КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 14-15-00745

НазваниеИзучение влияния мутаций гена десмина на фунциональные и структурные особенности митохондрий, а также на процесс аутофагии в патогенезе кардиомиопатий.

РуководительКостарева Анна Александровна, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ

2017 г. - 2018 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словакардиомиопатии, десмин, промежуточные филаменты, митохондрии, аутофагия, саркоплазматический ретикулум, мутации, секвенирование нового поколения, индуцированные плюрипотентные клетки

Код ГРНТИ76.03.00

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Данный проект является продолжением проекта, выполняемого в течение 2014-2016 г., и посвящен изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе генетически детерминированных кардиомиопатий и миопатий – наследственных заболеваний сердца и скелетно-мышечной системы (Elliott P. et al, Eur Heart J 2008). В основе патогенеза данных заболеваний часто лежит нарушение энергетической функции мышечных клеток и их способности к утилизации содержимого, это может происходить вследствие врожденных генетических дефектов структурных и цитоскелетных белков. Расшифровка молекулярных механизмов нарушения энергетической функции клетки и процесса аутофагии позволит определить новые внутриклеточные мишени для создания лекарственных препаратов и разработки генно-инженерных терапевтических подходов. Поскольку кардиомиопатии и миопатии представляют собой тяжелую группу заболеваний с неблагоприятным прогнозом, ранней инвалидизацией и высокой частотой трансплантации сердца актуальность изучения данной группы заболеваний несомненна. Прогресс в изучении данной патологии может быть достигнут благодаря одновременному достижению следующих фундаментальных и клинических целей: поиск новых причинных генов и новых мутаций, раскрытие патогенетических механизмов действия описанных мутаций и создание генно-инженерных подходов для их коррекции. Для достижения первой цели необходимо проведение поиска генетических причин кардиомиопатий и миопатий методом секвенирования нового поколения с использованием целевого обогащения и полноэкзомного секвенирования. Для исследования патогенетических механизмов необходимо проведение экспериментальных работ с использованием первичных генно-модифицированных культур клеток, индуцированных плюрипотентных клеткок от пациентов с известными и вновь описанными мутациями и на экспериментальных животных моделях. Для создания генно-инженерных подходов с целью коррекции эффекта мутаций актуальным является применение современных методов коррекции генома – CRISPR/Cas9 технологии. Предыдущий проект, осуществляемый в течение 2014-2016 года был посвящен функциональному исследованию одного из ключевых цитоскелетных белков мышечной клетки – десмина. Десмин, будучи вовлеченных в патогенез всех типов кардиомиопатий, является одним из наиболее информативных белков для изучения этой группы заболеваний. Внутри мышечной клетки десмин локализован в области Z-диска, он взаимодействует со многими органеллами, обеспечивая их пространственное расположение, интеграцию процессов возбуждения и сокращения, а также участвует в процессе механотрансдукции. В результате работ 2014-2016 г. было показано, что агрегатные мутации гена десмина приводят к нарушению внутримитохондриального захвата кальция (Smolina N, et al, Cell Calcium 2014), снижают эффективность клеточного дыхания и изменяют баланс между синтезом и потреблением АТФ. Нами были получены предварительные данные о том, что под воздействием мутаций гена десмина нарушается эффективность индукции аутофагии. Также в ходе работ 2014-2016 г. было показано, что не только десмин, но и другие белки Z-диска являются важными участниками развития кардиомиопатий и миопатий. Нами было описано несколько новых мутаций в генах цитоскелетных и Z-диск-ассоциированных белков в качестве причины развития кардиомиопатий (Kostareva A et al, PLOS One 2016; Kiselev A, Int J Cardiology 2016). Так, в частности, впервые были описаны мутации в гене филамина С (FLNC) в качестве причины развития кардиомиопатии в сочетании с врожденной миопатией. В связи с этим, в рамках продолжения проекта планируется оценка функционального эффекта мутаций не только десмина, но и филамина С – еще одного компонента Z-дисков мышечных клеток. Для уточнения роли десмина, филамина С и других компонентов Z-дисков в процессе развития гипертрофии миокарда будут изучена экспрессия генов цитоскелетных белков в экспериментальнй модели крыс с коарктацией аорты. Для идентификации новых мишеней для генной терапии и создания в будущем генно-инженерные препаратов планируется апробировать эффект активаторов аутофагии посредством введения генетических конструкций на основе системы CRISPR/Cas9. Таким образом, главными задачами проекта являются: 1. Поиск новых мутаций в генах цитоскелетных белков и белков Z-дисков у пациентов с различными типами кардиомиопатий методом секвенирования нового поколения. 2. Изучение эффекта различных мутаций генов десмина и филамина С на функциональные и структурные особенности митохондрий и процесс аутофагии. 3. Изучение экспрессии генов, кодирующих белки цитоскелета и Z-дисков, а также маркеров аутофагии в экспериментальной животной модели гипертрофии миокарда. 4. Создание генно-инженерной конструкции для стимулирования функции аутофагии и исследование ее эффекта в клетках, несущих мутации гена десмина и филамина С. Актуальность и научная новизна проекта для фундаментальной медицины и молекулярной физиологии. Представленный научный проект позволит раскрыть роль цитоскелетных белков и белков Z-дисков в обеспечении интеграции функций митохондрий, процесса аутофагии и метаболизма мышечных клеток (Vasco Sequeira et al., Biochim Biophys Acta 2014). Исследование описанных взаимосвязей позволит приблизиться к пониманию фундаментальных и клеточных основ процесса механотрансдукции – сопряжения механических стимулов с биохимическими процессами – в миоцитах сердца и скелетных и мышц. Актуальность и научная новизна проекта проекта для клинической медицины. Генная терапия и генно-инженерные препараты для ряда наследственных заболеваний являются единственным возможным терапевтическим подходом. Несмотря на сложность их разработки и узконаправленный спектр действия, именно в области орфанной патологии, миопатий и миодистрофий данные группы препаратов имеют наибольший успех и внедряются в клиническую практику (Ulbricht A et al., Autophagy. 2015). В частности, одним из наиболее успешных примеров применения генно-инженерных терапевтических подходов является миодистрофия Дюшена/Бекера, при которой технология exon skipping была успешно внедрена и является общепризнанным клиническим методом лечения с доказанным эффектом (Goemans NM, et al. N Engl J Med. 2011). Раскрытие молекулярных механизмов развития миопатий и кардиомиопатий позволит определить новые ключевые мишени для создания адресных биологических и генно-инженерных препаратов и обеспечит прогресс в лечении данной группы тяжелых инвалидизирующих заболеваний. Elliott P, Andersson B, Arbustini E et al. Classification of the cardiomyopathies: a position statement from the European Society Of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J. 2008;29(2):270-276. Goemans NM, et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 2011;364(16):1513–1522. Kiselev A, Mikhailov E, Parmon E, Sjoberg G, Swjersen T, Tarnovskaya S, Nugnyi P, Mitrofanova L, Lebedev D, Kostareva A. Progressive cardiac conduction disease associated with a DSP gene mutation. Int J Cardiology, 2016, in press. doi:10.1016/j.ijcard.2016.04.164 Kostareva A., Artem Kiselev, Gudkova A, Frishman G, Ruepp A, Frishman D, Smolina N, Tarnovskaya S, Nilsson D, Zlotina A, Khodyuchenko T, Vershinina T, Pervunina T, Klyushina A, Kozlenok A, Sjoberg G, Golovljova I, Sejersen T, Shlyakhto E. Genetic Spectrum of Idiopathic Restrictive Cardiomyopathy Uncovered by Next-generation Sequencing. PLOS One 2016 DOI:10.1371/journal.pone.0163362 Smolina N, Bruton J, Sjoberg G, Kostareva A, Sejersen T. Aggregate-prone desmin mutations impair mitochondrial calcium uptake in primary myotubes. Cell Calcium. 2014 . Ulbricht A, Gehlert S, Leciejewski B et al. Induction and adaptation of chaperone-assisted selective autophagy CASA in response to resistance exercise in human skeletal muscle. Autophagy. 2015;11(3):538-46. Vasco Sequeira, Louise L.A.M Nijenkamp, Jessica A. Regan, Jolanda van der Velden,⁎ The physiological role of cardiac cytoskeleton and its alterations in heart failure. Biochimica et Biophysica Acta 1838 (2014) 700–722

Ожидаемые результаты
В результате работы по проекту будут получены следующие научные и практические результаты: 1. Будут выявлены новые мутации и причинные гены, приводящие к развитию кардиомиопатий и миопатий. Использование полноэкзомного секвенирования в уникальной группе пациентов с редкими формами заболевания позволит выяввить новые, не описанные ранее причинные гены. 2. Будут созданы линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученные от пациентов с кардиомиопатиями на фоне мутаций в генах, кодирующих белки цитоскелета и Z-дисков. 3. Будут описаны новые механизмы нарушения митохондриальной функции на фоне мутаций гена десмина. В частности, впервые будут получены данные о роли митохондриальной ДНК в генезе асептического воспалительного ответа в мышечной ткани; будут получены данные о сравнении эффекта мутаций десмина с состоянием полного отсутствия десмина в клетке (CRISPR/Cas9 knock-out); будут получены данные о нарушении пространственного взаиморасположения митохондрий, десминовых филаментов и саркоплазматического ретикулума под влиянием мутаций гена десмина. 4. Впервые будут получены данные о влиянии мутаций генов десмина и филамина С на метаболический профиль мышечных клеток, синтез и потребление заменимых и незаменимых аминокислот и энергетических субстратов. 5. Будет описан эффект мутаций гена десмина и филамина С на процесс аутофагии в мышечных клетках, эффект индукторов и блокаторов аутофагии на фоне мутаций гена десмина и филамина С; будет оценен эффект стимуляции аутофагии посредством генной модификации в отношении негативного эффекта мутаций десмина и филамина С. 6. В результате клонирования будет создана плазмида на основе лентивирусного вектора, несущая гена филамина С, а также GFP для достоверной детекции трансгена. 7. Будут получены новые данные о динамике экспрессии белков цитоскелета и Z-дисков в миокарде экспериментальных животных на фоне развития гипертрофии миокарда. Полученные на разных сроках развития гипертрофии данные по экспрессии генов будут сопоставлены с данными по эхокардиографии и нейрогуморальными маркерами. 8. Будут созданы генетические конструкции, влияющие на процесс (интенсивность и степень индукции) процесса аутофагии на основе технологии CRISPR/Cas9.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---