Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Анализ мировой литературы свидетельствует об активном развитии направления изучения и выделения биологически активных веществ животного и растительного происхождения. Особенно интенсивно изучаются в последнем десятилетии вещества с антимикробной направленностью действия (АМП и некоторые белки млекопитающих), о существовании которых известно уже более 60 лет, ввиду острой необходимости поиска альтернативных подходов для борьбы с динамично приобретающими резистентность микроорганизмами. Согласно литературным источникам, большинство изученных АМП млекопитающих были выделены из нейтрофильных гранулоцитов, однако они также были обнаружены в тонком кишечнике, языке, миелоидных и эпителиальных клетках, хоть и в меньшем количестве. Это позволяет рассматривать не только гранулярный аппарат как основной источник антимикробных веществ, но и ткани пограничных зон млекопитающих, в том числе и сельскохозяйственных животных, которые ввиду интенсивного контакта с широким спектром разнообразных биологических агентов (патогенные и оппортунистические микроорганизмы, вирусы, грибы), которые могут содержать набор веществ с антимикробной направленностью действия. Еще одним важным аспектом является "упаковка" АМП в препропептидную молекулу до активации, поэтому целесообразно рассмотреть возможность применения энзиматической обработки для высвобождения АМП. В качестве объектов исследования были отобраны говяжьи слизистые оболочки языка и гортани, подчелюстные слюнные и лимфатические железы, слизистые оболочки носовой и ротовой полостей, прямой кишки, свиные слизистые оболочки гортани, языка, губной и носовой полостей, прямой кишки, подъязычные слюнные железы. Исследование природных антиоксидантных веществ с перспективой их использования в различных прикладных аспектах также весьма актуально. В многочисленных публикациях освещено богатство и разнообразие набора антиоксидантов как компонентов растительного сырья, причем их состав значительно варьируется в зависимости от локализации в самом источнике, климатических и географических условий произрастания, способа последующей технологической обработки. Для исследования антиокислительных свойств был отобран 28 образцов трав, ягод и специй, которые помимо высокой антиокислительной емкости в соответствии с литературными данными, способствуют улучшению вкусовых качеств пищевых продуктов. Наибольшее содержание фенольных соединений в исследуемом растительном было отмечено в ягоде и листе черной смородине, тимьяне, перечной мяте, шелухе лука, гвоздике, розмарине, корице и базилике. Методом ORAC было установлено, что спиртовые экстракты растительного сырья по сравнению с водными проявляли наибольшую активность к пероксильным радикалам, а результаты определения антиокислительной активности методом хемилюминесценции, который позволяет определять общее количество радикалов, которое связывают антиоксиданты в образце (общую антиоксидантную емкость, ОАЕ), коррелировали с содержанием фенольных соединений и показали, что для большего числа отобранных образцов предпочтительна либо водная экстракция, либо принципиальной разницы нет (розмарин, лист черной смородины, перечная мята, гвоздика, корица, базилик, тимьян), только для ягоды черной смородины и шелухи лука предпочтительной является спиртовая экстракция. Наибольшая вариабельность состава наблюдалась у свежей ягоды облепихи и розмарина, наименьшая - у чеснока, гвоздики и черного перца. В исследованных говяжьих и свиных образцах было обнаружено множество гистонов разных типов, которые сами обладают антимикробной активностью и могут вносить большой вклад в образование пептидов. В говяжьих образцах были идентифицированы H2BC, HIST1H2BD, HIST2H2AC, HIST1H2AH, histone H3.3 и H2bl-like, HIST2H2ACи histone H3.3, смесь HIST1H2AJ, HIST2H2BE и histone H2A type 2-C, в свиных - H2B type 1-like, HIST1H2BB, HIST1H2BB, HIST1H2BB,H2B ½ , H2B type 1-N и HIST1H2BB, наибольшее количество гистонов было идентифицировано в слизистой прямой кишки. Был также идентифицирован белок S100-A12, который наиболее выраженно присутствует в говяжьих слизистой ротовой полости и языка и свиных слизистых гортани и языка. Его активность связана с продукцией хемо - и цитокинов, он участвует в антимикробном гуморальном иммунном ответе опосредованном антимикробными пептидами и в этой роли слизистые могут являться важным источником таких пептидов. Фракции белка AGR2 были идентифицированы в слизистых ротовой полости, носовой и гортани, слюнной железе и прямой кишке. Этот белок требуется для MUC2 посттранскрипционного синтеза и секреции, играет роль в производстве слизи, миграции, дифференциации и росте клеток, а также способствует их адгезии. Обычно он представлен в незначительном количестве, но в слизистых тканях он представлен в значимых количествах, и может являться важным источником получения активных биопептидов. Также в исследуемых говяжьих тканях присутствовали фракции тяжелой цепи γ-иммуноглобулинов и выявлялись агрегаты легких цепей иммуноглобулинов. Были идентифицированы 3 фракции секретоглобина, различающиеся по pI и представленные в большом количестве, и одорант-связывающий белок. В свиных слизистых оболочках языка и прямой кишки был идентифицирован лизоцим С. Интересным было обнаружение в области α и β гемоглобинов появление массивного количества ряда фракций белков, идентифицированных как цистатин С в слюнных железах, эти же белки обнаруживались и в других образцах, но в меньшем количестве и чаще поодиночке. Еще один представитель семейства цистатинов (цистатин В) как тканеспецифичный при отсутствии других форм, а также галектины 4 и 7 обнаружены в умеренном количестве в ткани слизистой языка. Анализ пептидного профиля образцов животного происхождения также показал высокую специфичность исследуемого сырья в сравнении с соответствующей мышечной тканью, причем ткани свиней характеризовались большим разнообразием. Среди тканей КРС наибольшее содержание тканеспецифичных пептидов наблюдалось в слизистой ротовой полости (77), свиней – в слизистых носовой полости (178), прямой кишки (150) и гортани (166) В рамках скрининга диск-диффузионным методом относительно Еscherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и Klebsiella pneumoniae была подтверждена нецелесообразность использования солевых растворов, в качестве экстрагента использовался раствор уксусной кислоты. Было также показано, что стадия УФ не приводила к потере активности исследуемых образцов. Микробиологическим методом было установлено, что лишь слизистая свиных губ обладала бактерицидным действием по отношению к Staphylococcus aureus, что, возможно, было связано низкой концентрацией образцов по отношению к культуре. Предположение подтверждалось луночным методом, при выполнении которого соотношение образцов и культуры еще меньше, активности выявлено не было. Определение антимикробного действия по отношению к Listeria monocytogenes нативных образцов и обработанных трипсином показало, что наибольшей активностью обладали говяжьи слизистые прямой кишки и ротовой полости, свиные слизистая губ и подъязычные слюнные железы. Обработка трипсином в отношении половины образцов приводила к увеличению активности, на некоторые не оказывала влияние, а в отношении образца прямой кишки КРС - напротив, снижала. Наибольшей активностью по отношению к Pseudomonas aeruginosa обладали образцы слизистых языка и носовой полости КРС, доля выживших клеток снижалась до 22,0%. В отношении говяжьих слизистых прямой кишки и ротовой полости, подчелюстных лимфатических узлов, свиных слизистых гортани, языка, губ и прямой кишки наблюдалось увеличение количества клеток в некоторых случаях практически в 2 раза, однако в этих же образцах отмечалось наличие сохранившихся мертвых клеток, величина которых достигала 40% от всех клеток. Предположительно, это наблюдение связано с тем, что АМП «упакованы» в белковую молекулу, которая может использоваться микроорганизмами изначально как субстрат, а при высвобождении оказывать антимикробное действие. Отмеченное наблюдение подтверждалось тем, что в ультрафильтратах такого эффекта не наблюдалось. Наибольшее антимикробное действие по отношению к Staphylococcus aureus нативных проявляли слизистая носовой полости КРС и свиных губ, доля выживших клеток не превышала 10%, увеличение количества клеток более чем в 1,5 раза наблюдалось при инкубировании культуры с экстрактом свиной прямой кишки, однако в этом образце отмечалось аналогичное наблюдение, что и в отношении Pseudomonas aeruginosa: доля сохранившихся мертвых клеток достигала 46,5% от всех клеток. Стоит отметить, что исследуемые образцы были наиболее активны в отношении грамположительных бактерий. По завершении первого года реализации проекта наиболее перспективным представляются говяжьи слизистые оболочки языка и носовой полости, свиная слизистая оболочка губ . Интересным также является наблюдения, обнаруженные в отношении говяжьих подчелюстных лимфатических узлов и свиной слизистой прямой кишки: в связи с выявленным наблюдением «распаковки» АМП из высокомолекулярной белковой молекулы культурой или трипсином, в следующем году реализации проекта планируется подробнее рассмотреть целесообразность удаления высокомолекулярных веществ из экстрактов, а также эффекты, наблюдаемые при энзиматической обработке.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Биологически активные вещества животного и растительного происхождения активно изучаются уже множество лет. Веществам с антимикробной направленностью действия, о существовании которых известно уже более 60 лет, пророчат будущее как альтернативе антибиотикам особенно в условиях роста резистентности патогенных микроорганизмов. Эти аспекты позволяют рассматривать антимикробные вещества как инструмент для увеличения срока годности пищевой продукции за счет ингибирования микробиологической порчи. Исследование природных антиоксидантных веществ с перспективой их использования в различных прикладных аспектах также весьма актуально ввиду возможности их использования для снижения процессов перекисного окисления. В многочисленных публикациях освещено богатство и разнообразие набора антиоксидантов как компонентов растительного сырья, показано их применение как в качестве функциональных добавок, так и освещен их потенциал ингибировать окисление белков и липидов в готовом продукте. Очевидно, что разработка комплексных смесей на основе указанных классов веществ позволит подойти к способам продления срока пищевой продукции системно, учитывая как микробиологическую, так и органолептическую составляющие порчи. Проанализированные данные позволяют рассматривать слизистые оболочки пограничных зон сельскохозяйственных животных, которые ввиду интенсивного контакта с широким спектром разнообразных биологических агентов (патогенные и оппортунистические микроорганизмы, вирусы, грибы), могут содержать набор веществ с антимикробной направленностью действия, поэтому в качестве источников антимикробных веществ были использованы слизистые оболочки крупного рогатого скота – языка и гортани, носовой и ротовой полостей, прямой кишки, а также подчелюстные слюнные и лимфатические железы, свиные слизистые оболочки – гортани, языка, губной и носовой полостей, прямой кишки и подъязычные слюнные железы. На втором этапе исследований было решено повысить концентрации бактериальных культур до N*10^7 кл/мл вместо N*10^6 кл/мл, также концентрация Staphylococcus aureus во всех случаях была выше в более чем 2 раза по сравнению с Pseudomonas aeruginosa, так как ранее было выявлено, что активность объектов исследования в отношении грамположительных бактерий выше. Антимикробная активность образцов исследовалась в короткосрочном (3,5-4 часа) и долгосрочном (20 часов) периодах инкубации с бактериальной культурой. При изучении антимикробной активности нативных образцов по отношению к Pseudomonas aeruginosa была увеличена дозировка вносимых образцов до 20 мкл в обоих периодах инкубации, при изучении антимикробной активности нативных образцов по отношению к Staphylococcus aureus дозировка была увеличена только в долгосрочном периоде инкубации. В большинстве случаев, увеличение количества вносимых образцов хватало для проявления высокой антимикробной активности в отношении Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus в условиях увеличения концентрации бактериальных клеток. Наибольшая активность, так же как и в экспериментах 2017-2018 гг., была выявлена в отношении грамположительных бактерий. В долгосрочном периоде наибольшую активность в отношении Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus проявляли экстракты слюнных желез и лимфатических узлов, слизистых носовой полости и прямой кишки КРС, а также слизистых прямой кишки и слюнных желез свиней. Обнаружено, что значительное увеличение концентрации Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa по сравнению с данными периода 2017-2018 гг. не приводило к существенному снижению активности ультрафильтратов, за исключением ультрафильтратов экстрактов слизистых языка, гортани и прямой кишки крупного рогатого скота, слюнных желез свиней в случае эксперимента с Pseudomonas aeruginosa. Подтвердилась целесообразность применения ультрафильтрации, показанная ранее в предыдущем отчетном периоде. Тем не менее, этого же эффекта возможно добиться увеличением дозы вносимых нативных экстрактов в бактериальную культуру, за исключением ультрафильтратов образцов слизистой ротовой полости крупного рогатого скота, слизистых оболочках гортани, языка и носовой полости свиней, которые даже в сниженном в 2 раза количестве (по сравнению с дозой нативных образцов) проявляли большую активность к Pseudomonas aeruginosa в долгосрочном периоде инкубации. При изучении влияния энзиматической обработки по истечении долгосрочной инкубации было выявлено, что все исследуемые образцы, обработанные трипсином, проявляли антимикробную активность по отношению к Staphylococcus aureus, кроме слизистой языка свиньи, который, напротив, в краткосрочной инкубации показал наибольшую активность. После долгосрочной инкубации, активность по отношению к Pseudomonas aeruginosa сохранили лишь гидролизаты слизистых языка и ротовой полости крупного рогатого скота, слизистых языка, носовой полости и прямой кишки свиньи, причем нативные экстракты слизистых ротовой и носовой полостей, языка свиней не проявляли при длительной инкубации. Практически все образцы, обработанные коллагеназой, в короткосрочном периоде инкубации проявляли антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, за исключением лимфатических узлов крупного рогатого скота, где все же доля мертвых клеток была высока и составляла 24,52%. Ситуация значительно изменилась после долгосрочной инкубации, активность сохранили лишь гидролизаты свиных слизистой гортани и слюнных желез, однако в образцах гидролизатов слизистых носовой полости, прямой кишки и ротовой полости крупногорогатого скота наблюдалось высокое количество мертвых клеток, которое превышало 29%. Показано, что по истечении 3,5 часов инкубации по отношению к Pseudomonas aeruginosa активность проявляли все гидролизаты, даже несмотря на то, что дозировка гидролизатов по сравнению с нативными образцами была в 2 раза ниже: количество живых клеток по сравнению с положительным контролем редко выходила за пределы 49% и колебалась в диапазоне 23%-49%. После долгосрочной инкубации активность сохранили все образцы. Большинство образцов, обработанных эластазой, не проявляли высокую антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, ситуация значительно изменилась после долгосрочной инкубации, активность проявили все гидролизаты, доля живых клеток по отношению к положительному контролю колебалась 47%-74%, наблюдалось высокое количество мертвых клеток, которое находилось в диапазоне 20%-30%. По отношению к Pseudomonas aeruginosa активность проявляли все гидролизаты, даже несмотря на то, что дозировка гидролизатов по сравнению с нативными образцами была в 2 раза ниже, количество живых клеток по сравнению с положительным контролем редко выходила за пределы 50% и колебалась в диапазоне 27%-56%. После долгосрочной инкубации активность сохранили все образцы. Таким образом, подтвердилась целесообразность применения энзиматической обработки, показанная ранее в работах предыдущего отчетного периода. Тем не менее, этого же эффекта, как и в случае с ультрафильтратами, возможно добиться увеличением дозы вносимых нативных экстрактов в бактериальную культуру, за исключением гидролизатов образцов слизистой ротовой полости крупного рогатого скота, слизистых оболочек гортани, языка, губ и носовой полости свиней, которые даже в уменьшенном в 2 раза количестве по сравнению с дозой нативных образцов проявляли большую активность к Pseudomonas aeruginosa в короткосрочном и долгосрочном периодах инкубации с коллагеназными и эластазными гидролизатами. Также показана большая активность трипсиновых гидролизатов в отношении грамположительных бактерий, коллагеназных и эластазных – в отношении грамотрицательных. В соответствии с критерием отбора (интенсивность антимикробной активности (через 3,5-4 часа инкубации) и ее стабильность во времени (по истечении 20-ти часовой инкубации)) были выбраны для составления комплексных композиций нативные экстракты слизистой прямой кишки крупного рогатого скота, свиных слизистых языка губ и прямой кишки, ультрафильтраты экстрактов слизистых носовой и ротовой полостей крупного рогатого скота, свиной прямой кишки, трипсиновые гидролизаты слизистой ротовой полости крупного рогатого скота, свиных слизистых языка и носовой полости, коллагеназные гидролизаты слизистой гортани крупного рогатого скота, свиных слизистых гортани и слюнные железы, эластазные гидролизаты слизистой гортани и слюнные железы крупного рогатого скота, свиных слизистых языка и прямой кишки. Среди растительных источников была выбрана шелуха лука, в качестве экстрагента использовали воду, так как спиртовые экстракты могут вызвать денатурацию биологически активных веществ животного происхождения. Показано, что водный экстракт шелухи лука вызывает гибель Staphylococcus aureus и не влияет на Pseudomonas aeruginosa, рабочее же разведение (4 части буфера и 1 часть растительного) не вызывало гибель клеток, но при этом сохраняло антиоксидантную активность, равную 1569,52 (ORAC) и 1166,28 (ХЛ) мкмоль эквTrolox /л. По истечении 4 часов инкубации наибольшая антимикробная активность по отношению к Staphylococcus aureus была отмечена у комплексных композиций водного экстракта шелухи лука с нативным экстрактом свиной слизистой губ, коллагеназным гидролизатом свиных слюнных желез и эластазным гидролизатом говяжьих слюнных желез, количество живых клеток по отношению к контролю составило 25,94%, 48,96% и 18,17%, соответственно. После долгосрочной инкубации активность сохранилась у комплексных композиций водного экстракта шелухи лука с нативным экстрактом свиной слизистой губ и коллагеназным гидролизатом свиных слюнных желез, количество живых клеток по отношению к контролю составило 24,22% и 51,27%, соответственно. После короткосрочной инкубации по отношению к Pseudomonas aeruginosa наибольшую активность проявляли комплексные композиции водного экстракта шелухи лука с нативным экстрактом слизистой прямой кишки крупного рогатого скота, свиной слизистой прямой кишки, ультрафильтратами экстрактов слизистых носовой и ротовой полостей крупного рогатого скота, свиной прямой кишки и коллагеназным гидролизатом свиных слюнных желез, количество живых клеток по отношению к контролю не превышало 15%. После длительной инкубации активность сохранилась у всех отмеченных комплексных композиций, количество живых клеток по отношению к контролю не превышало 11%. Очевидно, что большая активность комплексных композиций по отношению к Pseudomonas aeruginosa связана с меньшей концентрацией вносимой культуры практически в 3,5 раза по сравнению с Staphylococcus aureus, по отношению к которой, тем не менее все же эффективно проявили себя комплексные композиции водного экстракта шелухи лука с нативным экстрактом свиной слизистой губ и коллагеназным гидролизатом свиных слюнных желез, причем последний был также максимально активен и по отношению к Pseudomonas aeruginosa, а первый, напротив, был единственным, который не проявил активности. Согласно результатам определения антиокислительной емкости комплексных смесей по методам ORAC и хемилюминесценции антиокислительная емкость сохранялась у всех образцов высокой и колебалась в диапазоне 902-2458 и 700-1350 мкмоль эквTrolox /л, соответственно. Таким образом, показана целесообразность технологической обработки – ультрафильтрации и энзиматического гидролиза, отобраны 7 перспективных комплексных смесей, проявляющих высокую антимикробную активность с условием сохранения адекватной антиоксидантной емкости. Некоторые результаты работ были освещены в сети Интернет https://iz.ru/816615/mariia-nediuk/sekretnye-biomaterialy-uchenye-obnaruzhili-na-slizistykh-obolochkakh-svinei-antimikrobnye