Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Значительное количество пептидов с успехом используется в качестве лекарственных препаратов. Придание пептидам способности ковалентно связываться со своими белковыми мишенями открывает новые возможности в этом направлении. В рамках выполняемого проекта мы исследовали систему, состоящую из N-концевого SH3 домена адаптерного белка Grb2 и пептида, соответствующего участку связывания фактора обмена гуаниновых нуклеотидов Sos. В последовательность пептида был введён остаток Nε-хлорацетиллизина, способный образовывать ковалентную связь с близрасположенным остатком цистеина на поверхности белка. Нам удалось показать, что реакция протекает по механизму SN2, а время полупревращения составляет около 1 часа. Относительно медленная скорость реакции является необходимым условием для создания эффективного пептидного лиганда: сначала пептид распознаёт предназначающуюся для него мишень и образует с ней нековалентный комплекс, после чего химически активная группа пептида оказывается в непосредственной близости от реакционноспособного остатка белка, что создаёт условия для ковалентного связывания. Данные масс-спектрометрии (ИБХФ РАН) подтвердили, что связывание носит селективный характер и происходит в соответствии с авторским замыслом. Нами был разработан новый алгоритм Молекулярной Динамики для моделирования процесса ковалентного связывания Grb2 N-SH3 и Sos. С этой целью мы рассчитали параметры силового поля, необходимые для моделирования Nε-хлорацетиллизина и возникающего в результате реакции линкера S-(2-пропиламино-2-оксоэтил)-цистеина. В качестве начальных координат была использована ранее полученная структура нековалентного комплекса PDB 1GBQ. Ковалентное связывание инициируется случайным образом в ходе МД моделирования после сближения реакционноспособных групп на определённое расстояние. Непосредственно процесс реакции, подразумевающий постепенное исчезновение старых и формирование новых химических связей, моделируется с помощью линейной интерполяции между старым (до реакции) и новым (после реакции) представлениями системы в силовом поле. Алгоритм сформулирован таким образом, чтобы в ходе реакции система оставалась в равновесии с окружением, избегая тем самым неоправданных структурных возмущений. В результате нам удалось получить структурную модель ковалентного комплекса Grb2 N-SH3 / Sos. Высокое качество этой модели было подтверждено сравнением экспериментальных и расчётных хим. сдвигов ЯМР. Разработанный нами алгоритм позволяет оценить перспективы успешного сшивания пептида с белком с точки зрения механического контакта между химически активными группами, а также оценить потенциальное влияние стерических помех, связанных с внедрением реакционноспособного остатка, и пр. С другой стороны, он позволяет составить представление о позе связывания пептида в ковалентном комплексе и потенциальном дестабилизирующем эффекте связывания. Мы также исследовали потенциальный ковалентный пептидный лиганд рецептора эпителиального фактора роста (EGFR), сконструированный на основе кристаллографической структуры PDB 1MOX. Изучаемый пептид pTGFa имеет обширный интерфейс связывания с внеклеточным доменом L1 EGFR, но не с доменом L2. Это заставляет нас предположить, что pTGFa блокирует сайт связывания ростовых факторов, но не является инициирующим фактором для сигналинга EGFR, а также не вызывает интернализации EGFR. Полученные нами предварительные результаты указывают на то, что pTGFa нейтрализует стимулирующий эффект EGF на рост клеток MCF-7. В дополнение к этому мы изучили возможность использования фтординитробензольной группы (FDNB) для модификации пептида и его последующей конъюгации с белком. Для экспериментов "в пробирке" была выбран комплекс белка MdmX с пептидом, имитирующим фрагмент опухолевого супрессора p53. Хотя данные ДСН-ПААГ указывают на формирование конъюгата, подтверждения этому методом LC-MS/MS к настоящему моменту получить не удалось, что заставляет нас обратиться к экспериментам с другой белковой моделью. Важнейшим экспериментальным инструментом, позволяющим судить о конформационном многообразии пептидов и их динамике, является ЯМР эксперимент по измерению спиновой релаксации в индивидуальных атомах пептидной цепи. Тем не менее до настоящего времени отсутствует детальное понимание того, как различные формы движения в пептидах (а также и в нативно разупорядоченных белках) влияют на измеряемые скорости релаксации. Для выяснения этого вопроса мы продолжили исследование пептида, имитирующего N-концевой участок гистона H4 (pepNH4). За отчётный период мы вдвое увеличили продолжительность МД траекторий pepNH4, что позволило нам уточнить анализ температурной зависимости исследуемых динамических мод. Мы также проанализировали данные по хим. сдвигам и константам скалярного взаимодействия, сопоставив экспериментальные результаты с данными МД моделирования. В целом динамика pepNH4 соответствует представлениям о движении случайной цепочки, в которой фактически отсутствует вторичная структура. Однако при этом C-концевой участок этого пептида образует относительно долгоживущую шпильку, которая стабилизируется исключительно водородными связями. По итогам этой работы нам удалось детально проанализировать различные формы движения в рассматриваемом пептиде и оценить их вклад в спиновую релаксацию. Продолжением данного проекта стал анализ соответствующего участка H4 в составе нуклеосомы. Известно, что подвижные гистоновые хвосты играют огромную роль в регуляции транскрипции и репликации ДНК; помимо этого, они также задействованы в процессе конденсации хроматина. Однако с точки зрения структурных исследований, о поведении гистоновых хвостов в хроматине нам известно далеко не всё. Для того чтобы пролить свет на этот вопрос, мы записали серию МД траекторий мононуклеосомы. Поставленная нами задача налагает повышенные требования на методы моделирования. Стандартные методы сталкиваются со значительными трудностями при моделировании: (1) разупорядоченных участков пептидной цепи, к каковым относятся гистоновые хвосты, и (2) ионных взаимодействий, т.е. в данном случае взаимодействий между положительно заряженными гистоновыми хвостами и отрицательно заряженной двухцепочечной ДНК. Это побудило нас использовать усовершенствованные варианты силовых полей, такие как CHARMM36m и Amber ff15ipq, специально оптимизированные для решения подобных задач. Совокупная длительность записанных нами траекторий составила 7.1 мкс. Нам удалось показать, что N-концевой участок гистона H4 в значительной мере сохраняет высокую подвижность в составе нуклеосомы. При этом часть из заряженных остатков H4 образуют контакты с молекулой ДНК, играя роль своего рода "динамических якорей", а лежащие между ними участки пептидной цепи ведут себя как гибкие петли. Данные МД моделирования позволили нам предсказать скорости спиновой релаксации и хим. сдвиги для спинов в концевом участке H4. Полученные результаты качественно согласуются с данными экспериментальных измерений, проводимых нашими партнёрами в Университете Огайо (США). В дополнение к вышеописанному мы записали пробную траекторию нуклеосомы, где к хвосту гистона H4 была присоединена парамагнитная метка MTSL. Далее мы предприняли попытку рассчитать на основе координат МД спектр электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) метки. Этот опыт показал нам, что данная проблематика изучена в настоящее время крайне слабо. Хотя нитроксильные метки широко используются для зондирования структуры и динамики сложных белковых систем, интерпретация получаемых спектров носит сугубо качественный характер. В связи с этим мы задались целью показать, что под анализ спектров ЭПР белков можно подвести количественную базу в виде МД моделирования. В рамках этой задачи нами были сконструированы и изготовлены шесть мутантов небольшого глобулярного домена GB1, каждый из которых содержит единственный остаток цистеина, используемый для прикрепления метки. После конъюгации с MTSL эти образцы были использованы для записи спектров ЭПР. Для каждого из образцов была также записана траектория МД, причём общая продолжительность моделирования составила 120 мкс (на два порядка величины больше, чем в предшествующих работах аналогичной направленности). Полученные координаты МД были использованы для расчёта спектров ЭПР. С этой целью мы применили метод пошагового интегрирования уравнения Лиувилля - фон Неймана для спиновой матрицы плотности. Результаты расчётов показали хорошее согласие с данными экспериментов, таким образом подтвердив достоверный характер модели МД. В свою очередь, это позволяет использовать данные МД для того, чтобы детально охарактеризовать взаимосвязь между динамикой белка с прикреплённой к нему меткой и формой соответствующего ЭПР спектра. В то же время эта взаимосвязь может быть описана также и в упрощённой форме. Например, нам удалось показать, что для исследуемой системы форма спектра в хорошем приближении определяется площадью сольватируемой поверхности боковой цепи цистеин-MTSL – иначе говоря, зависит от того, насколько белковое окружение метки ограничивает её конформационную подвижность. В дополнение к этому нам удалось получить ещё ряд важных результатов. Мы показали, что для расчёта спектров ЭПР в спин-меченом GB1 также подходит теория Редфилда. Это позволяет интерпретировать спектры ЭПР по аналогии со спектрами ЯМР, для которых соответствующий формализм хорошо разработан. Это в особенности актуально для метки MTSL, меченной 15N, ЭПР спектр которой представляет собой асимметричный дублет. Форма этого спектра определяется кросс-корреляционными эффектами по аналогии с известным экспериментом TROSY. Стоит также отметить, что в области ЭПР спектроскопии белков существует представление о том, что добавление в растворитель вязких веществ позволяет устранить вращательное движение белка как целого, не оказывая при этом воздействия на его внутреннюю динамику. Мы показали, что это не так: применение вязкого растворителя приводит к более или менее равномерному замедлению различных форм динамики, включая конформационную динамику боковой цепи остатка цистеин-MTSL. Искусственное замедление динамики при обработке МД траекторий (например, х5) позволило нам успешно воспроизвести соответствующие экспериментальные ЭПР спектры, полученные нашими партнёрами в Университете Питтсбурга (США). Наш интерес к пептидам и неструктурированным белковым последовательностям побудил нас обратиться к экспериментам ЯМР по измерению молекулярной диффузии для подобных систем. В качестве объекта для исследования был избран прионный дрожжевой белок Sup35 (сотрудничество с биологическим факультетом СПбГУ). Эксперименты, проведенные с амилоидогенным фрагментом Sup35NM, показали, что образец, который традиционно ассоциируется исключительно с амилоидными фибриллами, на самом деле представляет собой равновесную систему с существенным содержанием мономеров. Для анализа полученных данных нам потребовался новый теоретический аппарат. В отличие от глобулярных белков, которые можно рассматривать в данном контексте как точечный объект, фибриллы имеют значительную протяжённость. В результате не только трансляционное, но и вращательное движение фибрилл приводит к пространственному переносу намагниченности. Для того чтобы учесть оба этих вклада в измеряемые характеристики системы, мы разработали ряд теоретических конструкций, включая аналитическое и численное решение задачи, а также решение методом компьютерного моделирования. Построенная нами теория была применена для интерпретации экспериментальных данных, позволив установить пропорцию фибрилл и мономеров в образце и определить для них коэффициенты трансляционной диффузии. Проделанный нами теоретический анализ позволил также обосновать использование экспериментов с так называемым диффузионным фильтром, позволяющим разделять спектральные сигналы ЯМР в соответствии с диффузионными свойствами объектов. Тем самым мы опровергли утвердившееся в литературе представление о том, что сигналы от мономеров и фибрилл в принципе не поддаются разделению по этому принципу (что якобы объясняется быстрым перемещением концевых участков фибрилл вследствие вращательной диффузии). Применение диффузионного фильтра позволило установить, что М-домен в составе Sup35NM образует подвижный "хвост" фибриллы, тогда как N-домен образует "тело" фибриллы. Что же касается мономеров, то М-домен находится в аналогичном разупорядоченном состоянии, в то время как N-домен принимает форму "расплавленной глобулы". Этот вывод согласуется с известной ролью N-домена как амилоидогенного участка, который содержит ряд повторов, обладающих склонностью к самоассоциации. Проведенные нами дополнительные измерения с использованием образца Sup35NM селективно меченного 15N по остаткам валина, позволили уточнить границу между двумя доменами – эта граница пролегает в районе остатка 140.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Ряд пептидных гормонов и их модификаций широко используются в клинической практике. Одним из новых направлений в этой области является разработка пептидов, способных образовывать ковалентную связь со своими белковыми мишенями. В этой связи мы создали новую методику, позволяющую моделировать формирование ковалентного комплекса пептид-белок. Предметом нашего исследования стал комплекс N-терминального SH3 домена адаптерного белка Grb2 и пептида, соответствующего участку связывания обменного фактора Sos1, с дополнительно введённым в состав последовательности реакционноспособным остатком Nε-хлорацетиллизин (X'). За отчётный период мы завершили работу над экспериментальной характеризацией этой системы, уточнив спектральное отнесение ЯМР для нековалентного комплекса Grb2 N-SH3 / Sos1-X' и впервые выполнив спектральное отнесение для соответствующего ковалентного комплекса. Дополнительные эксперименты позволили нам с высокой степенью точности определить константу связывания Sos1-X' и время полуреакции пептида с мишенью. В отдельной серии экспериментов мы исследовали способность ковалентного конъюгата Grb2 N-SH3 / Sos1 X' к спонтанному свёртыванию. Полученные нами экспериментальные результаты послужили основой для разработки оригинального алгоритма Молекулярной Динамики, позволяющего моделировать формирование ковалентного комплекса. Реакция инициируется в ходе МД моделирования при сближении хлорацетильной группы Х' с тиолят-анионом целевого остатка цистеина в Grb2 N-SH3. При этом чтобы воспроизвести медленный (по отношению к конформационной динамике) характер химической реакции, мы воспользовались методом выборки с отклонением. Непосредственно процесс химической реакции моделировался путём интерполяции от одного набора параметров силового поля (соответствующего свободным остаткам X' и тиолята) к другому (соответствующему тиоэфир-изопептидному мостику и иону хлора в роли уходящей группы). Мы показали, что по своим фундаментальным предпосылкам наш подход сопоставим с известными методами реактивной молекулярной динамики, такими как метод эмпирических валентных связей Варшеля. Для валидации полученной МД модели ковалентного комплекса Grb2 N-SH3 / Sos1-X' мы обратились к рентгеновской кристаллографии. Попытка кристаллизовать ковалентный комплекс, предпринятая в сотрудничестве с лабораторией И. Безпрозванного, не увенчалась успехом; однако в ходе этой работы нам удалось получить структуру Grb2 N-SH3 в апо-форме (депонированная структура PDB ID 6SDF). В отсутствие кристаллографических данных мы обратились к вторичным химическим сдвигам 1H, 13C, 15N для анализа качества полученной модели. Сравнение экспериментальных и расчётных сдвигов позволяет заключить, что модель обладает высокой степенью точности. Предлагемый метод, позволяющий получать высококачественные модели конъюгатных комплексов белок-пептид, не имеет аналогов в практике биомолекулярного моделирования. Мы ожидаем, что этот метод будет особенно полезен при моделировании систем с неполной или неточной исходной структурой – например, в том случае, когда в структуре нековалентного комплекса отсутствуют координаты подвижных участков пептидной цепи. Рецептор программируемой клеточной смерти PD-1 и его лиганд PD-L1 составляют контрольную точку иммунного ответа, которая с недавних пор получила важное значение в контексте антиопухолевой терапии (нобелевская премия по медицине и физиологии 2018 г.). Успехи в применении терапевтических антител PD-1 и PD-L1 ограничиваются их высокой стоимостью. Решением этой проблемы может стать разработка относительно дешёвых пептидных ингибиторов взаимодействия PD-1 / PD-L1. Имея в виду данную цель, мы реализовали новый протокол для экспрессии и очистки IgV домена PD-L1, ответственного за взаимодействие с PD-1. Ключевым элементом этого протокола является ренатурация и очистка PD-L1 IgV в присутствии циклического пептидного лиганда p57. Используя полученные образцы, мы применили спектроскопию 1H,15N-HSQC для верификации предполагаемых пептидных лигандов PD-L1 IgV. При этом выяснилось, что пептиды RK-10, LP1, DPPA1 и TPP-1, которые были заявлены их разработчиками как высокоэффективные лиганды PD-L1 IgV, на самом деле не являются таковыми. Единственное исключение составил вышеупомянутый пептид p57, эффективность которого была подтверждена также данными иммуноферментного анализа. Опираясь на этот результат, мы задались целью сконструировать ковалентно-связывающийся пептидный лиганд PD-L1 IgV на основе p57. В качестве реакционноспособной группы был избран фтординитробензол (FDNB). Практическая применимость такого подхода была успешно проверена нами на примере фактора роста эндотелия сосудов и его ковалентного лиганда v107-L19K-FDNB. Активированный вариант p57, p57-H5K-FDNB, был сконструирован на основе рентгеноструктурных данных. Однако эксперименты, проведенные с этим пептидом, привели к неоднозначным результатам: мы наблюдали дестабилизацию и агрегацию белка, сопровождающуюся конъюгацией с множественными молекулами пептида. В настоящее время в качестве альтернативы мы исследуем пептид p57-H5K-AFS, активированный арилфторсульфатной группой. Мы также проводим эксперименты с пептидом p57-H5K-FAM, предназначенным для использования в качестве флуоресцентной метки для изучения интернализации PD-L1, и p57-R13K-DOTA, рассматриваемым как модель контрастного агента для применения в магниторезонансной томографии. Целый ряд важнейших клеточных процессов протекает с участием частично или полностью разупорядоченных пептидов и белков. Однако до настоящего времени существует лишь примерное представление об их динамике и предрасположенности к формированию определённых структурных мотивов. Продолжая нашу работу над пептидом N-H4, имитирующим подвижный хвост гистона H4, мы обратились к экспериментам по измерению трансляционной диффузии методом ЯМР. Диффузия N-H4 была последовательно измерена в присутствии 0, 2, 4, 6 и 8 М мочевины. После того как результаты были подвергнуты коррекции, чтобы устранить эффект вязкости растворителя, мы нашли, что параметры диффузии N-H4 лишь слабо изменяются с добавлением мочевины. Отсюда можно сделать вывод о практически полном отсутствии остаточной структуры в свободном N-H4 при физиологических условиях. Напротив, аналогичный эксперимент, проведенный с образцом глобулярного белка убиквитин, показал значительное замедление диффузии при денатурации белка. Наконец, аналогичные измерения в случае нативно разупорядоченного белка α-синуклеина указывают на присутствие существенных элементов остаточной структуры в этом важном белке. Моделирование трансляционной диффузии методом МД потребовало от нас новых нестандартных решений. Во-первых, общеиспользуемый термостат Ланжевена ведёт к искажениям временных констант диффузионного движения. Как мы показали, для получения достоверных результатов необходимо использовать недавно разработанный термостат Бусси. Этот термостат был имплементирован нами в структуре программы Amber; написанный с этой целью код войдёт в официальный релиз данной программы, планируемый на февраль 2020 г. Во-вторых, моделирование трансляционной диффузии потребовало применения специальной схемы вычислений. В этой схеме конформационное многообразие N-H4 воспроизводится в длинной траектории с относительно небольшим размером ячейки. Полученный таким образом набор конформеров используется для записи коротких траекторий в ячейках с увеличенным размером. Наконец, результаты экстраполируются к пределу бесконечно большой ячейки. Таким образом нам удалось успешно воспроизвести экспериментально измеренные значения коэффициента диффузии для N-H4, а также убиквитина и другого небольшого белка, GB1. Полученные результаты представляют собой шаг вперёд на пути к созданию достоверных моделей разупорядоченных пептидов и белков. Хвосты гистонов H2A, H2B, H3 и H4, несущие функциональный код в виде посттрансляционных модификаций, определяют уровень экспрессии индивидуальных генов и, таким образом, имеют огромное значение для жизнедеятельности клетки. Экспериментальные исследования мононуклеосом и нуклеосомных цепочек заставляют предположить, что эти хвосты обладают высокой степенью подвижности. В то же время данные МД моделирования говорят о том, что хвосты тесно взаимодействуют с нуклеосомной ДНК, в значительной мере утрачивая при этом свою подвижность. В нашей работе нам удалось разрешить этот парадокс. Мы записали серию МД траекторий для полноразмерной нуклеосомы с использованием силового поля Amber ff14SB и модели воды TIP4P-D, разработанной специально для моделирования белковых систем с элементами структурного беспорядка. В этих траекториях гистоновые хвосты взаимодействуют с ДНК, но эти взаимодействия носят точечный и неустойчивый характер, так что хвосты сохраняют высокую степень подвижности. Подобное динамическое взаимодействие описывается в литературе термином "fuzzy complex". Достоверность полученной нами МД модели доказывается тем, что она успешно воспроизводит скорости спиновой релаксации ядер 15N в хвосте гистона H4, экспериментально измеренные нашими соавторами из лаборатории К. Джароняка (Университет Огайо) в образце нуклеосомы Widom 601. Аналогичным образом наша модель успешно воспроизводит хим. сдвиги 1H, 15N и 13C для ядер основной цепи N-H4 в составе нуклеосомы. При этом отдельно следует отметить, что альтернативные МД модели с использованием новейших силовых полей Amber ff15ipq и CHARMM36m (модели воды SPC/Eb и TIP3P соответственно) не показали удовлетворительных результатов. Метод спиновых меток с использованием спектроскопии ЭПР представляет собой полезный инструмент для зондирования сложных биомолекулярных систем. Однако до настоящего времени не существует теоретической базы для строгой количественной интерпретации получаемых спектров. Мы видим свою задачу в том, чтобы разработать необходимую для этого методологию. С этой целью мы сконструировали и экспериментально охарактеризовали 7 спин-меченых вариантов домена GB1, а также несколько образцов свободных спиновых меток (MTSL). Для всех из них были записаны траектории МД, совокупная длина которых составила 190 мкс. Анализ данных МД в сочетании с доступными рентгеноструктурными данными позволил установить, что конформационные предпочтения метки MTSL определяются стерическими ограничениями, которые в свою очередь связаны с типом вторичной структуры в точке прикрепления метки. Мы показали, что движения метки, связанные с торсионными углами χ1 и χ2, в принципе являются достаточно быстрыми для того, чтобы оказывать непосредственное влияние на форму спектра. Однако при этом изменения углов χ1, χ2, χ4 и χ5 в значительной мере компенсируют друг друга таким образом, что движение тетраметилпиридинового кольца MTSL происходит медленнее, чем этого можно ожидать. В то же время конформационная динамика метки статистически независима по отношению к вращательной диффузии белка. Это позволило нам отделить один эффект от другого и количественно охарактеризовать эффект вращения на форму спектральных линий. Мы исследовали также 2 образца GB1 с изотопно-обогащённой меткой 15N-MTSL, для которых спектры ЭПР имеют форму асимметричного дублета. Мы установили, что в случае подвижной метки, прикреплённой на поверхности белка, форма спектра успешно воспроизводится с помощью теории Редфилда, а эффект асимметрии можно связать с кросс-корреляцией между сверхтонким взаимодействием и анизотропной компонентой Зеемановского взаимодействия. В целом, нашу работу можно рассматривать как важный шаг на пути к количественно точному анализу данных биомолекулярного ЭПР, получаемых с помощью метода спиновых меток. Амилоидные фибриллы представляют собой особое состояние белковых молекул, важность которого определяется его ролью в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. В силу ряда причин экспериментальное исследование фибрилл сталкивается с рядом затруднений. В частности, исследование методом жидкостного ЯМР возможно только в том случае, когда в составе фибриллы имеется подвижный участок. Примером такой системы является фрагмент дрожжевого фактора терминации трансляции Sup35NM, изучаемый нами в сотрудничестве с С.А. Бондаревым и Г.А. Журавлевой (СПбГУ). Используя специальный протокол, сотрудники нашей группы получили образцы фибрилл Sup35NM с линейной морфологией. Эти образцы были охарактеризованы с помощью трансмиссионой электронной микроскопии и экспериментов диффузионного ЯМР с применением импульсных градиентов магнитного поля. Полученные данные было подвергнуты совместному анализу. При этом для интерпретации диффузионных данных была использована разработанная нами новая теория, которая учитывает не только трансляционное движение фибрилл, но и их вращение по отношению к градиенту магнитного поля. Таким образом нам удалось успешно воспроизвести экспериментальные данные и получить оценку для радиуса фибрилл. В качестве следующего шага нами был приготовлен образец, содержащий наряду с фибриллами Sup35NM также растворимые фрагменты Sup35M. Экспериментальные измерения в этом образце показали отчётливо выраженный двухкомпонентный характер диффузии. Этот результат доказывает возможность создания диффузионного фильтра, позволяющего разделять спектральные сигналы амилоидных фибрилл и сопутствующих им протеолитических фрагментов. Принципиальная возможность создания такого фильтра ошибочно ставится под сомнение в современной литературе.