КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 17-74-10090
НазваниеИммобилизованные золотые нанозвезды для высокоэффективной лазерной трансфекции адгезивных клеточных культур
РуководительПылаев Тимофей Евгеньевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Саратовский научный центр Российской академии наук", Саратовская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2017 - 06.2019 |
Конкурс№23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
Ключевые словатрансфекция, клеточные культуры, золотые нанозвезды, оптопорация, генотерапия
Код ГРНТИ34.15.19
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Необходимость разработки новых подходов к профилактике инфекционных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных продиктовано вопросами, связанными с такой глобальной проблемой как потребность в обеспечении продовольственной безопасности и продовольственной независимости России. Развитие безопасных и эффективных векторов является важной задачей современного направления медико-биологической диагностики – вакцинопрофилактики. Стандартные векторы, используемые в доклинических испытаниях при генотерапии, являются рекомбинантными вирусами со встроенной кассетой интересующего гена в вирусный геном. У невирусных систем трансгенеза имеются определенные преимущества, перед системами на основе вирусных векторов, такие как относительная несложность производства и сниженный риск иммуногенности. Однако использование этих систем общедоступными процедурами, такими как электропорация или химическая трансфекция, ограничено относительно низкой эффективностью трансфекции и существенной цитотоксичностью. В последнее время широкое применение получила оптическая трансфекция клеток с использованием золотых наночастиц. Принцип метода состоит в усилении энергии лазерного излучения плазмонно-резонансными наночастицами, локализованными вблизи клеток, что приводит ко временному увеличению проницаемости их мембраны для целевых молекул генной терапии (ДНК-векторов, siРНК) или иных целевых веществ. Несмотря на высокую производительность и простоту использования данная методика обладает рядом нежелательных эффектов, связанных с неспецифической адсорбцией наночастиц во время инкубации наночастиц с клетками, а также потенциальной токсичностью наночастиц, что может привести к снижению эффективности трансфекции. Данный проект направлен на разработку удобной, надежной и эффективной технологии оптопорации, основанной на использовании золотых нанозвезд, иммобилизованных в лунках культуральных планшетов в виде монослоя. Повышение эффективности доставки целевых биомолекул будет достигнуто путем тщательной оптимизации параметров нанозвезд (плотность монослоя, размер частиц и т.п.) и режимов оптического облучения (мощность, длина волны, время, и т.п.). Исследование эффективности трансфекции целевых биомолекул в терминах количества трансфицированных клеток и их жизнеспособности современными молекулярно-генетическими, микроскопическими, спектроскопическими и культуральными методами будет оценена в сравнении с общедоступными коммерческими препаратами – агентами для химической трансфекции.
Ожидаемые результаты
Оптопорация является сравнительно новой технологией, которая может повысить эффективность доставки биомолекул генной терапии (например, siRNA) или иных целевых веществ. Основной ожидаемый фундаментальный результат данного проекта – разработка удобной, надежной и эффективной технологии оптопорации адгезивных клеток, основанной на использовании иммобилизованных монослоев золотых нанозвезд в лунках культуральных планшетов. Ожидаемый практический результат: эффективность разрабатываемой технологии для доставки целевых биомолекул в терминах количества трансфицированных клеток и их выживаемости будет не ниже, чем при использовании коммерческих химических агентов для трансфекции, при значительном снижении её себестоимости и простоты исполнения.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Разработан новый подход для проведения оптопорации животных клеток на основе монослоев золотых нанозвезд, иммобилизованных на культуральном пластике, с применением непрерывного лазерного излучения. Оптимизированы рабочие параметры процедуры оптопорации (плотность и равномерность монослоя, способ иммобилизации, время облучения, рабочая температура и т.д.) для достижения максимальных эффективности оптопорации и жизнеспособности клеток на примере доставки в клетки линии HeLa модельного пенетрирующего агента йодистого пропидия.
Публикации
1. Пылаев Т.Е., Ванжа Е.В., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. A novel cell transfection platform based on laser optoporation mediated by Au nanostar layers Journal of biophotonics, - (год публикации - 2018)
2. Хлебцов Б.Н., Пылаев Т.Е., Ханадеев В.А., Браташов Д.Н., Хлебцов Н.Г. Quantitative and multiplex dot-immunoassay using gap-enhanced Raman tags RSC advances, V. 7, P. 40834-40841 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1039/C7RA08113H
3. Ванжа Е.В., Пылаев Е.В., Хлебцов Н.Г. Оптопорация клеток на основе иммобилизованных золотых нанозвезд: оптимизация процедуры и определение токсичности Объединенный научный форум «XII чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», «VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды»: науч. тр. Москва, 18-22 сент. 2017 г. // Acta Naturae. Спецвып, Спецвыпуск. С. 176. (год публикации - 2017)
4. Ванжа Е.В., Пылаев Т.Е., Прилепский А.Ю., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Immobilized gold nanostars for high-efficient laser transfection of animal cells and its application for gene delivery Saratov Fall Meeting – 2017, Int. Symp. “Optics and Biophotonics”, Saratov, Russia, 26-29 Sept. 2017, - (год публикации - 2017)
5. Пылаев Т.Е., Фомин А.С., Ванжа Е.В., Староверов С.А., Хлебцов Н.Г. Polyethyleneimine-entrapped gold nanoparticles as a potential delivery system for DNA vaccines against African swine fever virus Saratov Fall Meeting – 2017, Int. Symp. “Optics and Biophotonics”, Saratov, Russia, 26-29 Sept. 2017, - (год публикации - 2017)
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведена количественная валидация эффективности разработанного метода плазмонной оптопорации клеток in vitro на монослоях золотых нанозвезд (ЗНЗ). Модельные эксперименты проведены на клетках линии HeLa, при оптимальных режимах облучения и параметрах монослоев ЗНЗ: плотность монослоя Au, ~ 15 мкг/см2, энергия облучения 15-30 Дж (интенсивность излучения, площадь облучаемой поверхности и время облучения составляли 1 Вт/см2; 0,5 см2, и 150 секунд соответственно), рабочий температурный диапазон во время облучения 42-45 °С. В качестве модельных плазмид выбраны векторы, несущие гены флуоресцентных белков, экспрессирующихся внутриклеточно (pGFP – плазмида, несущая ген зеленого флуоресцентного белка) либо экстраклеточно (pCMV-GLuc 2). Препаративное количество плазмид наработано с помощью технологии молекулярного клонирования в клетках кишечной палочки, с последующим селективным отбором клонов и экстракцией плазмидной ДНК. Эффективность плазмонной оптопорации клеток и внутриклеточной доставки pCMV-GLuc 2 плазмиды, по данным измерения люциферазной активности, 295 ± 9,8 RLU, значительно выше эффективности препарата TurboFect (220 ± 11,3 RLU). Эффективность плазмонной оптопорации и внутриклеточной доставки pGFP плазмиды по данным конфокальной лазерной сканирующей микроскопии составила 95 ± 5%. Наконец, жизнеспособность клеток HeLa, проанализированная с помощью резазурин-теста через 72 ч после трансфекции, составила 92 ± 7% (для плазмонной оптопорации) и 75 ± 7% для клеток, трансфицированных TurboFect.
Основные результаты исследований были опубликованы в двух статьях (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jbio.201800166, https://peerj.com/articles/5237/) в профильных рейтинговых журналах первого квартиля (Q1), и представлены на зарубежной международной конференции по теме проекта. Кроме того, по материалам проекта был подготовлен пресс-релиз (http://rscf.ru/ru/node/uchenye-iz-rossii-sozdali-zolotoy-nano-shprits-dlya-gennoy-terapii) на основе научно-популярных статей (https://ria.ru/20190219/1551063697.html), и прочтена публичная научно-популярная лекция (Видеозапись доступна по ссылке: https://www.youtube.com/watch?reload=9&v=rp_fED2XWOE). Таким образом, разработанный в настоящем проекте новый метод внутриклеточной доставки генетических конструкций является простой и удобной системой с высокими параметрами эффективности и выживаемости клеток. Мы надеемся, что полученные результаты проекта могут быть востребованы в лабораторной и клинической практике, как основа новых разработок, в области клеточной инженерии, генной терапии, молекулярной диагностики, фармакологии и пр., направленных на переход к персонализированной медицине и улучшению качества жизни и здоровья населения.
Публикации
1. Ветчинкина Е.П., Лощинина Е.А., Купряшина М.А., Буров А.М., Пылаев Т.Е., Никитина В.Е. Green synthesis of nanoparticles with extracellular and intracellular extracts of basidiomycetes PeerJ, Вып. 7, № статьи e5237 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.7717/peerj.5237
2. Пылаев Т.Е., Авдеева Е.С., Хлебцов Б.Н., Захаревич А.М., Хлебцов Н.Г. A novel centrifuge-based approach for tunable 2D layering of plasmonic nanoparticles Proc. SPIE ,Saratov Fall Meeting 2018: Computations and Data Analysis: from Nanoscale Tools to Brain Functions, 11067 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2522135
3. Пылаев Т.Е., Ванжа Е.В., Авдеева Е.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. A novel cell transfection platform based on laser optoporation mediated by Au nanostar layers Journal of Biophotonics, 11, статья № e201800166 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1002/jbio.201800166
4. Пылаев Т.Е., Авдеева Е.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Design of a novel gene delivery system based on Au nanostar layers upon laser irradiation International conference on nanomedicine and nanobiotechnology – 2018, Rome, Italy, 26-28 Sept. 2018., - (год публикации - 2018)
5. - Ученые из России создали золотой "нано-шприц" для генной терапии РИА Новости, РИА Новости, Москва, 19 февраля 2019 г. (год публикации - )
6. - Золотые нанозвезды помогут доставлять вещества в клетку Индикатор.ру, Индикатор.ру, Химия и науки о материалах, 19 февраля 2019 г. (год публикации - )
7. - Золотые нанозвезды и лазер: генная пушка, бьющая точно в цель Научно-популярный лекторий "Око хокинга", Видеозапись открытой лекции Пылаева Т.Е. научно-популярного лектория "Око Хокинга" (год публикации - )
8. - Ученые из России создали золотой «нано-шприц» для генной терапии Лента новостей Российского научного фонда, - (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
Полученные результаты проекта могут быть востребованы в лабораторной и клинической практике, как основа новых разработок, в области клеточной инженерии, генной терапии, молекулярной диагностики, фармакологии и пр., направленных на переход к персонализированной медицине и улучшению качества жизни и здоровья населения.