Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект посвящен исследованию молекулярных механизмов, лежащих в основе антираковой активности эндогенных пептидов человека SLURP-1 и SLURP-2, модулирующих работу никотинового ацетилхолинового рецептора человека (nAChR). Благодаря важной роли, которую играет nAChR в межклеточной сигнализации, понимание механизмов, лежащих в основе регуляции работы рецептора, является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии. Данные, полученные в ходе выполнения этого проекта, будут интересны не только с точки зрения фундаментальной науки, но, в перспективе, также могут быть применены для разработки новых противоопухолевых таргетных препаратов, обладающих низкой иммуногенностью и токсичностью. Для исследования антираковой активности пептидов SLURP были наработаны достаточные для осуществления проекта количества рекомбинантных пептидов SLURP-1, SLURP-2 и мутантных вариантов SLURP-1. Мы установили, что пептиды SLURP-1 и SLURP-2 подавляют рост линий опухолевых клеток: карциномы груди SKBR-3 и MCF-7, карциномы легкого А549, карциномы почки ACHN, лейкемий Jurkat. Наибольший антипролиферативный эффект был показан на клетках SKBR-3 и MCF-7. Оба пептида SLURP ингибировали рост клеток Jurkat, SLURP-1 был активен в отношении ACHN. Препараты SLURP не ингибировали рост клеток U937. Ингибируя рост линий раковых клеток, пептиды SLURP-1 и SLURP-2 в наномолярных концентрациях оказывали минимальное влияние на рост нормальных клеточных линий: кератиноцитов человека НАСАТ, клеток легкого WI-38, фибробластов крайней плоти, гепатоцитов Chang, демонстрируя свойства т.н. «фармакологического окна». Изучение продолжительности антипролиферативного действия SLURP показало, что они сохраняют активность на клетках MCF7 и SKBR-3 при 48-часовой инкубации. Мы показали, что пептиды SLURP не проявляют цитотоксических свойств, а механизм их действия можно охарактеризовать как антипролиферативный. Изучение влияния пептидов на клеточный цикл выявило, что SLURP-1, но не SLURP-2 вызывает уменьшение количества клеток в G0/G1 фазе клеток А549, что согласуется с ранее полученными результатами о анти- и про- пролиферативной активности белков SLURP-1 и SLURP-2 в клетках А549 соответственно. Оба пептида SLURP вызывали уменьшение количества клеток А431 и SKBR3 в G0/G1 фазе клеточного цикла, но не в клеточном цикле нормальных клеток (НАСАТ и фибробластах крайней плоти). Таким образом, можно заключить, что пептиды SLURP проявляют антипролиферативную активность посредством ареста клеточного цикла. Установлено, что SLURP-1 значительно снижает скорость миграции клеток А549 и А431. На клетках НТ29 наблюдалось снижение миграции клеток только под действием пептида SLURP-2. При этом оба пептида SLURP не влияли на скорость миграции клеток MCF-7. Показано, что SLURP-1 ингибирует рост не только клеток, культивируемых в монослое, но также мультиклеточных сфероидов - модели солидных опухолей, полученных из клеток А549, А431 и SKBR-3. SLURP-2 оказывал ингибирующее действие только на мультиклеточные сфероиды A431. На рост мультиклеточных сфероидов MCF-7 ни один из пептидов SLURP не оказывал значительного ингибирующего действия. С целью идентифицировать молекулярную мишень действия SLURPв раковых клетках, мы подтвердили экспрессию функционального α7-nAChR на мембране клеточных линий А431, MCF-7, SKBR3, A549 и Het-1A. Далее, используя флуресцентно-меченый SLURP-1, мы обнаружили со-локализацию SLURP-1 и α7-nAChR на плазматической мембране клеток A431, MCF7 и SKBR3. Для детекции мишени действия SLURP был проведен также ингибиторный анализ. Селективный ингибитор α7-nAChR, токсин α-Bgtx продемонстрировал антипролиферативный эффект сравнимый с эффектом SLURP на всех тестируемых клетках. Однако α-Bgtx будучи высокотоксичным, не может быть использован для системного лечения рака. Неспецифический ингибитор nAChR мекамиламин отменял эффект пептидов SLURP на клетках А431, А549 и SKBR3. Эксперименты со специфическим ингибитором mAChR атропином показали, что активность SLURP-1 не зависит от mAChR в клетках А431, А549 и SKBR3. В то же время активность SLURP-2, частично, может быть опосредована взаимодействием с mAChR. Ингибирование β-AR тимололом и EGFR гефитинибом в клетках А431 не оказывало существенного влияния на антипролиферативную активность SLURP. Это свидетельствует о том, что β-AR и EGFR не участвуют в проведении внутриклеточных сигналов обеспечивающих активность пептидов SLURP. Эффект пептидов SLURP на клетках A431 был выражен сильнее, чем эффект гефитиниба, одобренного препарата для лечения некоторых видов рака. Совместное применение гефитиниба и SLURP приводило к аддитивному эффекту, который выражался в почти полной остановке пролиферации клеток А431. Разработан протокол экстракции из клеток А431 мишеней пептидов с помощью магнитных частиц с иммобилизованными на их поверхности молекулами SLURP-1, который позволит провести анализ мишеней действия SLURP методом масс-спектрометрии. Поскольку известно, что никотин вызывает пролиферацию раковых клеток, мы исследовали его действие в комбинации с SLURP-1. Действительно, мы увидели, что никотин усиливает пролиферацию клеток A549 и увеличивает экспрессию α7-nAChR в этих клетках. Было показано, что инкубация клеток совместно с никотином и SLURP-1 отменяет никотин-индуцированный рост клеток и увеличение количества α7-nAChR на мембране А549. Таким образом, SLURP-1 возможно обладает протекторным свойством при никотин-индуцированной пролиферации клеток рака легкого. Мы установили, что обработка клеток А431 рекомбинантным препаратом SLURP-1 снижает содержание функционального α7-nAChR на поверхности плазматической мембраны, а также снижает уровень эндогенного внутриклеточного SLURP-1. Было показано, что клетки А431 секретируют эндогенный SLURP-1 во внеклеточную среду постоянно, а обработка клеток рекомбинантным препаратом приводит к дополнительному быстрому освобождению внутриклеточных депо и секреции эндогенного пептида в культуральную среду. Возможно, обнаруженная секреция SLURP-1 лежит в основе аутокринного/паракринного действия пептидов SLURP. Увеличение концентрации SLURP во внеклеточной среде может стимулировать соседние клетки к секреции собственных сигнальных белков, запуская положительную обратную связь.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проект посвящен исследованию молекулярных механизмов, лежащих в основе антираковой активности эндогенных пептидов человека семейства Ly-6/uPAR, модулирующих работу никотинового ацетилхолинового рецептора человека (nAChR). Благодаря важной роли, которую играет nAChR в межклеточной сигнализации, понимание механизмов, лежащих в основе регуляции работы рецептора, является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии. На втором этапе проекта мы уточнили молекулярные мишени действия SLURP-1 в опухолевых и нормальных клетках. Было показано, что антипролиферативный эффект SLURP-1 на клетках эпидермоидной карциномы А431 помимо а7-nAChR опосредуется также GABAA рецепторами. На клетках аденокарциномы легкого А549 нами обнаружено, что антипролиферативный эффект SLURP-1 связан с активацией nAChR, EGFR и β-адренергических рецепторов. Таким образом, в обеих клеточных линиях эффект SLURP-1 опосредован nAChR, а отличия скорее всего объясняются секрецией клетками различных факторов в присутствии SLURP-1. Ингибирование роста нормальных кератиноцитов Het-1A при инкубации с SLURP-1 также опосредуется nAChR. Нами впервые было показано, что ингибитор десенситизации - PNU 120596, действующий на α7-nAChR, полностью отменяет антипролиферативный эффект SLURP-1 на клетках А431 и А549. Таким образом, основным молекулярным механизмом, опосредующим антипролиферативный эффект SLURP-1, является его взаимодействие с десенситизированным состоянием α7-nAChR. Исследование внутриклеточных сигнальных механизмов выявило, что эффект SLURP-1 на обоих типах раковых клеток А431 и А549 опосредован активацией PI3K и PKC. Также, SLURP-1 запускает в клетках А549 и А431 различные внутриклеточные сигнальные пути, что вероятно связано с тем, что SLURP-1 активирует разные поверхностные мишени. Впервые показано, что действие SLURP-1 на нормальные кератиноциты опосредовано p38/MAPK, PI3K, но не IP3-рецепторами, STAT3 и STAT5. Инкубация клеток А431 с SLURP-1 приводила к увеличению фосфорилирования EGFR и ERK1/2 - участников сигнального пути RAF-MEK-ERK. Мы также выявили усиление фосфорилирования CREB, который является нижестоящим эффектором ERK. Другим крупным сигнальным каскадом, активируемым SLURP-1 в клетках А431, был Wnt-путь. Мы наблюдали достоверное увеличение фосфорилирования компонентов этого пути – GSK3 α/β и β-catenine. В сигнальный каскад, активируемый SLURP-1, также вовлечен АКТ-сигнальный путь поскольку мы обнаружили увеличение фосфорилирования белка PRAS40. Мы наблюдали значительное увеличение фосфорилирования ингибитора циклин-зависимой киназы p27 и онкосупрессорного белка р53. Таким образом, мы обнаружили, что в клетках А431 SLURP-1 запускает EGFR-опосредованные сигнальные каскады, включающие в себя активацию ERK, Wnt-сигнального пути и АКТ-каскада. Проведен анализ активности SLURP-1 на клетках А431 с помощью технологии нокдауна гена α7-nAChR интерферирующей РНК с последующей трансфекцией в клетках экзогенного α7-nAChR дикого типа, либо мутантного варианта α7-nAChR (345-348A) с удаленным внутриклеточным доменом, в котором нарушен сайт связывания G-белков. Полученные результаты прямо указывают на то, что антипролиферативный эффект SLURP-1 в клетках А431 передается посредством α7-nAChR по G-белок опосредованному метаботропному пути. Мы изучили эффект трехпетельного пептида ws-Lynx1 на рост опухолевых клеток А549. Инкубация клеток A549 с ws-Lynx1 в течение 72-часов приводила к концентрационно-зависимому ингибированию роста клеток. Было установлено также, что ws-Lynx1 подавляет индуцированный никотином рост раковых клеток in vitro. Анализ с помощью ингибиторов поверхностных рецепторов показал, что действие ws-Lynx1 на рост клеток A549 опосредовано α7-nAChR. Наблюдаемое подавление эффекта ws-Lynx1 ингибиторами рецептора IP3, PKC и MEK/ERK подразумевает участие PLC-зависимой передачи сигналов с дальнейшей активацией транскрипционных факторов NFκB и STAT5, но не STAT3. Зависимость эффекта ws-Lynx1 от JNK, p38 MAP-киназы и PI3K указывает на возможное вовлечение других сигнальных путей. Анализ антипролиферативной активности ws-Lynx1 на раковых клетках с помощью технологии нокдауна гена α7-nAChR интерферирующей РНК продемонстрировал прямую связь антипролиферативного эффекта ws-Lynx1 с α7-nAChR. Исследование влияния ws-Lynx1 на клеточный цикл клеток A549 показало, что ws-Lynx1 индуцирует остановку клеточного цикла в фазах G0/1 и G2/M после 24 и 72-часовой инкубации, соответственно. Было показано, что ws-Lynx1 подавляет рост клеток A549 не только путем подавления пролиферации через остановку клеточного цикла, но и посредством индукции апоптоза. Мы провели исследование совместного действия SLURP-1 и ряда противоопухолевых препаратов на жизнеспособность мультиклеточных сфероидов полученных из клеток А431 и А549. Показано, что SLURP-1 усиливает эффект всех опробованных химиотерапевтических препаратов как на клетках А549, так и на клетках А431. Наибольший антипролиферативный эффект достигается при совместном применении SLURP-1 и гефитиниба на клетках А431. Для определения структурных детерминант молекулы SLURP-1, важных для лиганд-рецепторного взаимодействия, на основе трехпетельного α-нейротоксина из яда Naja oxiana (NTII) были получены химерные белки, в которых петлевые участки NTII заменены на петлевые участки SLURP-1. С помощью MTT-теста было показано, что наибольшей активность, обладает химерный белок, содержащий фрагмент II петли SLURP-1.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект посвящен исследованию молекулярных механизмов, лежащих в основе антираковой активности эндогенных пептидов человека семейства Ly-6/uPAR, экспрессирующихся в эпителии и модулирующих работу никотиновых ацетилхолиновых рецепторов человека (nAChR). Благодаря важной роли, которую играет nAChR в межклеточной сигнализации, понимание механизмов, лежащих в основе регуляции работы этих рецепторов, является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии. Данные, полученные в ходе выполнения этого проекта, интересны как с точки зрения фундаментальной науки, так и могут быть применены для разработки новых противоопухолевых таргетных препаратов, обладающих низкой иммуногенностью и токсичностью. На 3м этапе проекта был проведен сравнительный анализ фосфорилирования внутриклеточных киназ и транскрипционных факторов при инкубации клеток карциномы кожи А431 с rSLURP-1 в течение 1 часа и 24 часов. Было показано, что EGFR вовлечен в передачу сигнала SLURP-1 при обоих временах инкубации. Кроме EGFR, при обоих временах инкубации наблюдалась активация компонентов Wnt пути. При часовой инкубации с клетками А431, rSLURP-1 вызывает уменьшение фосфорилирования киназ, регулирующих митогенные сигнальные пути (ERK1/2, CREB, RSK1/2/3, с-Jun, АКТ (S473), p70 s6, р38α МАР-киназы), ингибирует фосфорилирование киназ семейства Src (Src, Lyn, Fgr и Lck), активирует транскрипционный фактор STAT5, но уменьшает фосфорилирование STAT2, STAT3 и STAT6; активация р53 (S15, S46) и HSP60 и снижение фосфорилирования HSP27. Кроме того, rSLURP-1 при часовом действии на клетки А431 увеличивал фосфорилирование WNK1 киназы, активирующей АКТ путь, но также ингибирующей сигналы от TGF-β. Таким образом, мы предполагаем, что rSLURP-1 после действия на митогенные сигнальные пути и регуляторы синтез ДНК, вызывает в клетках А431 не апоптотическую гибель, а терминальную дифференцировку либо сам по себе, либо посредством секреции различных факторов, например пикомолярных количеств EGF. Эксперименты с заменой среды на клетках А431 подтвердили, что активность rSLURP-1 отчасти может быть обусловлена секретируемыми факторами. Практически все остальные эффекты rSLURP-1, обнаруженные через час, пропадают через сутки, что может быть связано с адаптацией клеток А431 к эффекту белка. Ранее, мы показали, что rSLURP-1 ингибирует рост клеток карциномы легкого, но не фибробластов легкого. Чтобы изучить причины различия в действии rSLURP-1, мы исследовали экспрессию SLURP1 и CHRNA7 в клетках А549. Мы обнаружили, что экспрессия мРНК SLURP-1 была значительно снижена, а экспрессия функционального α7-nAChR наоборот значительно увеличена в клетках A549 по сравнению с фибробластами WI-38. Похожее распределение экспрессии SLURP1 и CHRNA7 было выявлено в образцах опухолей и нормальных тканей из базы данных TCGA. Таким образом, нечувствительность нормальных клеток к SLURP-1 может быть результатом одновременно повышенной экспрессии SLURP-1 и сниженной экспрессии α7-nAChR. На прошлых этапах проекта с помощью интерферирующих малых РНК мы показали, что антипролиферативный эффект rSLURP-1 в клетках карциномы кожи А431 опосредован α7-nAChR. На данном этапе, мы выявили, что трансфекция клеток карциномы А549 интерферирующими малыми РНК к α7-nAChR снижает экспрессию рецептора на поверхности клеток и отменяет антипролиферативный эффект rSLURP-1, что указывает на α7-nAChR как на его мишень действия. Обработка клеток A549 никотином приводила к увеличению экспрессии CHRNA7, а добавление rSLURP-1 полностью отменяло эффект никотина. Вероятно, этот механизм может лежать в основе протекторного эффекта rSLURP-1 при никотин-индуцированном росте клеток А549, показанном в рамках проекта ранее. На 2м этапе проекта мы показали, что эффект SLURP-1 на клетках А549 обусловлен сигнальным путем PI3K/AKT. Поскольку этот сигнальный путь может отвечать за стимуляцию роста клеток A549 никотином, мы изучили влияние никотина на экспрессию гена PTEN - главного негативного регулятора PI3K/AKT пути. Как мы и предполагали, обработка никотином значительно снижала, а совместное применение никотина и SLURP-1 восстанавливало уровень экспрессии PTEN до контрольного уровня. Таким образом, нами выявлено, что rSLURP-1 селективно тормозит рост клеток карциномы легкого А549 посредством взаимодействия с α7-nAChR и препятствует никотин-индуцированной пролиферации клеток карциномы легкого, регулируя экспрессию онкосупрессора PTEN. Анализ базы данных TCGA (GTEX и GBM), показал, что экспрессия гена CHRNA7 повышена в глиомах по сравнению с нормальной тканью мозга, а также выявил отсутствие SLURP1 в глиомах. Это наблюдение побудило нас исследовать антипролиферативную активность rSLURP-1 на клетках глиом. Было показано, что rSLURP-1 ингибирует рост клеток U251 MG и А172 в наномолярных концентрациях, а неспецифический ингибитор nAChR - мекамиламин (Mec) не влиял на рост клеток U251 MG, но отменял антипролиферативный эффект rSLURP-1. В соответствии с этим анализ экспрессии генов CHRNA7 и SLURP1 в клетках глиомы U251 MG и нормальных астроцитах показал повышенную экспрессию гена CHRNA7 в клетках глиомы U251 MG и отсутствие экспрессии SLURP1 в обоих типах клеток. Таким образом, нами впервые показано, что rSLURP-1 ингибирует рост клеток глиом U251 MG и А172 с наномолярной эффективностью, и установлено, что активность рекомбинантного белка связана с nAChR. В рамках предыдущего и данного этапа проекта с помощью технологии интерферирующих РНК и ингибиторного анализа было показано, что антипролиферативный эффект rSLURP-1 в клетках карциномы кожи и легкого был опосредован его взаимодействием с α7-nAChR. Для рационального дизайна миметиков rSLURP-1 с антипролиферативной активностью мы построили молекулярную модель комплекса rSLURP-1 с α7-nAChR. Для молекулярного моделирования лиганд-рецепторного взаимодействия использовалась полученная нами ранее методом ЯМР структура rSLURP-1 (PDB: 2MUO), модель внеклеточного домена α7-nAChR (α7-ECD) (Lyukmanova et al. 2016), а также данные по влиянию мутаций различных остатков rSLURP-1 на пролиферацию кератиноцитов, полученные ранее. Полученная модель хорошо согласуется с экспериментальными данными об активности rSLURP-1. Анализ модели позволяет предположить наличие второй мишени rSLURP-1, и на эту роль был предложен рецептор EGFR. Для проверки гипотезы о действии rSLURP-1 на EGFR, мы провели ингибиторный анализ с использованием антител к внеклеточному домену EGFR на кератиноцитах человека Het-1A и показали, что добавление антител отменяет антипролиферативную активность SLURP-1. Таким образом EGFR может участвовать в проведении внутриклеточных сигналов, обеспечивающих активность SLURP-1 на клетках Het-1A. Недавно было показано, что экспрессия SLURP-1 снижена в клетках меланомы по сравнению со здоровыми тканями, а также в клетках метастатической меланомы по сравнению с первичной опухолью. Мы провели анализ базы данных TCGA Melanoma и показали, что в образцах первичных меланом экспрессия SLURP-1 снижена по сравнению со здоровыми тканями, а в большинстве тканей метастатической меланомы SLURP-1 отсутствует. Показано, что пониженная экспрессия CHRNA7 связана с большим временем жизни больных метастатической меланомой. Так как экспрессия эндогенных модуляторов α7-nAChR снижена в меланоме, а гиперэкспрессия α7-nAChR является негативным прогностическим фактором, мы изучили антипролиферативную активность rSLURP-1 на клетках первичных меланом, полученных от пациентов РОНЦ им. Блохина. В работе были использованы линии Mel Kor, Mel Cher, Mel P, а также линия Mel Gi. Экспрессия SLURP1 и SLURP2 бала обнаружена во всех изученных линиях клеток. Ген α7-nAChR экспрессируется в клетках линий Mel Kor и Mel Cher. Результаты WST-1 теста показали, что rSLURP-1 значительно тормозит рост клеток меланомы Mel Gi как при 48-часовой, так и при более длительных инкубациях, при этом не было обнаружено достоверного эффекта на рост Mel Cher и Mel Kor и Mel P. Возможно, отличие эффекта rSLURP-1 на клетках Mel P, Mel Cher, Mel Kor, и Mel Gi связано с более выраженной по сравнению с клетками Mel Gi степенью дифференцировки нечувствительных к rSLURP-1 клеток, что подтверждается экспрессией в них различных маркеров дифференцировки, таких как HMB45 или HMW. Также, эффект rSLURP-1 на клетках Mel Gi может быть связан с большей экспрессией на их поверхности молекул CD3 и CD20, участвующих в самообновлении популяции стволовых клеток. Таким образом, экспрессия мРНК эндогенного SLURP-1 снижена в образцах меланом по сравнению со здоровой тканью, а rSLURP-1 тормозит рост некоторых линий клеток первичных меланом. Тот факт, что rSLURP-1 тормозит рост CD20-экспрессирующих клеток свидетельствует о перспективности использования данного препарата для лечения резистентных к терапии меланом. Для изучения действия rSLURP-1 in vivo сначала была исследована иммуногенность этого белка на мышах линии С57BL. Было показано, что rSLURP-1 не вызывает иммунного ответа при каждодневном введении. Введение rSLURP-1 через день вызывает синтез антител в 1,3-5,8 раз ниже, чем у мышей, иммунизированных смесью полного адъюванта Фрейнда и rSLURP-1. Таким образом, нами показано, что rSLURP-1 обладает низкой иммуногенностью и более предпочтительным способом введения препарата является каждодневное введение. Для исследования фармакокинетики рекомбинантного SLURP-1 его вводили внутривенно мышам линии C57BL в дозе 0,5 мг/кг. К сожалению, метод прямого ИФА оказался недостаточно чувствителен для определения содержания белка SLURP-1 в сыворотке крови, при этом минимальное количество детектируемого SLURP-1 составляло 250 нг. Другим объяснением может служить быстрая деградации и выведение белка из организма животных, что частично согласуется с данными по распределению препарата rSLURP-1 в организме животных. Планируется произвести расчет интегральных параметров фармакокинетики белка по экспериментально определенному временному ряду концентраций C=C(t) в крови в рамках продления гранта. Также, с помощью флуоресцентно-меченного препарата rSLURP-1, было изучено распределение препарата rSLURP-1 в организме лабораторных животных. Было установлено, что препарат rSLURP-1 накапливается в почках мышей, но не в сердце, мозге, печени, селезенке или легком животных. Оценка количества rSLURP-1 показала, что большая часть препарата выходит из кровотока в течение 5 минут. Исходя из накопления rSLURP-1 в почках, можно сделать вывод о почечном выведении белка, что соответствует его относительно низкой молекулярной массе (8974 Да), полярности и низкой липофильности – основным критериям почечного выведения белков. На предыдущих этапах проекта нами in vitro была продемонстрирована антипролиферативная активность rSLURP-1 на клетках карциномы кожи А431 и определены сигнальные пути, запускаемые rSLURP-1 в этих клетках. В рамках 3го этапа проекта нами были проведены пилотные эксперименты по изучению противоопухолевого эффекта rSLURP-1 in vivo в ксенографтной модели карциномы кожи. Была использована технология, позволяющая проводить прижизненную визуализацию опухолей, благодаря подсадки животным люминесцирующей линии клеток А431. Прогрессию карциномы кожи визуализировали in vivo посредством системы IVIS Spectrum CT и ежедневно оценивали объем опухоли штангенциркулем. Полученные данные свидетельствуют о том, что rSLURP-1 значительно тормозит динамику роста карциномы А431 in vivo. Изучение противоопухолевой активности препарата rSLURP-1 in vivo продолжается в данный момент, однако для окончательного понимания эффекта действия rSLURP-1 на рост опухолей in vivo, а также для изучения комбинированного эффекта rSLURP-1 с другими противоопухолевыми препаратами необходимы дальнейшие исследования, которые мы надеемся продолжить в рамках продления гранта. Таким образом, все поставленные задачи выполнены полностью, кроме того, решен ряд незапланированных ранее задач. Показана высокая эффективность и перспективность препаратов на основе белка человека SLURP-1 для терапии карцином и глиом.