КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-14-01304

НазваниеРазработка новых модульных нанотранспортеров, несущих биологически активные макромолекулы, как инструментов избирательного воздействия на заданные функции живых клеток.

РуководительСоболев Александр Сергеевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2017 г. - 2019 г.

, продлен на 2020 - 2021. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№18 - Конкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словамодульные нанотранспортеры, адресная доставка лекарств, внутриклеточный транспорт, внутриклеточная регуляция, транскрипционные факторы, Nrf2, проникающие в клетку антитела к внутриклеточным антигенам, с-Мус, рецепторы, эндоцитоз, цитоплазмено-ядерный транспорт.

Код ГРНТИ34.15.00

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на создание и исследование свойств и потенциала нового класса модульных нанотранспортеров (МНТ) для целей направленной доставки регуляторных макромолекул – фрагментов факторов транскрипции и антител к внутриядерным антигенам – в ядра клеток-мишеней. Превалирующей к настоящему времени практикой регулирования внутриклеточных процессов макромолекулами является так называемый непрямой способ, а именно, посредством экспрессии соответствующих белков, кодируемых доставленной в клетки экзогенной ДНК. Недостатками метода трансфекции являются аспекты, связанные с возможной геномной интеграцией, что затрудняет переход к дальнейшему практическому применению подхода для терапии при помощи вирусных систем доставки, и недостаточная эффективность, а порой и токсичность невирусных систем доставки. Реализация подхода прямого регулирования внутриклеточных процессов путем непосредственной доставки в клетки рекомбинантных транскрипционных факторов (ТФ) или антител к внутриклеточным мишеням упирается в ограничения, связанные с транспортом макромолекул через биологические мембраны. Для преодоления этого разрабатываются различные конструкции с использованием пептидов, проникающих в клетки (cell-penetrating peptides, CPP). CPP, однако, неспецифичны по отношению к типу клетки, что делает проблематичным широкое использование такого подхода для терапии. Системы с неспецифической доставкой для достижения эффекта приводят к тому, что такой конструкцией насыщаются все подвергнутые воздействию клетки, как целевые, так и нецелевые, при этом неспецифическая доставка может приводить к нежелательным/побочным эффектам в тех клетках, где изменение регуляции не требуется или же она противопоказана. Основным препятствием для развития направления внутриклеточной доставки рекомбинантных белков, как подчеркивается во многих работах, является отсутствие эффективной системы доставки, способной распознавать клетки-мишени и выходить из эндосом, если проникновение внутрь клетки осуществлялась путем эндоцитоза, что определяет очевидную актуальность создания систем направленного транспорта регуляторных макромолекул в заданный компартмент клетки-мишени. Для решения задачи адресной доставки внутриклеточных регуляторов в клетки-мишени мы предлагаем использовать разработанные нами ранее модульные нанотранспортеры (МНТ) – рекомбинантные белки, способные эффективно распознавать клетки-мишени и проникать в их заданный компартмент (в данном случае, ядро для доставки фрагментов транскрипционных факторов и антитела к внутриядерным антигенам). Мы планируем изучить возможность включения в состав МНТ фрагментов (scFv) антитела к с-Myc, а также фрагментов ТФ Nrf2 и взаимодействующего с ним белка p21. Планируется получить несколько вариантов конструкций такого рода, провести исследование возможности их получения в достаточных количествах, разработать метод их очистки, провести исследование внутриклеточного транспорта, исследовать возникающие эффекты на культурах различных клеток. На настоящий момент подходы для направленного транспорта таких регуляторов в заданный компартмент заданного типа клеток еще не созданы. МНТ представляют собой оригинальную разработку коллектива заявителей, поэтому новизна создания нового класса специфичных по отношению к типу клетки внутриклеточных регуляторов представляется очевидной. Исследование возможности создания средств непосредственного влияния на взаимодействие регуляторных макромолекул и выявление границ применения этих средств расширяет арсенал методов при исследовании регуляторных процессов в клетке (в том числе непосредственно в составе живого организма). Кроме того, разработка такого подхода создает задел для таргетного воздействия на патогенез различных заболеваний, например, доставка ТФ-регулятора клеточного ответа на окислительный стресс при воспалительных процессах.

Ожидаемые результаты
В рамках данного проекта планируется разработка эффективных методов доставки в клетки-мишени рекомбинантных биологически активных макромолекул таких, как ТФ, регуляторные белки и антитела к внутриклеточным антигенам. Согласно проведенному анализу литературы, в большинстве подходов используется доставка в клетки посредством cell-penetrating peptides (CPP), характеризующаяся отсутствием специфичности и малоэффективным выходом из эндосом у тех вариантов CPP, которые проникают в клетку путем эндоцитоза. Необходимость преодоления ограничений имеющихся подходов доставки рекомбинантных белков в клетки указана во многих работах (Marschall et al., 2011; Marschall et al., 25014; Verdurmen et al., 2015; Zahid et al., 2015; Guillard et al, 2015; Liu et al., 2016; Kim et al., 2016; Miersch, Sidhu, 2016). Для решения этой задачи мы планируем модифицировать технологию МНТ – разработанный и успешно апробированный нами подход направленной доставки переносимого вещества в ядра клеток-мишеней (Rosenkranz et al., 2003; Gilyazova et al., 2006; Sobolev, 2008; Slastnikova et al., 2012a; Koumarianou et al., 2014; Slastnikova et al., 2016), в том числе и при системном введении (Slastnikova et al., 2012b). В качестве первых перспективных для последующих работ и возможного практического применения доставляемых внутриклеточных регуляторов мы предполагаем использовать фрагменты ТФ Nrf2, взаимодействующего с ним регуляторного белка р21 и антитела к внутриядерному онкогену и ТФ с-Myc. Транскрипционный фактор Nrf2 является мастер-регулятором, контролирующим экспрессию более чем 100 генов, участвующих в детоксикации и ответе клетки на окислительный стресс (Al-Sawaf et al., 2016; Lu et al., 2016). Мы планируем создать МНТ с фрагментами Nrf2 и активирующего Nrf2 белка p21. Оценка результативности доставки этих макромолекул будет осуществлена на клетках, имеющих рецепторы к любому из лигандных модулей уже имеющихся вариантов МНТ по активации Nrf2/ARE-сигнального пути, по экспрессии генов, кодирующих антиоксидантные ферменты, находящиеся под контролем Nrf-2 и по защите клеток от окислительного стресса. Протоонкоген и ТФ c-Myc является важным компонентом сигнальных каскадов, контролирующих деление, метаболизм, дифференцировку клеток и рассматривается как ключевой элемент поддержания процессов выживания и пролиферации неопластической клетки, и подавление активности с-Myc важно при терапии различных новообразований (Dang et al., 2012; Chen et al., 2014; Fletcher, Prochownik, 2015). Мы планируем создать МНТ с фрагментом (ScFv) антитела к c-Myc. Оценку способности ScFv в составе МНТ взаимодействовать со своим антигеном с-Myc будет проведена с использованием технологии безызлучательного переноса энергии по Ферстеру (FRET) (Ulasov et al., 2011; Durymanov et al., 2015) или термофореза (Seidel et al., 2013; Храмцов и соавт., 2016). Антипролиферативная активность ScFv к c-Myc в составе МНТ-ЭФР будет изучена на клетках, экспрессирующих и рецепторы ЭФР (Rusnak et al., 2007), и c-Myc, например, клеточная линия HCT116 (Avignolo et al., 2008). Cоздание системы доставки макромолекул, способных пройти внутрь клетки и повлиять на дефектное взаимодействие (или на недостаток нормального взаимодействия) между регуляторными макромолекулами представляет собой главную задачу с прикладной точки зрения – для целей таргетного лечения широкого круга заболеваний. Среди практических следствий осуществления такого подхода – возможность эффективно влиять на различные заболевания, вызванные нарушением регуляции в заданном типе клеток, например доставка опухолевых супрессоров в клетки с соответствующим инактивированным геном или транскрипционного фактора-регулятора клеточного ответа на окислительный стресс при целом ряде заболеваний, включая воспалительные, нейродегенеративные и др.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В настоящей работе нами была поставлена задача по разработке подхода направленной доставки в заданный тип клеток белков-регуляторов внутриклеточных процессов, таких как антитела, транскрипционные факторы и их фрагменты. В целом в настоящее время это задача реализуется на уровне трансфекции клеток геном соответствующего регуляторного белка. Методы трансфекции во многих случаях прекрасно работают in vitro, однако считаются достаточно опасными для потенциального терапевтического применения. Доставка в клетки требуемого белка лишена недостатков трансфекции и кроме того открывает возможности более точного модулирования по времени количества белка доставленного в клетки, что затруднительно при трансфекции. Проведенный нами подробный анализ литературы (Ulasov et al., 2018) показал, что большая часть работ, посвященных доставке в клетки транскрипционных факторов, использует неспецифические систему трансдукции, типа ТАТ-пептидов, что приводит к попаданию доставляемого белка в нецелевые клетки (off-target effects) и уменьшению количеств белка, достигающих клетки-мишени. Ранее нами была разработана система доставки низкомолекулярных биологически активных молекул, таких как фотосенсибилизаторы и радионуклиды с короткой длиной пробега испускаемых частиц с помощью модульных нанотранспортеров, продемонстрировавших свою эффективность in vitro (Gilyazova et al., 2006; Rosenkranz et al., 2008; Sobolev, 2008), так и in vivo (Slastnikova et al., 2012; Slastnikova et al., 2017). Целью настоящей работы является адаптация технологии МНТ для доставки более крупных молекул: фрагментов антител и транскрипционных факторов. Для этой цели мы выбрали транскрипционный фактор Nrf2, считающийся мастер-регулятором клеточного ответа на окислительный стресс (Copple et al., 2017), и фрагменты антител на онкоген с-Мус, регуляция которого низкомолекулярными ингибиторами затруднительна из-за отсутствия карманов, в которые они могли встроиться (Dang et al., 2017). Активация Nrf2-системы считается одной из возможных стратегий по борьбе с клеточным окислительным стрессом, лежащим в основе патогенеза многих распространенных болезней (Barnham et al., 2004; Lu et al., 2016). Для этого нами был использован подход по высвобождению эндогенного Nrf2 из комплекса со своим ингибитором Кеар1 путем доставки в клетки небольших фрагментов Nrf2 (Nrf2p), конкурирующих за связывание с Кеар1. Проведенные предварительно эксперименты показали принципиальную возможность активации Nrf2-системы конструкциями МНТ-Nrf2p. На данном этапе на модельной системе мы показали достоверную защиту клеток от индуцированного окислительного стресса трансфекцией конструкциями, экспрессирующими TurboYfp-МНТ-Nrf2p по сравнению с трансфекцией TurboYfp-МНТ. Конструкции МНТ-Nrf2p, продемонстрировавшие наилучший эффект как по активации Nrf2-системы, так и по защите клеток от окислительного стресса были переклонированы в вектор для бактериальной экспрессии. Поскольку Nrf2p находится на С-конце МНТ, нам пришлось перенести лиганд к рецепторам на поверхности клеток-мишеней на N-конец. Мы использовали эпидермальный фактор роста в качестве лиганда к EGFR и, в качестве альтернативного лиганда к EGFR — анти-EGFR антитело-подобный белок, аффибоди (Afb-EGFR). Таким образом, нами было получено и выделено 4 варианта МНТ-Nrf2p, отличающиеся по лиганду к EGFR и по наличию NLS: EGF-DTox-HMP-Nrf2p, EGF-DTox-HMP-NLS-Nrf2p, [Afb-EGFR]-DTox-HMP-Nrf2p, [Afb-EGFR]-DTox-HMP-NLS-Nrf2p. Поскольку EGF содержит дисульфидные связи, то EGF-содержащие белки были дополнительно рефолдированы. Всего было выделено и очищено 9,5 мг [Afb-EGFR]-DTox-HMP-NLS-Nrf2p, 12 мг [Afb-EGFR]-DTox-HMP-Nrf2p, 4 мг рефолдированного EGF-DTox-HMP-NLS-Nrf2p и 4,5 мг рефолдированного EGF-DTox-HMP-Nrf2p, что было достаточно для запланированной на 2017 год работы по проекту. Следующим этапом нашей работы являлось комплексное исследование свойств полученных новых МНТ с целью оценки сохранения свойств модулей МНТ в составе МНТ-Nrf2p. Радиолигандным методом была проведена оценка связывания МНТ-Nrf2p с целевыми рецепторами EGFR: константа диссоциации составила для EGF-DTox-HMP-Nrf2p – 52 +/- 6 нМ; для EGF-DTox-HMP-NLS-Nrf2p – 24 +/- 1 нМ; для [Afb-EGFR]-DTox-HMP-Nrf2p – 19 +/- 1 нМ; для [Afb-EGFR]-DTox-HMP-NLS-Nrf2p – 32 +/- 6 нМ. Все 4 новых МНТ-Nrf2p не только специфически связывались с EGFR, но и интернализовались в соответствующие клетки, что необходимо для доставки фрагмента Nrf2 внутрь клетки. Проверка эндосомолитического модуля осуществлялась на модельных липосомах, нагруженных флуоресцентным красителем до концентрации самотушения флуоресценции, и показала сохранение активности эндосомолитического модуля при рН эндосом во всех 4 новых МНТ-Nrf2p. Функционирование NLS модуля было оценено по взаимодействию МНТ-Nrf2p с гетеродимером импортинов. Как и ожидали, для NLS-содержащих МНТ константа диссоциации с гетеродимером импортинов оказалась в наномолярной области: 200 +/- 110 нМ и 390 +/- 40 нМ для [Afb-EGFR]-DTox-HMP-NLS-Nrf2p и EGF-DTox-HMP-NLS-Nrf2p, соответственно. Методом лазерной конфокальной сканирующией микроскопии изучена внутриклеточная локализация всех созданных МНТ с фрагментом Nrf2. Обнаружено, что спустя 4 часа инкубации меченных Alexa647 МНТ-(фрагмент Nrf2) с клетками A431 флуоресцентный сигнал выявлялся в цитоплазме и ядре. МНТ EGF-DTox-HMP-NLS-Nrf2p и [Afb-EGFR]-DTox-HMP-NLS-Nrf2 достигают ядер клеток более эффективно, чем соответствующие им МНТ, лишенные сигнала ядерной локализации. Другой частью нашей работы по проекту является проверка возможности ингибирования активности онкогена с-Мус посредством доставки в клетки фрагмента антител (ScFv) к нему. В ходе этапа 2017 была запланирована проверка принципиальной возможности использования МНТ, слитых с анти с-Мус ScFv, связываться с с-Мус. Для этой цели была получена генетическая конструкция анти с-Мус ScFv-МНТ на основе гена анти с-Мус ScFv, размещенного в депозитарии Addgene. Дополнительно к запланированному была получена вторая конструкция анти с-Мус ScFv-МНТ на основе аминокислотной последовательности анти с-Мус ScFv к другому домену с-Мус. Оценка взаимодействия в клетке между ScFv-МНТ и с-Мус была осуществлена методом Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET), позволяющего строго детектировать нахождение двух молекул на расстоянии менее 10 нм. Для этого была использована описанная в литературе плазмида EGFP-Myc и созданные нами плазмиды ScFv-МНТ-TurboYfp. Представленные результаты позволяют сделать вывод о наличии в клетке взаимодействия между ScFv-МНТ и с-Мус в случае обоих вариантов ScFv. Суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод, что на данном этапе работы по проекту были получены данные о принципиальной возможности использования МНТ для доставки в клетки таких белков-регуляторов, как фрагменты антител и транскрипционных факторов. МНТ с фрагментами Nrf2 были наработаны, выделены, очищены и охарактеризованы с целью оценки функциональности модулей МНТ. Список цитированной литературы: Barnham K. J., Masters C. L., Bush A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress //Nat. Rev. Drug Discov.. – 2004. – Т. 3. – №. 3. – С. 205-214. Copple, I. M., Dinkova-Kostova, A. T., Kensler, T. W., Liby, K. T., Wigley, W. C. NRF2 as an Emerging Therapeutic Target //Oxidative medicine and cellular longevity. – 2017. – Т. 2017. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the'undruggable'cancer targets //Nat. Rev. Cancer. – 2017. – Т. 17. – С. 502. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Khramtsov Y.V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Georgiev G.P., Sobolev A.S.. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters //Cancer Res. – 2006. – Т. 66. – №. 21. – С. 10534-10540. Lu, M. C., Ji, J. A., Jiang, Z. Y., You, Q. D. The Keap1–Nrf2–ARE pathway as a potential preventive and therapeutic target: an update //Medicinal Res. Rev. – 2016. – Т. 36. – №. 5. – С. 924-963. Rosenkranz A.A., Vaidyanathan G., Pozzi O.R., Lunin V.G., Zalutsky M.R., Sobolev A.S.. Engineered modular recombinant transporters: application of new platform for targeted radiotherapeutic agents to alpha-particle emitting 211 At //Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. – 2008. – Т. 72. – №. 1. – С. 193-200. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Schiffelers R.M., Lupanova T.N., Khramtsov Y.V., Zalutsky M.R., Sobolev A.S.. Modular nanotransporters: a multipurpose in vivo working platform for targeted drug delivery //Int. J. Nanomed. – 2012. – Т. 7. – С. 467. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Morozova N.B., Vorontsova M.S., Petriev V.M., Lupanova T.N., Ulasov A.V., Zalutsky M.R., Yakubovskaya R.I., Sobolev A.S.. Preparation, cytotoxicity, and in vivo antitumor efficacy of 111In-labeled modular nanotransporters // Int. J. Nanomed. – 2017. – Т. 12. – С. 395. Sobolev A. S. // BioEssays. 2008. V. 30. P. 278–287. Ulasov A. V., Rosenkranz A. A., Sobolev A. S. Transcription factors: Time to deliver //J. Control. Release. – 2017. doi: 10.1016/j.jconrel.2017.11.004

Публикации

1. Уласов А.В., Храмцов Ю.В., Лупанова Т.Н., Цветкова А.Д., Розенкранц А.А., Сластникова Т.А., Георгиев Г.П., Соболев А.С. ОПТИМИЗАЦИЯ МОДУЛЬНЫХ НАНОТРАНСПОРТЁРОВ ДЛЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДОСТАВКИ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ Доклады Академии Наук, - (год публикации - 2018)

2. Уласов А.В., Розенкранц А.А., Соболев А.С. Transcription factors: Time to deliver Journal of Controlled Release, Volume 269, Pages 24-35 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2017.11.004

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Целью данного Проекта является разработка системы доставки регуляторных белков - транскрипционных факторов и фрагментов антител - в клетки-мишени. Для этого мы адаптировали модульные нанотранспортеры (МНТ), хорошо зарекомендовавшие себя для доставки низкомолекулярных молекул (таких как фотосенсибилизаторы и изотопы, испускающие альфа-частицы и эмиттеры электронов Оже с короткой длинной пробега испускаемых частиц) in vitro (Gilyazova et al., 2006; Rosenkranz et al., 2008) и in vivo (Slastnikova et al., 2012; Rosenkranz et al., 2018). В качестве доставляемого транскрипционного фактора мы выбрали последовательность на основе Nrf2, хорошо известного как мастер-регулятор антиоксидантной защиты (Copple et al., 2017). Результаты первого года работ по Проекту показали статистически достоверную защиту клеток от индуцированного окислительного стресса после трансфекции плазмидами, кодирующими МНТ, слитыми с фрагментом Nrf2, по сравнению с контрольным МНТ. В ходе этого года мы продолжили исследования и показали, что трансфекция клеток МНТ, слитым с фрагментом Nrf2, по сравнению с контрольным МНТ достоверно увеличивает экспрессию гем-оксигеназы 1 (HO-1), глутатион S-трансферазы P 1 (GSTP1) и показывает тенденцию к увеличению экспрессии регуляторной субъединицы глутамат-цистеин-лигазы (GCLM), NAD(P)H:хинон оксидоредуктазы 1 (NQO1). Все 4 исследованных гена являются изученными мишенями Nrf2 активации. Таким образом, мы показали, что трансфекция клеток МНТ с фрагментом Nrf2 активирует Nrf2/ARE сигнальный каскад, что может быть возможным механизмом защиты клеток от окислительного стресса, продемонстрированной в ходе работ первого года Проекта. Другой частью нашего Проекта является доставка одноцепочечных вариабельных фрагментов антител к с-Myc, клеточному онкогену, ингибирование которого имеющимися лекарствами к настоящему времени малорезультативно (Dang et al., 2017). Для этой цели генно-инженерным способом мы присоединили анти с-Myc ScFv к N-концу МНТ. На предыдущем этапе Проекта мы доказали реализуемость такого подхода, продемонстрировав, что ScFv-МНТ после трансфекции взаимодействует с с-Myc в клетке. В течение 2018 г. мы разработали и оптимизировали протокол выделения ScFv-МНТ (6His-ScFv-DTox-hMyo-NLS-EGF). Выделенный ScFv-МНТ был охарактеризован с целью проверки сохранения свойств модулей МНТ в составе ScFv-МНТ. Связывание ScFv-МНТ с целевыми рецепторами EGFR на поверхности клеток А431 было изучено с помощью конкурентного радиолигандного метода: константа диссоциации для ScFv-МНТ составила 21±4 нM, что подтверждает способность лигандного модуля связываться с рецепторами. Специфическая интернализация ScFv-МНТ в клетки А431 была продемонстрирована на клетках А431, сверхэкспрессирующих EGFR, методом проточной цитометрии, используя флуоресцентно меченный ScFv-МНТ. Проверка эндосомолитического модуля ScFv-МНТ осуществлялась на модельных липосомах, нагруженных кальцеином до концентрации самотушения флуоресценции. Мембранолитическая активность ScFv-МНТ достигала максимума при рН 5-6, снижаясь почти до нуля при нейтральных рН, подтверждая сохранение мембранолитической функции ScFv-МНТ при рН эндосом. Основываясь на данных термофореза, было показано, что ScFv-МНТ сохраняет способность связываться с гетеродимером импортинов (константа диссоциации 68±14 нМ), что является необходимым для транспорта в ядро. Внутриклеточная локализация ScFv-МНТ была изучена методом лазерной конфокальной сканирующей микроскопии. Спустя 4 часа инкубации меченных Alexa647 ScFv-МНТ с клетками А431 флуоресцентный сигнал выявлялся в цитоплазме и ядре. В то же время избыток свободного EGF значительно снижал внутриклеточное накопление ScFv-МНТ, что вместе с данными проточной цитометрии показывает специфическую интернализацию ScFv-МНТ в клетки-мишени. В дополнение к запланированным на этот год экспериментам и ориентируясь на заявленные на следующий год Проекта опыты in vivo, мы провели предварительные эксперименты по оценке способности МНТ доставлять «полезный груз» в печень мыши. Для этого мы использовали однофотонный эмиссионный компьютерный томограф, совмещенный с рентгеновским компьютерным томографом (SPECT/CT) для мелких лабораторных животных (биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова). Мечение МНТ индием-111 было проведено, как описано ранее (Rosenkranz et al., 2018). Было продемонстировано, что после системного введения МНТ с лигандом к EGFR, экспрессирующимся на гепатоцитах, ~55% введенного МНТ накапливается в печени и остается на этом уровне в течение нескольких суток. Таким образом, мы полагаем, что использование МНТ с фрагментом Nrf2 возможно в качестве терапевтической стратегии для лечения болезней печени, ассоциированных с окислительным стрессом. Список цитированной литературы: Copple, I. M., Dinkova-Kostova, A. T., Kensler, T. W., Liby, K. T., Wigley, W. C. NRF2 as an Emerging Therapeutic Target //Oxidative medicine and cellular longevity. – 2017. – Т. 2017. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the'undruggable'cancer targets //Nat. Rev. Cancer. – 2017. – Т. 17. – С. 502. Gilyazova D. G., Rosenkranz, A. A., Gulak, P. V., Lunin, V. G., Sergienko, O. V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Georgiev G.P., Sobolev A.S. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters //Cancer research. – 2006. – Т. 66. – №. 21. – С. 10534-10540. Rosenkranz A. A., Slastnikova, T. A., Karmakova, T. A., Vorontsova, M. S., Morozova, N. B., Petriev, V. M., Yakubovskaya, R. I., Georgiev G.P, Sobolev A.S. Antitumor activity of Auger electron emitter 111In delivered by modular nanotransporter for treatment of bladder cancer with EGFR overexpression //Frontiers in Pharmacology. – 2018. – Т. 9. – С. 1331. Rosenkranz A. A., Vaidyanathan, G., Pozzi, O. R., Lunin, V. G., Zalutsky, M. R., Sobolev, A. S. Engineered modular recombinant transporters: application of new platform for targeted radiotherapeutic agents to α-particle emitting 211At //Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. – 2008. – Т. 72. – №. 1. – С. 193-200. Slastnikova T. A., Rosenkranz, A. A., Gulak, P. V., Schiffelers, R. M., Lupanova, T. N., Khramtsov, Y. V., Zalutsky M.R., Sobolev, A. S. Modular nanotransporters: a multipurpose in vivo working platform for targeted drug delivery //International journal of nanomedicine. – 2012. – Т. 7. – С. 467.

Публикации

1. Розенкранц А.А., Сластникова Т.А., Кармакова Т.А., Воронцова М.С., Морозова Н.Б, Петриев В.М., Абросимов А.С, Храмцов Ю.В., Лупанова Т.Н.,Уласов А.В., Якубовская Р.И., Георгиев Г.П., Соболев А.С. Antitumor Activity of Auger Electron Emitter 111In Delivered by Modular Nanotransporter for Treatment of Bladder Cancer With EGFR Overexpression Frontiers in Pharmacology, 9:1331 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01331

2. Сластникова Т.А., Уласов А.В., Розенкранц А.А., Соболев А.С. Targeted intracellular delivery of antibodies: The state of the art Frontiers in Pharmacology, 1208 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01208

3. Соболев А.С. Modular Nanotransporters for Nuclear-Targeted Delivery of Auger Electron Emitters Frontiers in Pharmacology, 952 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00952

4. Д.И.Зрелкин, А.А.Розенкранц, А.В.Уласов, Т.А.Сластникова, Т.Н.Лупанова, А.С.Соболев Тестирование модулей новых модульных нанотранспортеров для доставки фрагмента фактора транскрипции Nrf2 в клетки-мишени Международный форум "Биотехнология: состояние и перспективы развития", выпуск 16 (год публикации - 2018)

5. Карягина Т.С., Уласов А.В., Сластникова Т.А., Лупанова Т.Н., Храмцов Ю.В., Писарева В.А., Розенкранц А.А., Соболев А.С. Таргетная доставка 111in в ядра опухолевых клеток-мишеней с помощью модульных нанотранспортеров, нацеленных на рецепторы эпидермального фактора роста Успехи молекулярной онкологии, т.5, №4 (год публикации - 2018)

6. Храмцов Ю.В., Уласов А.В.,Розенкранц А.А., Соболев А.С. Оценка концентрации экзогенного конкурента за связывание с Кeap 1, необходимой для вызывания заметного биологического эффекта «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (MOSM2018), стр. 248 (год публикации - 2018)

7. - Передача Черные дыры. Белые пятна телеканал Культура, Эфир от 01.03.2018 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью настоящего проекта является разработка эффективных методов доставки в клетки-мишени рекомбинантных биологически активных макромолекул таких, как транскрипционные факторы, другие регуляторные белки и антитела к внутриклеточным антигенам. Для достижения этой цели в этом году мы исследовали наиболее перспективный вариант МНТ, активирующий Nrf2/ARE-сигнальный путь, на модели мышиной почечной недостаточности, а также изучили способность ScFv в составе МНТ связываться со своим антигеном с-Мус с использованием метода термофореза, кроме того получили и наработали конструкцию OmoMyc-МНТ и методом термофореза проверили ее способность связываться с белками с-Мус и Мах, а также препятствовать взаимодействию с-Мус:Мах. На двух клеточных линиях HCT-116 (колоректальная карцинома) и AML12 (мышиные гепатоциты) было показано достоверное увеличение соотношения содержания Nrf2 в ядре к содержанию Nrf2 в цитоплазме клеток спустя 0.5 часа (обе линии) и 2 и 4 часа (линия HCT-116) инкубации с 200 нМ МНТ-monobody(анти Кеар1) относительного данного параметра для контрольного МНТ. Полученные данные подтвердили способность МНТ-monobody(анти Кеар1) активировать сигнальный путь Nrf2 in vitro. Поскольку Nrf2 помимо генов антиоксидантной защиты активирует также экспрессию генов, вовлеченных в биотрансформацию и детоксикацию ксенобиотиков за счет наличия в их регуляторной части antioxidant/electrophile респонсивных элементов (ARE), то часто используемой in vivo моделью индукции Nrf2/ARE является защита от токсического действия, например, ацетаминофена. Для изучения нарушения работы печени с помощью аналитических наборов измеряли активность ферментов аланинаминотрансферазы (АЛС) и аспартатаминотрансферазы (АСТ). Внутрибрюшинное введение ацетаминофена мышам линии C57bl/6J в дозе 300 мг/кг через 3 часа приводило к увеличению активности АЛТ в 3,3 раза (до величины 255 +/- 37 U/L, p < 0,0001) и активности АСТ в 1,7 раза (до величины 111 +/- 11 U/L, p < 0,0001). Введение конструкции МНТ, активирующей Nrf2 сигнальный путь, в дозе 7 нмоль приводило к достоверному уменьшению эффекта ацетаминофена на активность АСТ в сыворотке (70,1 +/- 11,7 U/L) по сравнению с группой животных, получавших контрольную конструкцию (103,8 +/- 9,9; p < 0,05). Достоверного влияния МНТ-monobody на уровень активности АЛТ через 3 часа после введения ацетаминофена выявлено не было, однако, была обнаружена недостоверная тенденция к различию в активности АЛТ между группами животных, получавших опытный и контрольный МНТ за 2 часа до введения. Таким образом, исследование действия МНТ, активирующий Nrf2/ARE-сигнальный путь, на мышиной модели печеночной недостаточности, индуцированной ацетаминофеном, по результатам измерения активности АСТ выявило возможность защиты тканей от действия ацетаминофена, что свидетельствует о работоспособности in vivo подхода по доставке индукторов Nrf2/ARE с помощью МНТ. Исследование взаимодействия ScFv-МНТ с c-Myc было проведено методом термофореза. Для этой цели была получена конструкция 6His-EGFP-Myc на основе плазмиды addgene 37608. Белок EGFP-c-Myc был выделен с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе и очищен до мономерной фракции на колонке Superdex 200. Первоначально измеренная константа диссоциации комплекса EGFP-c-Myc:ScFv-МНТ оказалась в микромолярной области (1,10 +/- 0,05 мкМ), что может быть объяснено данными гель-фильтрации, по которым выделенный из нерастворимой фракции ScFv-МНТ, несмотря на рефолдинг, находился в преимущественно агрегированном состоянии. Выделение из растворимой фракции ScFv-МНТ приводило к отщеплению части белка ScFv-МНТ. Константа диссоциации комплекса такого усеченного варианта ScFv-МНТ (димерная фракция) и EGFP-c-Myc составила 250 +/- 30 нМ. Проведенный дополнительный подбор ингибиторов протеаз позволил, в конечном счете, получить неусеченный вариант белка ScFv-МНТ, для которого провели дальнейшую очистку гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 до димеров. Константа диссоциации комплекса этого белка и EGFP-c-Myc составила 9 +/- 3 нМ. Таким образом, выделяемый из нерастворимой фракции с хорошим выходом и чистотой ScFv-МНТ продемонстрировал низкое сродство к c-Myc-EGFP, по-видимому, за счет агрегации, а попытки получить его в мономерном или димерном состоянии, хотя и значительно улучшили связывание, однако не привели к достаточным для дальнейших экспериментов на клетках выходам (менее 100 мкг с 2 литров среды). Поэтому дальнейшие эксперименты с ScFv-МНТ мы сочли нецелесообразными. В связи с этим, оставаясь в рамках данного проекта РНФ по внутриклеточной доставке фрагментов антител, нами был проведен анализ литературы и предложен альтернативный вариант фрагмента антитела – анти с-Мус нанободи, который взаимодействует с тем же участком c-Myc, что и Мах, то есть, возможно ингибирование взаимодействия c-Myc:Мах, как ранее нами предполагалось для ScFv-МНТ. На основе опубликованной аминокислотной последовательности был синтезирован ген анти с-Мус нанободи и получена генетическая конcтрукция nb-МНТ (nb-HisTag-DTox-HMP-NLS-EGF). Такой новый транспортер хорошо нарабатывался в E. coli и выделялся из растворимой фракции. Гель-фильтрация на колонке Superdex 200 показала образование достаточного количества мономеров этого белка. Определенные с помощью метода термофореза константа диссоциации комплекса nb-МНТ с EGFP-c-Myc составила 46 +/- 14 нМ, соответственно. Таким образом, нам удалось получить фактически интернализующееся антитело к сМус – nb-МНТ, имеющее высокое сродство к с-Мус и нарабатывающееся в достаточных количествах в мономерном состоянии. Получив такие обнадеживающие данные, нами были проведены эксперименты на нескольких клеточных линиях человека (MCF7, A431), экспрессирующих сМус и рецептор к nb-МНТ – EGFR. Предварительные эксперименты показали, что уже спустя 5 часов после добавления 500 нМ nb-МНТ к клеткам А431 по сравнению с контрольным МНТ наблюдается достоверное (p = 0,0286, критерий Манна-Уитни) 29% подавление экспрессии нуклеолина , известной мишени Мус-индуцируемой активации (Greasley et al., (2000). Nucleic Acids Res., 28(2), 446-453) по иммуноблоту. Похожие результаты были наблюдены и на клеточной линии MCF7. При помощи МТТ-теста после инкубации 500 нМ МНТ с клетками MCF7 для nb-МНТ был выявлен статистически значимый (р < 0,05 по t-критерию Стьюдента) антипролиферативный эффект по сравнению с контрольным МНТ. Так, для nb-МНТ относительная пролиферативная активность составляла 81 +/- 5 % от контрольного МНТ. Дополнительно к первоначально запланированным исследованиям мы провели комплекс работ по созданию МНТ, несущих в качестве функционального модуля последовательность OmoMyc. Согласно литературным данным, белок OmoMyc (доминантно-негативный вариант с-Мус) должен препятствовать образованию комплекса с-Мус:Мах. Последовательность OmoMyc была получена на основе гена с-Мус. Далее, нами были получены и очищены от агрегатов белки МНТ-OmoMyc, EGFP-c-Myc и EGFP-Mах. Оценку взаимодействия между этими белками осуществляли методом термофореза. Оказалось что константа диссоциации комплекса OmoMyc-МНТ:EGFP-Mах составила 9,4 +/- 0,6 нМ. Необходимо отметить, что к настоящему времени Kd взаимодействия OmoMyc (как в составе слитого белка, так и в свободном состоянии) с Мах и с-Мус не были известны. Более того, до недавнего времени в литературе существовало мнение, что OmoMyc образует комплекс преимущественно с Мус, препятствуя образованию комплекса Myc:Max. Полученные нами результаты согласуются с данными вышедшей в этом году статьи, убедительно демонстрирующей преимущественное взаимодействие OmoMyc именно с Мах, а не с-Мус, что обуславливает клеточные эффекты OmoMyc по подавлению Мус-регулируемой транскрипции. Наши количественные оценки характеристик взаимодействия OmoMyc в составе МНТ с Мах и с-Мус подтверждают и дополняют эти данные. Так, помимо взаимодействия OmoMyc-МНТ с EGFP-Mах методом термофореза было изучено взаимодействие белков OmoMyc-МНТ и EGFP-c-Myc. Полученная константа диссоциации комплекса OmoMyc-МНТ:EGFP-c-Myc составила 58 +/- 5 нМ, что существенно выше, чем для системы OmoMyc-МНТ:EGFP-Mах (9,4 +/- 0,6 нМ), что указывает на преимущественное взаимодействие OmoMyc в составе МНТ с Мах, а не с с-Мус. Суммируя полученные результаты можно заключить, что проведенный по проекту комплекс работ привел по сути к появлению технологии создания так называемых «ныряющих антител» (в нашем случае антителомиметиков, например, монободи), способных проникать в живые клетки-мишени и воздействовать в них на функции молекул-мишеней, а также нового типа МНТ, воздействующих на функционирование транскрипционных факторов как в клетках in vitro, так и in vivo. Мы полагаем, что разрабатываемый подход может быть прорывным направлением как в создании инструментов для изучения функционирования живых клеток, так и, возможно, для разработки терапевтических средств. Все пункты плана были выполнены в полном объеме. Впервые получен ряд новых перспективных вариантов МНТ, влияющих на пути внутриклеточной регуляции в клетках-мишенях. Это открывает возможность начала создания нового класса средств, воздействующих на патологические процессы в клетках заданного типа в организме. Коллектив считает целесообразным продолжение работ с целью расширения панели средств внутриклеточной регуляции в клетках-мишенях и получения достаточного количества материала для приоритетных публикаций в журналах достаточно высокого уровня.

Публикации

1. Карягина Т.С., Уласов А.В., Розенкранц А.А., Сластникова Т.А., Храмцов Ю.В., Лупанова, академик РАН Г.П. Георгиев, А.С. Соболев Новые рекомбинантные носители, специфически связывающиеся с рецептором эпидермального фактора роста Доклады Академии Наук, - (год публикации - 2020)

2. Храмцов Ю.В., Уласов А.В., Розенкранц А.А., Георгиев Г.П., Соболев А.С. Стабилизация модульных нанотранспортеров путем встраивания в них гемина в модифицированном штамме-продуценте с рецептором гема Доклады Академии Наук, - (год публикации - 2020)

3. Янс Д.А., Соболев А.С. Targeted Subcellular Delivery of Anti-cancer Agents Frontiers in Pharmacology, 9, 1577. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01577

4. Розенкранц А.А., Сластникова Т.А., Георгиев Г.П., Залуцкий М.Р., Соболев А.С. Delivery systems exploiting natural cell transport processes of macromolecules for intracellular targeting of Auger electron emitters Nuclear Medicine and Biology, 10.1016/j.nucmedbio.2019.11.005 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.nucmedbio.2019.11.005

5. Карягина Т.С., Сластникова Т.А., Розенкранц А.А., Уласов А.В., Храмцов Ю.В., Лупанова Т.Н., Соболев А.С Исследование свойств и оптимизация структуры рекомбинантных носителей для доставки противораковых средств в ядра клеток-мишеней Успехи молекулярной онкологии, т.6 №4 (приложение), стр 175-176 (год публикации - 2019)

6. Карягина Т.С., Уласов А.В., Сластникова Т.А., Лупанова Т.Н., Храмцов Ю.В.,Розенкранц А.А., Соболев А.С. Оптимизация структуры модульных нанортанспортёров для эффективной доставки эмиттера электронов Оже в ядра опухолевых клеток-мишеней со сверхэкспрессией эпидермального фактора роста. Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2019: материалы XIV международной научной конференции, стр 119 (год публикации - 2019)

7. Розенкранц А.А., Сластникова T.А., Соболев А.С. Возможности использования цитотоксического действия эмиттеров электронов Оже для лечения онкологических заболеваний Сборник научных трудов VI съезда биофизиков России 2019, стр. 245-246. (год публикации - 2019)

8. Сластникова Т.А., Розенкранц А.А., Храмцов Ю.В., Уласов А.В., Соболев А.С. Создание моделей опухоли животных со стабильной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста человека для исследования эффективности новых таргетных препаратов Сборник научных трудов VI съезда биофизиков России 2019, стр. 255-256 (год публикации - 2019)

9. Соболев А.С. Модульная транспортная платформа – инструмент избирательного воздействия на процессы в органеллах живой клетки Сборник научных трудов VI съезда биофизиков России 2019, стр. 29-30 (год публикации - 2019)

10. Уласов А.В., Храмцов Ю.В., Лупанова Т.Н., Розенкранц А.А., Соболев А.С. Количественная оценка взаимодействия доминантно-негативного белка Оmomyc с белками МАХ и с-Мyc Успехи молекулярной онкологии, т.6 №4 (приложение). стр. 181-182 (год публикации - 2019)

Возможность практического использования результатов
Проект направлен на создание новой технологии: разработку технологической платформы модульных нанотранспортеров (МНТ) с целью адресной доставки регуляторных макромолекул (транскрипционных факторов и их фрагментов, фрагментов антител и антителоподобных белков) в заданный компартмент клетки-мишени заданного типа. В результате проведенного комплекса работ впервые продемонстрирована принципиальная возможность создания средств прямого регулирования внутриклеточных процессов в клетках-мишенях заданного типа в противоположность непрямым подходам, основанным на трансфекции клеток или использовании низкомолекулярных веществ, неспецифичных к клеточному типу. Тем самым, устраняется риск нежелательной интеграции экзогенной генетической информации в геном клеток или общие неспецифические эффекты на остальные типы клеток. Развитие платформы доставки белков, воздействующих на внутриклеточные процессы, в нужные компартменты клеток-мишеней заданного типа создает основу для его практического использования исследователями-экспериментаторами как инструмента воздействия на регуляторные процессы в живой клетке. В дальнейшем, как мы предполагаем, развиваемый подход может лечь в основу методов лечения широкого круга заболеваний, обусловленных нарушением регуляторных процессов. Проведенные работы позволяют сделать вывод о создании приоритетного научного и технологического задела в области точной направленной регуляции процессов в организме. Подходы такого рода в перспективе могут привести к созданию «молекулярного полипептидного конструктора», ориентированного на коррекцию регуляторных процессов организма конкретного пациента.