КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-75-10065

НазваниеВысокотехнологичные методы для персонализированной in situ диагностики меланомы с помощью нанокапилярных сенсоров.

РуководительЕрофеев Александр Сергеевич, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2017 - 06.2019

Конкурс№23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине

Ключевые словаНаносенсоры, метаболиты, меланома, активные формы кислорода, внеклеточный уровень pH

Код ГРНТИ76.03.29

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Меланома одна из наиболее опасных злокачественных опухолей человека, часто рецидивирующая и метастазирующая практически во все органы, преимущественно локализуется в коже. Особенностью меланомы является слабая ответная реакция организма или её отсутствие, из-за чего зачастую опухоль стремительно прогрессирует. Меланома является наиболее опасным видом рака кожи. По данным отчета о раковых заболеваниях за 2014 год в глобальном масштабе меланома была диагностирована у 232 000 человек и привела к смерти 55 000 человек [World Cancer Report 2014.. World Health Organization. 2014. pp. Chapter 5.14.]. Как правило, при доступной локализации лечение заключается в хирургическом удалении опухоли. При метастазирующих стадиях меланомы применяют иммунотерапию, биологическую терапию, лучевую терапию или химиотерапию, что приводит к улучшению выживаемости [Melanoma Treatment–for health professionals (PDQ). National Cancer Institute. June 26, 2015]. Большинство пациентов излечиваются при диагностике на ранних стадиях. При лечении пятилетние показатели выживаемости в Соединенных Штатах составляют 98% среди лиц с локализованным заболеванием и 17% среди пациентов с метастазируемыми стадиями меланомы [SEER Stat Fact Sheets: Melanoma of the Skin. NCI. Retrieved June 2015.]. В РФ стандартизированный показатель смертности составил 2,23 человека на 100000 населения. Вероятность того, что рак рецидивирует или распространится, зависит от толщины меланомы, скорости деления клеток и т.д.. [World Cancer Report 2014.. World Health Organization. 2014. pp. Chapter 5.14.]. Диагностика на ранних стадиях является ключевым фактором при терапии меланомы, а так же влияет на выживаемость пациентов. На данный момент окончательный диагноз меланомы может быть установлен только после гистологического исследования, проведённого после тотального удаления невуса (опухоли) с достаточным захватом здоровых тканей. В частности, определяется глубина прорастания опухоли, по которой определяется стадии меланомы по Бреслоу. Использование существующих неинвазивных методов, таких как МРТ и КТ, затруднено на ранних стадиях в виду расположения опухолевой ткани на границе фаз (на коже). Ведущие мировые группы предпринимают попытки по созданию селективных сенсоров для диагностики меланомы, большинство из них предполагают использование дорогостоящего оборудования, которое не является доступным для многих медицинских учреждений, а также наличие специализированного персонала [Advanced Biomedical Engineering 5: 111–117, 2016; Sensors 2016, 16(10), 1659; Nature Biotechnology 32, 490–495 (2014)]. Существует острая необходимость в разработке малоинвазивных высокотехнологических методов для быстрой персонализированной диагностики меланомы. Создание высокоселективных и чувствительных сенсоров, способных проводить непрерывный качественный и количественный анализ веществ в образцах в режиме реального времени, важно для развития современных экспресс-методов лабораторной и клинической диагностики меланомы. Одно из перспективных развитий электрохимических методов связано с уменьшением размеров электродов и разработкой методов локального измерения концентраций анализируемого вещества непосредственно у источника происхождения (внутри живых тканей, вблизи клеточных мембран, внутри клеток и т.д.). Известно, что клетки меланомы в отличие от здоровых меланоцитов характеризуются пониженным внеклеточным pH и повышенным уровнем АФК [Expert Rev. Anticancer Ther. 2008, 8, 1751–1757.]. Дифференцировка здоровых и раковых клеток может однозначно проводиться по определению уровня данных метаболитов. Основной целью проекта является разработка наносенсоров для in situ определения метаболитов опухолевой ткани для персонализированной диагностики меланомы. В ходе проекта предполагается разработка нанозондов на основе кварцевых капилляров (10-100 нм) для определения активных форм кислорода и уровня pH для проведения внутри- и внеклеточных измерений в тканях. При изготовлении зондов используются кварцевые для «пэтч-клампа», которые получаются воспроизводимым образом из кварцевых трубок размером 1 мм путем вытяжки на программируемом лазерном пуллере. Ранее коллективу исполнителей удалось создать технологию производства воспроизводимых углеродных нанозондов на основе кварцевых нанокапилляров, путем заполнение пиролитическим углеродом при помощи термической декомпозиции смеси бутана/пропана. Нами была продемонстрирована возможность функционализации таких углеродных наноэлектродов платиной. Валидация электродов была апробирована при определении АФК внутри клеток меланомы и уровня кислорода вблизи живых и мертвых тканей мозга [ACS Nano, 2014, 8 (1), pp 875–884]. В ходе проекта планируется модификация данных зондов для проведения электрохимических измерений в тканях in situ. В зонд будет интегрирован как электрод сравнения так и электромагнитное экранирование для возможности измерения токов порядка 1-10 пА. Также в ходе выполнения проекта необходимо будет решить вопрос по увеличению жесткости конструкции зонда для осуществления многократного ввода в ткань для осуществления 3D картирования области опухолевой ткани. В основе создания pH-сенсоров на основе капилляров лежит принцип изменения заряда модифицированной поверхности нанокапилляра при изменении pH [Nano Lett., 2016, 16 (2), pp 1194–1200]. Нами были проведены предварительные эксперименты по созданию стабильных в широком диапазоне (3,00-10,00 pH) чувствительных pH сенсоров, путем создания тонкой мембраны на конце нанокпилляра из смеси глутарового альдегида, поли-L- лизина и глюкозооксидазы. Разрабатываемые сенсоры за счет своих наноразмеров могут осуществлять 3D зондирование невуса и близлежащих тканей малоинвазивным образом. С помощью таких зондов по уровню метаболитов (АФК, pH и уровень кислорода) будет определяться как латеральное распространение опухоли, так и величина проникновения вглубь, что позволит без операбельно диагностировать стадию меланомы по Бреслоу. Локализация опухоли фиксируется по изменению электрохимического сигнала в результате взаимодействия разрабатываемых сенсоров с метаболитами клеток здоровой и опухолевой ткани. Технология производства таких сенсоров не требует больших затрат, легко воспроизводима [ACS Nano, 2014, 8 (1), pp 875–884], за счет чего возможно одноразовое использование таких зондов. На первом этапе выполнения работ будут разработаны воспроизводимые сенсоры и проведены сравнительные экспериментальные исследования концентрации АФК, pH и уровня кислорода у здоровых и раковых клеток и тканях. На втором этапе выполнения работ будут проведены in vivo исследования по 3D локализации опухолевой ткани у мышей на иммунокомпетентной модели меланома B16. Таким образом в ходе проекта будет исследованы параметры уровня АФК, внеклеточного pH и уровня кислорода на здоровых и раковых клетках и тканях. Будут разработаны нанозонды для in situ определения метаболитов раковой ткани и методика 3D локализации опухолевой ткани in situ, что позволит осуществлять быструю, дешевую персонализированную диагностику стадий меланомы.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта будут разработаны наносенсоры для in situ определения метаболитов раковой ткани для персонализированной диагностики меланомы. Будут впервые определены параметры уровня АФК и внеклеточного pH на здоровых и раковых клетках и тканях при заболевании раком меланомы. По итогам проекта будет разработана методика 3D локализации опухолевой ткани in situ не только в латеральном направлении распространения невуса, а также глубину инвазии, что позволит идентифицировать стадию развития меланомы кожи. Быстрая, доступная и правильная диагностика должна значительно повысить выживаемость при заболеваниях меланомой. In vivo мониторинг клеточных метаболитов невуса на основе разрабатываемых сенсоров позволит определять эффективность действия лекарственных препаратов на ранней стадии, что потенциально позволит развить принципиально новые методики лечения различных заболеваний. Результаты настоящего исследования могут быть успешно применены в прикладной медицине, биологических исследованиях, биоинженерии и нанотехнологиях. Потребителями результатов настоящего проекта станет ряд ведущих исследовательских центров не только в России, но и во всем мире. Готовый продукт интересен для крупных фармацевтических и медицинских центров. В ходе реализации проекта будет опубликовано в рецензируемых российских и зарубежных научных изданиях не менее 4 статей, из них: не менее 3 в изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) или «Скопус» (Scopus). В связи с уникальностью научно-исследовательских работ, сложностью инженерно-конструкторских решений в готовом изделии, результатам настоящего проекта будет дана надежная правовая защита в виде патента на изобретение, которая позволит гарантировать приоритет российских исследователей в столь актуальной области.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе выполнения проекта на первом году были достигнуты следующие научные результаты: 1) Были разработаны воспроизводимые электрохимические наносенсоры для определения концентрации АФК, уровня кислорода на основе кварцевых нанокапилляров, заполненных углеродом с нанесенной платиновой чернью. С помощью разработанных наносенсоров относительно на отрицательным потенциалах возможно определение уровня кислорода, на положительных потенциалах возможно определение активных форм кислорода при измерениях относительно хлорсеребрянного электрода. При калибровке по перекис водорода было показано, что разработанные сенсоры могут определять концентрации до 0,1 мкМ в солевых буферных растворах. 2) Были разработаны стабильны в широком диапазоне (3,00-10,00 pH) чувствительныt pH сенсоров, путем создания тонкой мембраны на конце нанокапилляра из смеси глутарового альдегида, поли-L-лизина и глюкозоксидазы. Перед in vitro и in vivo экспериментами будет проведена калибровка по pH в различных буферных растворах. В ходе выполнения первого этапа были определены оптимальные режимы развертки напряжения. Было выявлено, что солевые растворы не влияют на стабильность и обратимость измерений. 3) В экспериментах по определению внутриклеточного АФК было выявлено, что в опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активных форм кислорода по сравнению со здоровыми мышиными фибробластами. Средний уровень концентрации в единичных клетках меланомы B16 составил в среднем (40±11) мкМ при калибровке по перекиси водорода. На моделях 3D сфероидов был показан впервые пространственный градиент внеклеточного pH. При приближении к сфероиду значения pH уменьшаются. Также были построены профили pH и кислорода внутри сфероидов. Минимальное значение pH наблюдается в центре сферой и для сфероида диаметром 120 мкм составляет 4. С помощью разработанных сенсоров также наблюдается градиент кислорода и гипоксия внутри сфероида. 4) В ходе выполнения работ была опубликована статья в журнале Scientific Reports, который входит в первый квартиль по направлению с пятилетним импакт-фактором – 4,847. Данная статья также индексируется Scopus и в РИНЦ.

Публикации

1. Ерофеев А, Горелкин П., Гаранина А., Алова А., Ефремова М., Воробьева Н., Едвардс К., Корчев Ю., Мажуга А. Novel method for rapid toxicity screening of magnetic nanoparticles Springer Nature, Scientific Reportsvolume 8, Article number: 7462 (2018) (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1038/s41598-018-25852-4

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения проекта во втором году были достигнуты следующие научные результаты: 1) Были получены pH, pO2 профили внутри сфероидов. Был разработан принципиально новый режим измерения pH в живых системах. На данном этапе работы были получены профили по концентрации кислорода внутри сфероидов, было обнаружено, что при проникновении вглубь сфероида, концентрация кислорода значительно уменьшалась, что свидетельствовало о гипоксии. 2) Было оценено влияние противоопухолевых препаратов доцетаксела и монометилауристатина Е на клеточные линии PC3 и 22Rv1. После инкубации клеточной линии 22Rv1 в течение часа наблюдалось значительное увеличение уровня АФК в 1,5 раза в случае добавления монометилауристатина Е. Однако было установлено, что доцетаксел спустя 1 час инкубации не вызывает окислительный стресс внутри клеток, что свидетельствует об ином механизме действия на клеточную линию. Похожий эффект наблюдали при инкубации клеток PC-3 c данными противоопухолевыми препаратами, было установлено, что спустя 1 час инкубации доцетаксел также вызывает окислительный стресс, который в дальнейшем приводит к гибели клеток. 3) На данном этапе работы была разработана установка для электрохимических локальных измерений внутри опухоли у животных. Установка состояла из нескольких составляющих устройств: регистрация разности потенциалов между наносенсором и электродом сравнения осуществлялась patch-clamp усилителем Model 2400 (“A-M Systems”, США). Передача и запись измерений на компьютер осуществлялась с помощью АЦП-ЦАП преобразователя USB-6211 (“National instruments”, США) и программы WinWCP. Для подведения наносенсора использовали микроманипулятор PatchStar (“Scientifica”, Великобритания). Данная установка позволяла проводить внутриклеточные, а также внутриопухолевые исследования, при этом манипулятор позволял подводить наносенсор к определенной области с точностью до 100 нм, что позволяло проводить измерение концентрации метаболитов в точно выбранной области опухолевой ткани. С помощью используемого пэтч-кламп усилителя возможно измерение сверх малых токов вплоть до 1 пА. Преимущество разработанной установки заключается в том, что ее использование возможно не только для проведения внутриклеточных измерений, измерений внутри сфероидов и внутри опухолей мыши. Но также установка может быть использована в дальнейшем для выполнения исследований на других моделях опухолей 4) В ходе выполнения работ проекта было определено влияние лекарственных средств на АФК внутри опухоли мыши in vivo. Было изучено влияние рибофлавина на АФК внутри опухоли, а также его накопление. Показано, что при облучении опухоли, увеличивался ток, что свидетельствовало об успешном накоплении введенного рибофлавина и о дальнейшем образовании АФК под воздействием рибофлавина при облучении светом внутри опухоли. В случае контрольной мыши без введения рибофлавина при облучении света увеличение сигнала не происходило. Настоящий эксперимент демонстрирует, что с помощью данного метода возможно определение АФК при действии лекарственного препарата в режиме реального времени in vivo. Таким образом, возможно определение влияние различных препаратов на образование АФК и проверка их дальнейшей эффективности. 5) Полученные данные показали, что среда внутри опухоли имеет более низкие значения рН по сравнению с нормальной тканью. При этом уровень кислотности выше в глубоких слоях опухоли, чем в поверхностных. Кроме того, было выявлено, что уровень кислотности в опухоли может отличаться как от опухоли к опухоли, так и внутри одной опухоли в зависимости от конкретной зоны. Таким образом, разработанный электрохимический метод определения pH в заданной точке ткани животного позволяет оценить уровень кислотности в опухоли в режиме реального времени в животном. 6) Показано, что с помощью данного электрохимического метода возможно определять концентрацию О2 и АФК в заданной точке опухоли в режиме реального времени в живом животном и строить профили распределения в зависимости от расстояния до поверхности опухоли. Полученные данные свидетельствуют о снижении уровня кислорода и повышении содержания активных форм кислорода по мере проникновения вглубь опухоли. Эти результаты могут быть использованы в дальнейшем при разработке лекарственных препаратов, направленных на регулирование концентрации АФК в опухоли, которая играет важную роль в запуске тех или иных сигнальных путей. Кроме того, высокая чувствительность описываемого метода и локальность измерений, обеспечиваемая им, позволят наблюдать за уровнем кислорода и АФК в определенных участках опухоли. 7) В ходе выполнения работ были опубликованы 2 статьи в журнале FEBS OPEN BIO с пятилетним импакт-фактором 2.076.

Публикации

1. Акасов Р.А., Шолина Н.В., Хоченков Д.А., Алова А.В., Горелкин П.В., Ерофеев А.С., Генералова А.Н., Хайдуков Е.В. Photodynamic therapy of melanoma by blue- light photoactivation of flavin mononucleotide Scientific Reports, - (год публикации - 2019)

2. А. Ерофеев, П. Горелкин, А. Гаранина, А. Алова, Ю. Корчев, А. Мажуга Smart nanopipette for single cell analysis FEBS OPEN BIO, 8, 480 - 481 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12453

3. П. Горелкин, А. Ерофеев, А. Алова, А. Мажуга, А. Гаранина, П. Новак, А. Шевчук, К. Эдвардс, Ю. Корчев Nanopipette navigation system as a new tool for nanoscale investigation of living cells FEBS OPEN BIO, 8, 480 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12453

Возможность практического использования результатов
В дальнейшем результаты проекта могут применяться в научных лабораториях, онкологических центрах, в R&D отделах фармацевтических компаний для экспресс-оценки эффективности новых синтезированных противораковых лекарств. Полученные результаты могут применяться при проведении дальнейших доклинических исследований лекарственных препаратов. Набор таких параметров, как концентрация активных форм кислорода (АФК), степень закисления (pH) и уровень внеклеточного кислорода, позволит осуществлять 3D идентификацию распространения опухоли. С помощью разработанного метода возможно малоинвазивное зондирование поверхности и глубина прорастания опухоли. Диагностика меланомы и стадии ее развития может осуществляться на первичном приеме у врача путем использования одноразового сенсора. Высокотехнологичная диагностика меланомы на ранних стадиях может существенно сократит издержки государственного здравоохранения, а также повысить продолжительность жизни населения.