Сэнгеру фрагментов генов, непокрытых праймерами панелей AmpliSeq. Диагностическая надёжность панелей #1, #2 , #4 была валидирована на образцах ДНК больных с другими вариантами первичных кардиомиопатий и нарушениями сердечного ритма, у которых ранее методом прямого секвенирования по Сэнгеру были выявлены мутации в генах, входящие в состав панелей. Все генетические варианты, выявленные ранее у 10 больных методом прямого секвенирования по Сэнгеру в покрытой олигопраймерами области Ampliseq, были подтверждены методом полупроводникового секвенирования. Таким образом, была показана высокая диагностическая надёжность полученных панелей. Так как ранее мутаций в гене TTN в лаборатории выявлено не было, диагностическая надёжность панели #3 не проверялась из-за отсутствия положительного контроля Сформирована группа больных ДКМП из 45 пациентов (15 пациентов в возрасте до 18 лет; 30 пациентов в возрасте старше 18 лет). Также в группу пациентов вошли 4 больных с редкими вариантами кардиомиопатий с высоким риском прогрессирования заболевания и исхода в ДКМП. Собраны клинические данные этих пациентов, всем больным проведено клиническое обследование и лечение, медико-генетическое консультирование. В старшей возрастной группе 6 пациентам с диагнозом ДКМП в 2016 году в отделении хирургического лечения дисфункции миокарда была выполнена операция обратного ремоделирования. Пациенты с ДКМП, которым операция обратного ремоделирования была выполнена ранее, были приглашены для динамического наблюдения и планово обследованы. В группу больных в возрасте до 18 лет включительно были отобраны 15 пациентов, у которых выявлялось расширение камер сердца. Соотношение по полу М:Ж составило 2:1. Возраст самого юного пациента на момент первой консультации врача-генетика и забора крови для исследования составил 25 дней, самого старшего – 17 лет. Средний возраст составил 77 месяцев (6 лет 4 месяца). В группу больных старше 18 лет вошли 30 пациентов с синдромом ДКМП. Соотношение по полу М:Ж составило 17:13. Возраст самого юного пациента на момент первой консультации врача-генетика и забора крови для исследования составил 27 лет, самого старшего – 65 лет. Средний возраст составил 42 года. Создан пополняемый Биобанк, содержащий образцы замороженной венозной крови и ДНК, а также фрагментов тканей сердца, биоптатов, полученных интра-операционно (в том случае, если пациентам выполнялось хирургическое вмешательство). В тех случаях, когда была возможность доставить в лабораторию свежую кровь (не позднее 2 часов от забора крови), были выделены также образцы РНК и получены библиотеки кДНК. У всех совершеннолетних пациентов собраны подписанные формы информированного согласия на участие в исследовании. Информированное согласие на исследование для детей в возрасте до 18 лет было подписано родителями или законными представителями (опекунами). На основании разработанной карты фенотипа создана постоянно пополняемая база данных клинических данных. Одному ребенку с сочетанием ДКМП и проявлений нервно-мышечного заболевания была взята биопсия скелетной мышцы для выделения РНК и выполнения функционального анализа выявленной мутации на уровне РНК. Для одного пациента с семейной формой ДКМП и вариабельной миопатией с неописанной заменой c.513+45T>G в гене LMNA был проведен анализ влияния выявленной замены на сплайсинг. Этот вариант не был найден в здоровой популяции и биоинформатические ресурсы предсказывали появление нового донорного сайта сплайсинга. Анализ кДНК пациента выявил инсерцию 45 нуклеотидов без сдвига рамки считывания. Предсказан структурный и возможный функциональный эффект. По материалам исследования подготовлена и опубликована статья в журнале GENE (Rogozhina Y., Mironovich S., Shestak A., Adyan T., Polyakov A., Podolyak D. , Bakulina A., Dzemeshkevich S., Zaklyazminskaya E. “New intronic splicing mutation in the LMNA gene causing progressive cardiac conduction defects and variable myopathy”) Была разработана подробная карта фенотипа для систематизации клинических данных пациентов с ДКМП . Было проведено пилотное секвенирование исследовательских панелей генов на группе из 10 здоровых лиц. Начато формирование базы данных частых генетических вариантов, не имеющих явного клинического значения, а также генетических вариантов с неизвестным клиническим значением и патогенных мутаций. Было проведено пилотное диагностическое секвенирование разработанных панелей генов у пациентов с ДКМП. По результатам работы были подготовлены к печати 6 статей, 5 из них были опубликованы в изданиях, зарегистрированных в SCOPUS. Одна публикация (аналитический обзор) была принята к печати в Российском Кардиологическом Журнале в №2 2017.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Выборка больных в количестве 70 пробандов (23 ребенка, 47 взрослых) с диагнозом ДКМП сформирована полностью. 2. Создан биобанк образцов образцов крови, тканей, ДНК и РНК больных с первичными формами ДКМП, а также создана обновляемая база данных клинического материала. 3. Разработана система диагностики кардиотропных вирусов CMV, HHV6, EBV, parvo-B19. Выполнено 10 тестовых исследований на образцах миокарда, полученных интра-операционно. Данных в пользу вирусной природы заболевания в исследованных образцах не получено. 4. Список выявленных частых генетических вариантов, не имеющих явного клинического значения, представлен в Приложении. 5. Диагностическое секвенирование все выбранных 81 генов выполнено 30 пробандам. Среди них все 23 пробанда детской выборки, 7 пробандов взрослой выборки. Для остальных взрослых пациентов секвенирование выполнено частично. 6. В группе пробандов с ДКМП до 18 лет полностью проанализированы были результаты секвенирования гена TTN и 10 генов, кодирующих саркомерные белки миокарда. Результаты секвенирвоания остальных генов проанализированы частично. Всего на конец 2017 года по результатам анализа патогенные варианты были выявлены у 8 человек (35% пробандов): у 2 пробандов мутации были выявлены в гене LMNA, у одного пробанда – в гене DES, у одного пробанда – в гене TPM1, у одного пробанда – в гене TNNT2, у троих пробандов – в гене MYH7. В 5 семьях проведено медико-генетическое консультирование и каскадный семейный скрининг, от 3 семей на момент написания отчета нет обратной связи. В четырех семьях наблюдались повторные рождения детей с ДКМП первые 2 года жизни. В трёх семьях по одной доминантной мутации в генах TPM1, TNNT2, TTN, соответственно, были унаследованы от одного из родителей со взрослой формой заболевания. Во всех трех семейных случаях был выявлен выраженный клинический полиморфизм и несоответствие тяжести клинических проявлений у носителей единственной мутации. У пробандов и их сибсов клиническая картина заболевания была значимо тяжелее, чем у одного из родителей – носителей мутации. Была выдвинута гипотеза о наличии дополнительного модифицирующего генетического фактора со стороны второго клинически здорового родителя. Выполнено секвенирование полного экзома всем членам ядерных семей, проводится анализ результатов. Результаты секвенирования в группе взрослых больных с ДКМП на момент отчета находятся в начальной стадии анализа. Выявлены 12 потенциально повреждающих генетических вариантов (представлены в таблице Приложений), которые требуют подтверждающего контрольного секвенирования. Во всех случаях у каждого из взрослых пробандов были выявлены только по одной мутации в гетерозиготном состоянии. 7. У пробанда 3 лет с ДКМП и выраженной слабостью мышц шеи была обнаружена новая замена c.5655+5G>C/N в гене MYH7. Этот вариант не был описан в доступных базах данных и биоинформатические ресурсы предсказывали исчезновение канонического донорного сайта сплайсинга. После тестирования родителей пробанда установлено возникновение замены de novo. Для варианта c.5655+5G>C/N в гене MYH7 был проведен экспрессионный анализ на биопсийном материале мышцы пробанда. Анализ кДНК пациента выявил делецию 38 экзона без сдвига рамки считывания. В литературе было описано еще 2 замены в гене MYH7, приводящие к аналогичному изменению в кДНК (c.5655G>A и c.5655+1G>A). Для исследования этих замен были созданы экспрессионные системы с клеточной линией HEK293N, трансфицированной 4 плазмидами с фрагментами гена MYH7 от 37 до 39 экзона. Со всех трех мутантных плазмид экспрессировался только транскрипт без 38 экзона, с нормальной плазмиды получался полноценный траскрипт. Так же было выявлено небольшое, но убедительное различие в уровне экспрессии мутантного траскрипта между конструкциями с c.5655G>A и с c.5655+5G>C. Результаты этой работы были представлены на конференциях Heart Failure 2017 и European Human Genetics Conference 2017. По материалам исследования подготовлена к публикации статья на английском языке и будет направлена в редакцию до конца календарного года. 8. В рамках работы по гранту начата клиническая апробация органосохраняющей методики обратного ремоделирования сердца. Один из ключевых этапов этой оригинальной методики заключается в выполнении хордосохраняющего протезирования митрального клапана с полноценным сохранением функции левого желудочка. Ранние и среднеотдаленные результаты этого клинического этапа нашей работы сопоставимы с результатами ортотопической трансплантации сердца. Следует особо отметить, что в процессе анализа выявлен ранее не описанный факт соединительнотканный дисплазии всех двухстворчатых атриовентрикулярных клапанов, удаленных на операции. Такое сочетание двух генетически детерминированных заболеваний (кардиомиопатии и дисплазии атриовентрикулярных клапанов) не отмечен в доступной литературе, представляется нам очень важным и будет подвергнут тщательному анализу в нашей дальнейшей работе по настоящему Проекту. 9. По результатам работы были подготовлены к печати 4 статьи. Три из них опубликованы в изданиях, зарегистрированных в SCOPUS и РИНЦ. Одна публикация (исследовательская статья) была принята к печати в журнал «Клиническая и экспериментальная хирургия» в №1, 2018. Результаты работы по гранту были представлены в докладах на российских конференциях: устных докладов – 6. Результаты работы по гранту были представлены в докладах на международных конференциях: постерных докладов - 9, устных докладов – 5.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году был существенно расширен Биобанк данных больных с дилатационной кардиомиопатией. География обращаемости пациентов была чрезвычайно широкой – от Калининграда до Оренбурга. Были добавлены клинические, генеалогические данные и биологический материал как от взрослых больных с ДКМП, так и от семей, где диагноз поставлен детям, а также от родителей, потерявших детей с этим заболеванием, и предоставивших выписки и биологический материал умерших детей. Всего за 2018 год были добавлены в Биобанк биологические и клинические материалы 20 новых семей (пробандов и их родственников). Было проведено первичное медико-генетическое консультирование этих 20 семей, впервые обратившихся за включением в исследование. Была проведена расширенная NGS диагностика, которая включала поиск мутаций в последовательных, разработанных для этого проекта панелях, а также досеквенирование по Сенгеру фрагментов, стабильно не покрывающихся панелями на основе праймеров Ampliseq. Все выявленные генетические варианты били подвергнуты тщательному биоинформатическому анализу. Составлены таблицы патогенных генетических вариантов, вероятно патогенных генетических вариантов и вариантов с неясным клиническим значением. Эти варианты сгруппированы в таблицы и представлены в Приложении к настоящему отчёту. Отдельно представлены списки выявленных популяционных полиморфизимов. В трех семьях, где выявленные по результатам биоинформатического анализа генетические варианты потенциально затрагивали сайты сплайсинга, были забраны образцы кожи и/или мышечной ткани для выделения тотальной мРНК и последующей обратной транскрипции. Биобанк был также пополнен за счет образцов крови 27 родственников пробандов 1 и 2 степени родства, обратившихся за каскадным семейным скринингом. Все обратившиеся лица также предоставили клинические и инструментальные результаты исследования. Незадолго до начала исследования были выполнены первые операции по обратному ремоделированию сердца, затем в рамках выполнения проекта внедрение этой хирургической методики было продолжено. В целом, эта операция была выполнена 40 пациентам, все эти пациенты вошли в исследование. Были сформулированы показания к операции обратного ремоделирования: наличие диагноза ДКМП неишемической природы, ФВ ЛЖ менее 40%, наличие гемодинамически значимой митральной регургитации, расширение объёма левого предсердия, отсутствие миокардита, критической дисфункции со стороны других жизненно важных органов (печени, почек, головного мозга). Были также оценены среднесрочные и отдаленные результаты этой принципиально новой хирургической методики лечения ДКМП. За 2018 год всем 40 оперированным пациентам были направлены письма и приглашения на этапную консультацию и плановое обследование. Согласно полученной информации, 7 пациентов умерли в связи с прогрессированием сердечной недостаточности, (43%) семей выбыли из исследования (не отвечают на телефонные звонки и письма, телефонный номер изменен или не обслуживается, не приезжают на этапные консультации). От большинства пациентов удалось получить обратную связь. Исследование центральной геодинамики в отдаленном периоде после операции обратного ремоделирования показало отчетливую нормализацию основных показателей: уменьшение размеров левого желудочка и предсердий, увеличение фракции выброса и прогрессирующее снижение давления в легочной артерии. Это отразилось и на состоянии периферического кровообращения, о чем свидетельствует практически нормализация уровня мозгового натрийуретического гормона, как показателя выраженности сердечной недостаточности. Основные причины летальности: прогрессирование хронической сердечной недостаточности, аритмогенная внезапная смерть, тромбозы. Анализ причин летальности в отдаленном периоде после операции позволяет предположить, что результаты выживаемости могут быть еще существенно улучшены. Двоим пациентам, которым была ранее выполнена ортотопическая трансплантация сердца, находящимся в программе динамического наблюдения, была дважды выполнена биопсия миокарда. В биоптатах миокарда была выполнена ДНК-диагностика кардиотропных вирусов. Все тесты на вирусы были отрицательными. В результате проведенного исследования было идентифицировано большое количество генетических вариантов. Повторное медико-генетическое консультирование по результатам ДНК-диагностики и каскадный семейный скрининг были проведены в 15 семьях с установленной генетической причиной заболевания в группе I, в группе II проведено 27 повторных консультаций по поводу результатов ДНК-диагностики, результатов семейного обследования. Всего было проведено 42 повторные консультации. В семейных случаях был оценен внутрисемейный клинический полиморфизм проявлений заболевания. Как правило, клинические проявления заболевания при доминантных семейных формах заболевания развивались у родственников в сходном возрасте +/- 5 лет, Были выявлены 5 семей, в которых пробанды имели исключительно тяжёлую раннюю манифестацию ДКМП и фульминантное течение заболевания, а у родителей наблюдались либо умеренно прогрессирующая ДКМП с поздней манифестацией, либо изолированный синдром некомпактного миокарда левого желудочка. В 3 из 5 семей при полноэкзомном секвенировании было установлено, что каждый из родителей является носителем потенциально-патогенных или известных патогенных вариантов, приводящих к кардиомиопатии, а дети унаследовали оба генетических варианта. В одной семье у пробанда в дополнение к материнской делеции со сдвигом рамки считывания в гене DES была выявлена полная делеция отцовского аллеля, возникшая de novo. Проведен анализ клинических проявлений заболевания у больных как с выявленными мутациями, так и с отрицательными результатами генетического тестирования. В результате установлено, что наиболее часто мутации выявлялись в генах MYH7, MYBPC3, TPM1, DES, LMNA. Довольно неожиданным результатом оказался тот факт, что детской выборке больных с ДКМП был выявлен только один вероятно патогенный вариант (нонсенс-мутация) в гене TTN, который позиционируется наиболее частой причиной дилатационной кардиомиопатии. По-видимому, TTN-зависимые формы ДКМП манифестируют позднее, в молодом (но старше 18 лет) или более зрелом возрасте. Результаты этого исследования не позволяют рассматривать ген TTN как первую линию ДНК-диагностики ДКМП в педиатрической группе, несмотря на публикации о высокой частоте мутаций в этом гене при ДКМП в целом. В трех семьях (8% семей) были выявлены вероятно патогенные варианты в генах, не включенных в 4 исследуемые панели (PPP1R13L, CTNNA3, PRDM16), которые были идентифицированы с использованием полноэкзомного секвенирования. Объем панелей и большое количество фрагментов для досеквенирования делают экономически нецелесообразным поиск мутаций в последовательных панелях. Учитывая тот факт, что ежегодно описывают 1-2 новых гена, ответственных за первичные кардиомиопатии, представляется оптимальным выполнять двухэтапный поиск мутаций при изолированной ДКМП: 1 этапом – поиск мутаций в генах MYH7, MyBPC3, TPM1, LMNA, EDM, DES. При отсутствии диагностически диагностически значимых находок, объясняющих клиническую картину заболевания, 2 этап - полноэкзомное секвенирование. При синдромальных формах ДКМП и ДКМП в рамках нервно-мышечного заболевания целесообразно выполнять полноэкзомное секвенирование. По результатам работы была опубликована в 2018 г. 1 статья в журнале «Клиническая и экспериментальная хирургия» - издании, зарегистрированном в SCOPUS и РИНЦ. Четыре публикации были приняты к печати в журналы «Клиническая и экспериментальная хирургия» и Gene в 2019 г. В 2019 г. издательской группой «ГЭОТАР-Медиа» планируется издание монографии «Болезни миокарда и перикарда: от синдромов к диагнозу и лечению». Результаты работы по гранту были представлены в докладах на всероссийских конференциях в 2018 г.: постерных докладов – 0, устных докладов – 2, приглашенных докладов – 5. Результаты работы по гранту были представлены в докладах на международных конференциях в 2018 г.: постерных докладов - 7, устных докладов – 4, приглашенных докладов – 6.