Аннотация результатов, полученных в 2017 году
На первом этапе выполнения работ был проведен анализ эффектов совместной инокуляции в многокомпонентной системе на ранних стадиях. При анализе экспрессии генов, являющихся маркерами ранних этапов развития симбиозов растений гороха с ризобиями (Sym10, Sym37 и NIN) и грибами АМ (Lyr3, Lyr4, NSP2 и DELLA3), установлено, что растение эффективно различает сигналы эндосимбионтов, вероятно, не конкурирующих на этой стадии. При анализе экспрессии генов, активирующихся в процессе развития инфекционного процесса у гороха при развитии клубеньков (Enod5, Lyk10, IPD3 и Lyk8), было выявлено увеличение экспрессии этих генов только в варианте с моноинокуляцией ризобиями. Однако уровень экспрессии выбранных для анализа генов не увеличивался или был снижен в вариантах с двойной и тройной инокуляцией. Вероятно, при совместной инокуляции несколькими эндосимбионтами между ними возникает конкуренция, что приводит к задержке развития инфекции растений ризобиями. При анализе уровней экспрессии генов, кодирующих PR белки, было показано, что их экспрессия не активируется спустя 48 часов после инокуляции растений гороха дикого типа штаммами PGPR A. mysorens 7 и R. leguminosarum 1026, что, вероятно, связано с негативной регуляцией уровня их экспрессии пероксидом водорода, повышение концентрации которого косвенно подтверждается повышением экспрессии гена, кодирующего пероксидазу. В то же время присутствие микоризного гриба значительно повышало уровень экспрессии генов, кодирующих PR белки. Отсутствие повышения уровня экспрессии генов, кодирующих полиамины, может свидетельствовать о их роли на поздних стадиях развития клубеньков. Характеристика полного разнообразия последовательностей NCR-пептидов позволила выявить потенциальные кандидаты на роль ключевых сигнальных молекул, стимулирующих дифференцировку клубеньковых бактерий в симбиотические формы, а также контролирующих популяцию бактерий внутри клубенька. Важность уникальных белков для протекания симбиоза подтверждается данными их экспрессии. В дальнейшем предполагается изучение физико-химических показателей этих NCR для определения наиболее перспективных NCR-пептидов, являющихся ключевыми для развития и функционирования клубеньков. Анализ экспрессии генов растения и бактерии в клубеньках линии гороха P61 (sym25) показал, что взаимодействие как с растениями дикого типа, так и с мутантными, приводит к одинаковому изменению экспрессии обширной группы генов бактерий, отвечающих за успешное развитие симбиоза. При этом у штамма RCAM1026 (супрессирующего мутантный фенотип) активируется значительная группа уникальных генов, кодирующих общие белки ответа на стресс и специфические ферменты, принадлежащие ко многим метаболическим путям. Данная информация дает возможность предполагать возможные метаболические последствия мутации растения-хозяина для симбиотических бактерий. Сравнение уровней экспрессии генов растения между клубеньками линий Frisson (исходная линия «дикого типа») и P61 (sym25) при взаимодействии с исследованными штаммами показало, что разные штаммы бактерий оказывают различное влияние на профили экспрессии хозяйских генов. Ни в одном из вариантов не происходит значимого повышения экспрессии генов, ответственных за защитные реакции растения. Функция Sym25 неизвестна, однако, по предположениям, он может быть связан с синтезом или транспортом некоторого метаболита, необходимого клубеньковым бактериям для нормального функционирования в форме бактероида. Штаммы бактерий, способные синтезировать или активно транспортировать такой метаболит, могут демонстрировать супрессорный фенотип. Показано, что в клубеньках гороха дикого типа пероксид водорода ассоциирован с инфекционными структурами (инфекционными нитями и каплями), а также со стареющими бактероидами. В то же время в неэффективных мутантах гороха наблюдалось аномальное распределение пероксида водорода (в том числе вокруг ювенильных бактероидов), что, очевидно, связано активацией в этих мутантах сильных защитных реакций. Установлено, что сниженный уровень активации KNOX5 и BEL1-2 у мутанта la, cry свидетельствует о возможном взаимодействии DELLA белков с транскрипционными факторами, контролирующими биосинтез цитокининов при симбиозе. Таким образом, на первом этапе выполнения проекта было исследовано влияние совместной инокуляции в многокомпонентной системе (растение – клубеньковые бактерии – грибы арбускулярной микоризы – рост-стимулирующие бактерии) на ранних стадиях формирования и функционирования симбиозов на экспрессию растительных генов. Также был проведен детальный анализ развития защитных реакций растения как фактора совместимости различных симбионтов в многокомпонентной системе.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Исследована динамика изменения экспрессии генов в корнях растений «дикого типа» Frisson посредством секвенирования транскриптома при помощи 3’MACE. Был проведен анализ эффектов совместной инокуляции в многокомпонентной системе на ранних и поздних стадиях развития симбиозов. В результате идентифицированы группы генов, активирующихся/подавляемых при воздействии различных типов симбионтов в различных комбинациях, а также конкретные гены, экспрессия которых изменяется под влиянием одиночной и двойной инокуляции. Также определена эффективность одиночной, двойной или множественной инокуляции в условиях вегетационного опыта. Микоризация, в соответствии с данными предыдущего эксперимента, имела наиболее выраженное влияние на экспрессию генов, вне зависимости от других факторов. Большее число генов значимо менялись во всех пробах при взаимодействии с клубеньковыми бактериями. Были идентифицированы группы генов, усиливающих свою экспрессию при двойной инокуляции ризобиями и арбускулярно-микоризными грибами. Два гена из этой группы функционально аннотированы как гены-переносчики минеральных веществ. На основании анализа маркеров развития симбиоза с ризобиями и грибами АМ было показано, что наиболее существенное увеличение экспрессии генов наблюдали в вариантах с двойной и тройной совместной инокуляцией, что свидетельствовало об аддитивном эффекте. Таким образом, при совместной инокуляции оба симбионта развиваются более эффективно, чем при моноинокуляции. При анализе экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы KNOX3 и BELL1, влияющих на биосинтез цитокининов при двух типах симбиозов, показано увеличение экспрессии KNOX3 в вариантах с двойной и тройной инокуляцией по сравнению с моноинокуляцией ризобиями и грибами АМ. Аддитивный эффект при двойной и тройной инокуляции свидетельствует о том, что одновременное внесение симбионтов может иметь положительный эффект на увеличение уровня цитокининов в растении. Были выявлены закономерности системной регуляции развития разных типов симбиозов, а также многокомпонентной системы с участием транскрипционных факторов семейств WOX, регуляторных пептидов CLE и рецепторов CLAVATA. Показано, что у мутантов sym28 и sym29 на фоне увеличения ризобиальной инфекции и повышенного клубенькообразования, наблюдается снижение способности формировать симбиоз с грибами АМ и взаимодействовать с A. mysorens 7. Следовательно, нарушение системного контроля при ризобиальном симбиозе может оказывать негативный эффект на совместную инокуляцию с грибами АМ и A. mysorens 7. Была показана способность к взаимодействию DELLA-белков с транскрипционными факторами KNOX3 и BELL1. Это свидетельствовало о том, что при симбиозе DELLA-белки активируют сборку этих транскрипционных факторов, влияющих на биосинтез цитокининов в процессе формирования симбиоза. У мутантов sym28 и sym29 с нарушенной системой авторегуляции и, предположительно, со сниженным уровнем активации защитных реакций, был изучен профиль экспрессии генов в надземной (листья и стебли) и подземной (корневая система) частей растений при помощи 3’MACE на сроках 2 и 4 недели после инокуляции грибами арбускулярной микоризы, клубеньковыми бактериями и PGPR в различных комбинациях. В результате было показано, что мутация в гене Sym29 приводит к более активной экспрессии симбиотических генов при инокуляции АМ грибами, чем при моно-инокуляции. Данный эффект может быть связан с положительным действием АМ грибов на растения, у которых нарушена авторегуляция и которые вследствие этого образуют излишнее количество клубеньков. Действие же микоризы сглаживает негативный эффект, поскольку не позволяет образоваться большому числу клубеньков из-за локальной регуляции. Кроме того, было показано действие обработки PGPR на экспрессию генов у мутанта по гену sym28, что позволяет связать систему авторегуляции клубенькообразования и действие PGPR в единую схему, направленное улучшение отдельных звеньев которой позволит повысить эффективность формирующихся симбиозов. Кроме того, была изучена активация процессов старения (проанализирован уровень экспрессии генов PsCyp15a, PsTPP, PsATB2, PsGA2ox PsAO3) в растениях дикого типа и мутантах по генам sym28 и sym29 при формировании симбиотических ассоциаций различного типа. Было показано, что старение активируется во всех проанализированных вариантах. Также была проанализирована активация защитных реакций (проанализирован уровень экспрессии генов PsPR1, PsPR10, Ps7RA84, PAL1, PAL2) и показано, что максимальная активация наблюдается в вариантах с инокуляцией грибом арбускулярной микоризы. Был проведен цитохимический анализ тиолов и тиол-дисульфидного статуса белков и иммунолокализация глутатион редуктазы с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Показан максимальный уровень тиолов и локализация глутатион редуктазы в клетках меристемы и зоны азотфиксации. С использованием ингибитора синтеза (гомо)глутатиона была подтверждена важная роль (гомо)глутатиона в развитии и функционирование эффективных симбиотических клубеньков, поскольку в обработанных ингибитором растениях клубеньки характеризовались ранней деградацией инфицированных клеток. Также, при помощи секвенирования транскриптома развивающихся клубеньков на последовательных стадиях развития, были выявлены группы NCR-генов, демонстрирующих согласованную экспрессию (так называемые экспрессионные «волны») по мере развития клубеньков. Данный материал был также использован для идентификации фрагментов коэкспрессионных генных сетей, участниками которых являются гены NCR-пептидов, при помощи анализа транскриптома развивающихся клубеньков мутанта по гену sym31 (Sprint-2Fix-), демонстрирующих отсутствие дифференцировки бактероидов, на последовательных стадиях развития. В результате был выявлен ген транскрипционного фактора семейства ARF, предположительно регулирующего экспрессию генов NCR-пептидов.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе вегетационного эксперимента 2019 года была получена вторая повторность данных о динамике изменения экспрессии генов в корнях растений «дикого типа» Frisson посредством секвенирования транскриптома при помощи 3’MACE. В результате были идентифицированы группы генов, активирующихся/подавляемых при воздействии различных типов симбионтов в различных комбинациях, а также маркерные гены, профиль экспрессии которых соответствует успешному развитию многокомпонентной системы. Одним из маркерных генов оказался хорошо известный ген транскрипционного фактора RAM2, специфичного для микоризации; другие гены включают в себя ген PS_0003816, кодирующий гермин-подобный белок, ген глутатион S-трансферазы PS_0021302, и двух генов с неизвестной функцией. Был также обнаружен ген PS_0029785, кодирующий LRR белок, возможно связанный с взаимодействием с неризобиальной почвенной микрофлорой (PGPR). Показано, что различные варианты двойной инокуляции (ризобии + A. mysorens 7 и ризобии + R. irregularis BEG144) вызывают различные изменения экспрессии генов, что свидетельствует о независимых механизмах, лежащих в основе положительного влияния комбинаций микроорганизмов. Эффект от множественной инокуляции проявляется в явном виде за счет взаимодействия между двумя симбионтами (грибами и ризобиями, а также ризобиями и A. mysorens 7), и подавляется при добавлении в систему третьего микросимбионта. После окончания вегетации был проведен анализ биомассы и элементного состава надземных частей растений сорта Frisson. Суммирование данных по трем вегетационным домикам позволило выявить эффекты, идентичные наблюдаемым в первой повторности (2018 года): положительное влияние двойной инокуляции и превосходство ее над одиночной и тройной в отношении ростовых параметров, а также содержания азота и фосфора в семенах растений сорта Frisson. Была установлена нелинейная обратная корреляция между биомассой семян в контроле и прибавкой этого параметра при обработке микросимбионтами. В практическом плане это означает, что положительный эффект инокуляции проявляется именно в неоптимальных условиях, а в оптимальных условиях растения как без инокуляции, так и при инокуляции реализуют максимум своей нормы реакции. Это указывает на целесообразность применения микробиологических препаратов для того, чтобы сгладить воздействие окружающей среды в тех случаях, когда оно является негативным. В качестве маркеров развития симбиоза с грибами АМ были использованы гены GST, TI, AJ308164 и PT4, кодирующие глутатион-трансферазу, ингибитор трипсина, протеинфосфатазу и переносчик фосфата. Анализ показал существенное увеличение экспрессии генов GST, TI, AJ308164 и PT4 в вариантах с двойной и тройной инокуляцией, где присутствовал гриб R. irregularis BEG144 на сроке 4 недели после инокуляции. Однако, если в случае сорта Triumph значительной разницы между вариантом двойной (ризобии + R. irregularis BEG144) и тройной инокуляции (ризобии + R. irregularis BEG144 + A. mysorens 7) по экспрессии маркеров выявлено не было, то у сорта Frisson наиболее существенное увеличение экспрессии генов GST, TI, AJ308164 и PT4 наблюдали в варианте с тройной инокуляцией (при внесении ризобий, грибов АМ и A. mysorens 7), что свидетельствовало о стимулирующем эффекте бактерий на развитие микоризы. Таким образом, при совместной инокуляции с ризобиями и рост-стимулирующими бактериями грибы R. irregularis могут развиваться более эффективно, чем при моноинокуляции. Однако проявление этого эффекта может зависеть от сорта растений. Сходные результаты были получены и при анализе маркеров, которые активируются при инокуляции растений гороха ризобиями. Анализ показал, что во всех вариантах двойной и тройной инокуляции у сорта гороха Frisson наблюдается увеличение уровня экспрессии генов Sym37, Enod5, Sym10, NIN, а также LYK10, кодирующих основные регуляторы развития симбиоза с ризобиями, на сроке 4 недели после инокуляции. Вместе с тем, у растений сорта Triumph уровень экспрессии этих генов был высоким как в варианте с моноинокуляцией ризобиями, так и в вариантах с совместной инокуляцией ризобиями и штаммом A. mysorens 7, ризобиями и грибом АМ, а также при тройной инокуляции. Следовательно, при развитии многокомпонентной системы ризобии не испытывают существенной конкуренции со стороны грибов АМ и A. mysorens 7. Однако эффективность развития ризобий в многокомпонентной системе может зависеть от сорта растений, использованных для инокуляции. Таким образом, проведение анализа серии выявленных нами маркерных генов, профиль экспрессии которых соответствует успешному развитию многокомпонентной системы, может быть удобным для оценки эффективности взаимодействий. В связи с тем, что цитокинины оказывают положительное влияние на развитие бобово-ризобиального симбиоза и симбиоза с грибами АМ, мы предположили, что оценка уровня содержания этих гормонов может быть одним из маркеров эффективности развития симбиозов не только при моно-инокуляции, но и при комбинированной инокуляции. Действительно, в корнях гороха при двойной инокуляции клубеньковыми бактериями и грибами АМ, а также при тройной инокуляции клубеньковыми бактериями, грибами АМ и бактериями A. mysorens 7 было выявлено существенное увеличение содержания активных форм цитокининов транс-зеатина (tZ) и 2-изопентениладенина (2-iP). Наиболее высоким содержание этих форм цитокининов было на сроке 2 недели после инокуляции. Следует отметить удобство оценки содержания активных форм цитокининов на сроке 2 недели при двойной инокуляции и тройной инокуляции, поскольку на этом сроке достаточно сложно найти молекулярные маркеры, по которым можно провести анализ эффективности совместной инокуляции. Таким образом, проведенный нами анализ впервые показал, что определение содержания транс-зеатина (tZ) и 2-изопентениладенина (2-iP) на сроке 2 недели после инокуляции может быть удобным показателем эффективности развития двойных и тройных симбиозов у гороха. Для оценки влияния гиббереллинов на растение было оценено возможное влияние транскрипционных факторов KNOX и BELL на метаболизм этих гормонов. Нам удалось показать, что KNOX3 транскрипционный фактор может влиять на распад гиббереллинов в растении. Это, вероятно, позволяет тонко регулировать уровень гиббереллинов на начальных этапах клубенькообразования. Показано, что у гороха основным путем синтеза путресцина, является аргининдекарбоксилазный путь. Экспрессия генов, вовлеченных в синтез полиаминов, снижается с увеличением возраста клубеньков у растений дикого типа, что свидетельствует о участии полиаминов в регуляции дифференцировки инфицированных клеток, а не процесса азотфиксации. Выявлена локализация диаминоксидазы в эффективных и неэффективных в клубеньках гороха. Исследования, проведенные со штаммами ризобий, дефицитными по синтезу полиаминов (спермидина) или его предшественника (аргинина), показали, что пероксид водорода, который важен для клубенькообразования и функционирования симбиотических клубеньков, имеет в основном бактериальное происхождение, а также показали множественность путей синтеза полиаминов, которые предполагают взаимозаменяемость субстратов для образования пероксида водорода. Была изучена активация процессов старения (проанализирован уровень экспрессии генов PsCyp15a, PsTPP, PsATB2, PsGA2ox PsAO3) в клубеньках растений сортов Frisson и Triumph при формировании симбиотических ассоциаций различного типа. Было показано, что вариантах с Rh. irregularis BEG144 у сорта Triumph проанализированные маркеры экспрессируются сильнее. Анализ уровней экспрессии генов PsPR1, PsPR10, Ps7RA84, PAL1, PAL2 показал, что они активируется в меньшей степени в варианте тройной инокуляции Rh. irregularis BEG144 + A.mysorens 7 + Rlv1026. Был продолжен анализ влияния системы CLAVATA на развитие многокомпонентной растительно-микробной системы: на основании РНК-секвенирования был описан набор регуляторных микроРНК, присутствующих в изучаемых тканях (надземной и подземной части) растений мутантов по генам sym28 и sym29, а также исходного генотипа Frisson. В результате анализа выявлено 443 микроРНК, из которых 398 относятся к консервативным последовательностям. 16 микроРНК характерны только для клубеньков, 9 были выявлены только в побегах и 26 характерны только для корней. Анализ деградома показал 1029 вероятную мишень выявленных микроРНК. Для ряда транскриптов показана регуляция более чем одной микроРНК. Показано также, что ряд микроРНК гороха участвуют в регуляции нескольких транскриптов. В ходе анализа экспрессии идентифицированных микроРНК и их генов-мишеней был выявлен ряд микроРНК, экспрессия которых меняется в зависимости от генотипа и варианта инокуляции. Сравнительный анализ экспрессии генов у трех генотипов позволил выявить разнонаправленную экспрессию в ответ на инокуляцию ризобиями и микоризными грибами последовательности, гомологичной ключевому транскрипционному регулятору развития клубеньков у люцерны MtNF-YA1. У линии P64, несущей мутацию в гене sym28, наблюдался сниженный уровень экспрессии данного гена по сравнению с линией P88, несущей мутацию в гене sym29. Таким образом, в ходе проведения исследований удалось установить ряд микроРНК, вовлеченных в ответ на инокуляцию различными микроорганизмами и предположительно вовлеченных в процессы авторегуляции клубенькообразования, контролируемые системой CLAVATA. Для дальнейшего исследования защитных реакций растений в ответ на множественную инокуляцию с применением методологии TILLING был отобран ряд мутантных семей, потенциально несущих мутации в ключевых генах, связанных с развитием симбиоза между горохом посевным и клубеньковыми бактериями. В частности, отобраны мутанты, несущие несинонимичные замены в последовательности гена Sym31, предположительно вовлеченного в контроль судьбы бактерий в клетках симбиотических клубеньков. Для оценки эффективности формируемых многокомпонентных растительно-микробных систем (МРМС) был использован материал, полученный при выращивании растений симбиотически активного сорта Triumph в условиях инокуляции различными комбинациями микросимбионтов в условиях вегетационных домиков ФГБНУ ВНИИСХМ. Аналогично эксперименту с сортом Frisson, было обнаружено позитивное влияние клубеньковых и рост-стимулирующих бактерий на растения сорта Triumph. Было установлено, что инокуляция клубеньковыми бактериями повышает его урожайность на 9,24% (при этом сохраняется тенденция к тому, что в благоприятных условиях эффект от инокуляции ниже, чем в неблагоприятных). Кроме того, Triumph показал отзывчивость на инокуляцию A. mysorens: как одиночная, так и двойная инокуляция (ризобии + A. mysorens) привела к повышению массы семян на 4,13% и 10,23%. Положительный эффект от микоризации проявился только в вегетационном домике 3, где условия не благоприятствовали накоплению биомассы семян. Таким образом, продемонстрировано, что различные генотипы гороха проявляют разную степень отзывчивости на инокуляцию, следовательно, для разных генотипов должны быть рекомендованы различные схемы инокуляции. В ходе транскриптомного анализа сорта Triumph были также выявлены маркерные гены, изменяющие экспрессию при взаимодействии с конкретными микросимбионтами во всех условиях на двух сроках. Среди генов, повышающих свою экспрессию, были обнаружены гены RAM2, и PS_0021302 (что характерно и для сорта Frisson), а также специфичные для Triumph гены PS_0002605, кодирующий супрессор субтилизина, и субтилизин протеазу (PS_0024400). Возможно, активация блокатора субтилизина и субтилизин-протеазы, специфичные для сорта Triumph, могут определять его симбиотическую отзывчивость. Таким образом, были идентифицированы группы генов, активирующихся/подавляемых при воздействии различных типов симбионтов в различных комбинациях сходным образом для двух генотипов, в том числе конкретные гены, экспрессия которых изменяется под влиянием двойной или множественной инокуляции. Кроме этого, выявлены гены, профиль экспрессии которых специфичен для высокоотзывчивого на симбиозы сорта Triumph.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За отчетный период был проведен анализ эффектов совместной инокуляции в многокомпонентной системе в динамике. В исследования были вовлечены 6 сортов гороха и 4 комбинации инокулянтов. Была проанализирована дифференциальная экспрессия маркерных генов, профиль экспрессии которых соответствует успешному развитию многокомпонентной системы. Проанализированные маркерные гены (PsCyp15a, PsTPP, PsATB2, PsGA2ox1, PsAO3), ассоциированные со старением клубенька, показали увеличение уровней экспрессии в корнях с клубеньками 4-х недельных растений сортов Finale и Sparkle по сравнению с 2-х недельными растениями. Для генов, кодирующих маркеры защитных реакций, были показаны различные паттерны экспрессии. Следует отметить, что у растений сорта Sparkle в варианте инокуляции Rh. irregularis BEG144 значительно увеличивались уровни экспрессии генов PsPR10 и PsPAL1 по сравнению с другими вариантами инокуляции, что было ассоциировано со снижением биомассы растений. В то же время вариант двойной инокуляции Rlv1026 + B.subtilis Ч13, оказавший позитивное воздействие на растения, приводил к снижению уровня экспрессии генов PsPR1, PsPR10 и PsPAL1. Уровни экспрессии генов, кодирующих ферменты двух различных путей синтеза полиамина путресцина – аргининдекарбоксилазы (PsADC) и орнитиндекарбоксилазы (PsODC), понижались в корнях с клубеньками с увеличением возраста растений обоих проанализированных сортов. Однако уровень экспрессии маркеров PT4, RAM1, RAM2 и TI в ответ на двойную и тройную инокуляцию увеличивался значительно сильнее у растений сорта Frisson по сравнению с сортом Rondo. Это соответствовало данным о более высоком содержании гриба R. irregularis BEG144 в корнях гороха сорта Frisson, что коррелировало с индукцией маркеров этого типа симбиоза. Анализ биомассы корней и надземной массы не выявил значительных различий между растениями сорта Frisson и Rondo на сроке 4 недели после инокуляции в данном эксперименте, только небольшую прибавку массы корней при двойной (ризобии + R. irregularis BEG144) инокуляции, которой соответствовал уровень экспрессии маркерных генов, которые активируются в процессе развития ризобиальной инфекции и инокуляции растений грибами АМ, у растений гороха сорта Frisson и Rondo при двойной и тройной инокуляции. Был проведен анализ биомассы и элементного состава частей растений для определения эффективности симбиотических взаимодействий. Видно, что действие микроорганизмов (позитивное или негативное влияние на биомассу и накопление минеральных веществ) находится в зависимости от генотипа растения. Данное наблюдение вызывает необходимость проведения скрининга серии генотипов гороха на предмет отзывчивости на инокуляцию арбускулярной микоризой и последующей идентификации генетических маркеров, ассоциированных с генами, определяющими данный признак. Очевидно, применение микробиологических препаратов, содержащих арбускулярно-микоризные грибы, должно проводиться только в отношении отзывчивых генотипов, не снижающих ростовые параметры при инокуляции АМ грибами. Иммунолокализация транспортной формы цитокининов была проведена с использованием антител к транс-зеатин рибозиду (Agrisera, Швеция) в четырехнедельных клубеньках сортов гороха Finale и Sparkle. С использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии было показано, что сигнал локализовался в меристеме, зоне инфекции и зоне азотфиксации. В то же время наблюдалась существенная разница по уровню сигнала. В вариантах одиночной инокуляции Rlv1026 и двойной инокуляции Rlv1026 + B.subtilis Ч13 уровень сигнала был значительно ниже, чем в варианте двойной инокуляции Rh. irregularis BEG144 + Rlv1026 и тройной инокуляции Rh. irregularis BEG144 + Rlv1026 + B.subtilis Ч13. Максимальный уровень сигнала наблюдался в клетках меристемы. Был проведен анализ содержания цитокининов в корнях растений сортов Frisson и Rondo, при инокуляции грибом арбускулярной микоризы BEG144, ризобиями Rlv1026 и рост-стимулирующими бактериями B. subtilis Ч13 в различных комбинациях на сроке 2 и 4 недели после инокуляции с использованием метода высокопроизводительной жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией. Анализ показал, что основными формами этих гормонов были транс-зеатин (tZ), 2-изопентениладенин (2-iP), дигидрозеатин (DHZ), а также транс-зеатин рибозид (tZR). В корнях гороха сорта Frisson при двойной инокуляции ризобиями Rlv1026 и грибами АМ (Rlv1026 + гриб АМ), а также при тройной инокуляции клубеньковыми бактериями, грибами АМ и бактериями B. subtilis Ч13 (Rlv1026 + гриб АМ + B. subtilis Ч13) было выявлено увеличение содержания транс-зеатина (tZ), 2-изопентениладенина (2-iP) и транс-зеатин рибозида (tZR). Наиболее высоким содержание этих форм цитокининов было на сроке 4 недели после инокуляции. Увеличивалось также содержание неактивной формы транс-зеатин рибозида (tZR) в варианте с двойной и тройной инокуляцией на сроке 4 недели. Проведенный анализ экспрессии гена LOG1, который контролирует биосинтез цитокининов, а также генов RR11 и RR8, контролирующих ответ растений на цитокинины, у гороха сорта Frisson и Rondo соответствовал повышенному содержанию цитокининов в корнях на соответствующих сроках. На основании данных трехлетних вегетационных экспериментов было установлено, что применение сразу трех микроорганизмов для инокуляции растений гороха оказывает негативное воздействие на образующиеся растительно-микробные системы, по причине того, что растение излишне расходует ресурсы на установление симбиозов со всеми микроорганизмами. Напротив, применение пар «ризобии – грибы АМ» и «ризобии – рост-стимулирующие бактерии» является более выигрышной комбинацией. Полученные на данном этапе исследования результаты о противоположном влиянии (позитивном либо негативном) арбускулярно-микоризных грибов на различные генотипы растений гороха вызывают необходимость проведения дальнейших исследований этого вопроса. На основании полученных результатов разработаны рекомендации по созданию и применению многокомпонентных микробиологических землеудобрительных препаратов на основе клубеньковых бактерий, арбускулярно-микоризных грибов и рост-стимулирующих ризосферных бактерий. В соответствии с ними, комбинацией микроорганизмов для создания МРМС, которую можно применять без учета генотипа растения, является пара «ризобии – рост-стимулирующие бактерии», в то время как пара «ризобии – грибы АМ» должна применяться на тех сортах, которые показали свою симбиотическую эффективность именно при взаимодействии с комплексом клубеньковых бактерий и арбускулярно-микоризных грибов. В то же время, использование только клубеньковых бактерий или только рост-стимулирующих бактерий является менее эффективным, так как не позволяет реализовать весь потенциал МРМС (ввиду различных механизмов полезного действия ризобий и иных рост-стимулирующих бактерий). Для оценки эффективности многокомпонентных микробиологических землеудобрительных препаратов на основе клубеньковых бактерий, арбускулярно-микоризных грибов и рост-стимулирующих ризосферных бактерий было предложено использовать следующие молекулярные, биохимические и цитологические маркеры: 1. Анализ уровня экспрессии гена RAM2 является хорошим маркером микоризации на поздних сроках. 2. Определение содержания транс-зеатина (tZ) и 2-изопентениладенина (2-iP) на сроке 2 недели после инокуляции может быть удобным показателем эффективности развития двойных и тройных симбиозов у гороха. 3. Локализация транспортной формы цитокининов – трнас-зеатин рибозида с помощью коммерческих антител является удобным цитологическим маркером эффективности развития двойных и тройных симбиозов у гороха.