Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В настоящее время повышение урожайности культур на 90 % зависит от успехов селекции, и только 5 % определяется агротехникой. Актуален поиск новых физиологических и молекулярно-генетических механизмов, которые могут стать мишенями для создания высокоурожайных и стрессоустойчивых сортов растений, при этом особое значение приобретает выявление отдельных генов, манипуляция которыми может приводить к перестройкам целого комплекса программ роста и устойчивости. В проекте исследуется потенциал использования мутантов chlorina с высокой эффективностью фотосинтетического аппарата в качестве модели для создания сортов с экономически значимым увеличением продуктивности на примере мутации chlorina f2 3613 ячменя. Данная мутация представляет собой делецию в каталитическом домене фермента хлорофиллид-а-редуктазы (САО) и приводит к полному отсутствию хлорофилла b в фотосинтетическом аппарате мутантов clo f2 3613. Ранее для данного мутанта в условиях выращивания в открытом грунте нами была показана возможность формирования высокопродуктивного фенотипа, который отличался по скорости фотосинтеза, роста, вегетативной и семенной продуктивности от хорошо известного в литературе низкопродуктивного фенотипа, свойственного мутантам chlorina несмотря на их намного более эффективную конвертацию солнечной энергии в расчете на единицу хлорофилла по сравнению с диким типом. За отчетный период продолжалось выявление механизмов восстановления роста и онтогенетической регуляции, увеличения скорости фотосинтеза и продуктивности растений мутантов clo f2 3613. Основные результаты получены по следующим направлениям: (1) Начат метаболомный анализ состава зерна ячменя (мутанта clo f2 3613 и дикого типа), а также листьев растений дикого типа и мутантов clo-f2 низкопродуктивного и высокопродуктивного фенотипа. При использовании метанольной экстракции были обнаружены отличия между метаболитными спектрами хроматограмм растений ячменя дикого типа и мутантов clo-f2 низко- и высокопродуктивных фенотипов – как для листьев, так и для семян. Далее планируется идентификация соединений, затем повторение эксперимента с использованием выбранного метода экстракции с увеличенным размером выборки. Метаболитные профили будут сравнены методом главных компонент. (2) Начат анализ характеристик фитохромов у растений ячменей (дикого типа, низкопродуктивного и высокопродуктивного фенотипов мутанта clo f2 3613). Фитохромная регуляция оказывает существенное влияние на время цветения, что в свою очередь во многом определяет урожайность. Наши предыдущие данные показали, что фитохром В может быть вовлечен в задержку цветения мутанта clo-f2 3613 низкопродуктивного фенотипа, предположительно через изменения симпластного транспорта (Dmitrieva et al., 2017 Plant Signal Behavior), а также в нарушения устьичной регуляции у данного фенотипа (Tyutereva et al., 2017 Functional Plant Biol). Соответственно, представляло интерес изучение роли фитохромов в восстановлении флоральной трансформации и устьичной регуляции у высокопродуктивного фенотипа (Tyutereva et al., 2017 Functional Plant Biol). За отчетный период изучены уровни экспрессии генов всех фитохромов ячменя HvPhyA (GenBank: DQ201158), HvPhyB (GenBank: DQ201142) и HvPhyC (GenBank: DQ238106) у растений дикого типа и мутанта clo-f2 3613. Не обнаружено различий в экспрессии основного фитохрома цветения ячменя - фитохрома С, но выявлены яркие различия в экспрессии фитохромов А и В (в 4 – 10 раз) между растениями высокопродуктивного и низкопродуктивного фенотипа и дикого типа. Показано, что мутация chlorina f2 3613 через неизвестный пока сигнал вызывает подавление экспрессии гена HvPhyB в растениях мутантов обоих фенотипов, и именно это подавление с высокой вероятностью отвечает за часть плейотропных эффектов мутации, связанную с ингибированием роста и флоральной трансформации меристем. У высокопродуктивного фенотипа не происходит восстановления экспрессии HvPhyB, но активируется компенсаторный механизм – повышение экспрессии HvPhyА и образование необычного светостабильного фитохрома А, который предположительно берет на себя часть функций фитохрома В. Таким образом, фитохром А играет важную роль в формировании высокопродуктивного фенотипа мутанта clo-f2 3613. (3) Проведены скрещивания мутантов ch1-3 и phyB арабидопсиса, получены гетерозиготные растения F2. Было произведено скрещивание мутантов ch1-3 и phyB Arabidopsis thaliana, при этом пыльца мутантов phyB использовалась для опыления светло-желтых мутантов ch1-3. Проведен отбор гетерозигот F1 (содержащие оба хлорофилла а и б дигетерозиготы по генам CAO и PhyB), с этих растений были получены семена, а из семян отобраны светло-желтые мутантные по CAO растения для дальнейшего генотипирования с помощью ПЦР с праймерами, специфичными к мутациям по генам CAO и PhyB, соответственно. Далее из полученных растений планируется отбор двойных мутантов по генам CAO и PhyB, получение соответствующих чистых линий и их анализ. На этих растениях как одной из моделей будет впервые изучаться cross-talk между процессами в хлоропластах с измененным набором хлорофиллов и функционированием фитохромной системы. (4). Завершено исследование супрамолекулярной организации гранальных мембран хлоропластов ячменей (дикого типа, низкопродуктивного и высокопродуктивного фенотипов мутанта clo f2 3613) методами замораживания – травления и замораживания-скалывания. Для исследования супрамолекулярной организации гранальных мембран были освоены и сравнены три метода визуализации частиц: замораживания-скалывания хлоропластов (без травления), замораживания–травления (скалывание замороженных хлоропластов, получение реплик с последующим травлением) и негативного контрастирования выделенных с помощью дифференциального центрифугирования гран. Лучше всего зарекомендовал себя метод замораживания–травления. Суспензию хлоропластов фиксировали методом замораживания под высоким давлением в устройстве Leica HPM100 либо погружением в жидкий этан. Проводили скалывание образцов, замороженных под высоким давлением и в жидком этане и напыление сколов углеродом и платиной. Предварительная оценка размеров частиц и их организации в гранальных мембранах ячменей (дикого типа, низкопродуктивного и высокопродуктивного фенотипов мутанта clo f2 3613) проводилась на полученных репликах сколов хлоропластов. Данные показывают различия между двумя фенотипами мутанта практически по всем изученным параметрам, в первую очередь в плотности расположения частиц в мембране. Необходимо отметить, что эти данные получены для зрелых листьев ячменя дикого типа и мутанта chlorina f2 впервые: ранее (70-80 гг). исследования проводились тем же методом, но на 3-недельных проростках, выращенных в лаборатории в условиях низкого света. В совокупности с результатами FRAP-анализа 2016 года данные подтверждают гипотезу, что в основе восстановления высокой скорости фотосинтеза у высокопродуктивного фенотипа мутанта лежат изменения параметров диффузии ключевых интегральных компонентов тилакоидных мембран, в первую очередь пигмент-белковых комплексов гран. (5). Исследована устойчивость мутанта ячменя clo f2 3613 в полевых условиях к патогенам в сотрудничестве с РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию» (Жодино, Республика Беларусь). В отчетном году в сотрудничестве с лабораторией иммунитета РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию» (зав. лаб. к.с.-х.н. Ю.К. Шашко) испытывали рост и устойчивость мутанта clo-f2 3613 к поражению листовыми болезнями на искусственном провокационном фоне лаборатории иммунитета на полях лаборатории в условиях открытого грунта. В качестве эталона использовался родительский сорт Donaria Ackermanns. Обнаружено, что (1) мутация chlorina f2 3613 приводит к подавлению устойчивости растений к насекомым и грибным патогенам, и (2) обработка мутантных растений стробилуриновыми фунгицидами может действовать сходно с затенением, вызывая зеленение растений (за счет накопления хлорофилла а) и нормализацию прохождения онтогенетических фаз. Известно, что жасмоновая кислота и ее производные определяют устойчивость растений к насекомым и ряду патогенов, а также ответственны за остановку роста при ряде стрессов; для этой функции критически необходимо наличие фитохрома В и в меньшей степени А. Наши данные 2014-2016 гг. выявили в низкопродуктивном фенотипе мутанта clo-f2 3613 снижение экспрессии гена 12-оксофитодиеноат-редуктазы – фермента биосинтеза важного предшественника жасмонатов - и ее восстановление у высокопродуктивного фенотипа; важно отметить, что экспрессия гена, кодирующего данный фермент, активируется под влиянием фитохромного сигналинга. Полученные результаты указывают на важную роль фитохромного сигналинга в развитии обоих фенотипов мутанта clo-f2 3613 по следующей гипотетической схеме: хлоропласты передают на фитохромную систему (в норме ответственную за позеленение проростков, например, в процессе деэтиоляции и в ходе нормального развития листа) по неизвестному (и как мы предполагаем, впервые обнаруженному нами в данной работе) сигнальному пути информацию о неполном комплексе хлорофиллов. Это приводит к подавлению экспрессии важнейшего фитохрома – фитохрома В - и вызывает ряд нарушений развития, в частности, задержку перехода к цветению, а также параллельную деактивацию жасмонатного сигналинга, что позволяет растениям продолжать рост, но приводит к снижению иммунитета. У высокопродуктивного фенотипа активация экспрессии фитохрома А по неизвестному механизму, вероятно, приводит к частичной компенсации дефицита фитохрома В, частичному восстановлению онтогенетического сигналинга и иммунитета. Данная гипотетическая схема будет проверяться на этапе 2018 г. Обнаруженный эффект стробилуринов на формирование высокопродуктивного фенотипа мутанта также будет исследован на этапе 2018 г. более подробно. (6) Проведены эксперименты по введению ячменя в стерильную культуру, этаблирован метод индукции каллусогенеза из зародышей и культивирования каллусной ткани ячменя дикого типа. В дальнейшем будет отрабатываться метод получения каллуса из зародышей мутантных растений, а также агробактериальная трансформация каллусов и регенерация стабильных трансформантов ячменя.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В проекте исследуется потенциал использования мутантов chlorina с высокой эффективностью фотосинтетического аппарата в качестве модели для создания сортов с экономически значимым увеличением продуктивности на примере мутации chlorina f2 3613 ячменя. Ранее для данного мутанта в условиях выращивания в открытом грунте нами была показана возможность формирования высокопродуктивного фенотипа, который отличался по скорости фотосинтеза, роста, вегетативной и семенной продуктивности от хорошо известного в литературе низкопродуктивного фенотипа, обычно свойственного мутантам chlorina. В 2018 г. получены следующие результаты: (1) Охарактеризованы уровни экспрессии генов фитохромов у растений ячменя низкопродуктивного и высокопродуктивного фенотипов мутанта clo f2 3613. Показано, что уровни экспрессии фитохромов значительно изменены у chlorina f2 3613 по сравнению с диким типом на всех стадиях развития. Показано, что изменения экспрессии фитохромных генов PhyA и PhyB в листьях растений chlorina f2 3613 сопровождаются соответствующими изменениями в процессе флоральной трансформации меристем. (2) Показано, что в листьях ячменя экспрессия фитохромных генов ячменя изменяется в зависимости от состояния ЭТЦ хлоропластов, а также от биосинтеза белка в хлоропластах и от уровня тетрапирролов, и вероятно, находится под контролем пластидных сигналов. Показано, что регуляция экспрессии фитохромных генов пластидными сигналами, в отличие от ячменя, вероятнее всего отсутствует у Arabidopsis. (3) Исследованы интермедиаты биосинтеза хлорофиллов: протохлорофиллиды, а также птерины, флавины, и НАДФН, у проростков ячменей дикого типа и мутанта chlorina f2 3613 с помощью спектрофлуориметрии. Обнаружены различия между мутантом и диким типом для этиолированных проростков. При помещении этиолированных проростков на свет различий в биосинтезе хлорофиллов обнаружено не было. (4) Впервые показано, что фоторецепторы участвуют в изменениях симпластного транспорта у Arabidopsis. (5) Показано, что в листьях взрослых растений ячменя дикого типа Donaria симпластная проводимость была в несколько раз ниже, чем у низкопродуктивного фенотипа мутанта chlorina f2 3613. Переход мутанта к высокопродуктивному фенотипу вызывает достоверное снижение симпластной проводимости, что указывает на восстановление регуляции плазмодесм. (6) Изучены процессов электронного транспорта и механизмов балансировки фотосистем 1 и 2 у высокопродуктивного фенотипа clo f2 3613 по сравнению с низкопродуктивным фенотипом и диким типом, и анализ фотосинтетического газообмена и транспирации. Описаны отличия функционирования фотосистем у высокопродуктивного фенотипа chlorina f2 3613, которые приводят к усилению скорости фиксации CO2 выше, чем у дикого типа. (7) Выполнен метаболомный анализ состава зерна ячменя (мутанта clo f2 3613 и дикого типа), а также листьев растений дикого типа и мутантов clo-f2 низкопродуктивного и высокопродуктивного фенотипа. Сравнение метаболитных профилей зёрен ячменя с использованием PCA (метод главных компонент) и PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis) показало, что метаболитные профили зёрен всех трёх фенотипов ячменя достоверно различаются между собой. (8) Впервые оценена пищевая ценность зерна мутанта chlorina f2 3613 высокопродуктивного фенотипа. (9) Впервые изучена устойчивость мутантов ячменя из аллельной серии chlorina (на примере chlorina f2 3613) к патогенам в условиях выращивания в открытом грунте. Обнаружено, что мутация chlorina f2 3613 приводит к подавлению устойчивости растений к грибным патогенам, что согласуется с ингибированием салицилатного пути сигналинга у растений с редуцированным уровнем активных фитохромов В. По результатам проекта зарегистрированы 2 РИД, а также оформляется заявка в Роспатент. Планируется публикация подготовленных к печати материалов (всего 8 статей в журналы, индексируемые в WoS core collection).