Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Согласно сформулированной в проекте гипотезе, низкомолекулярные компоненты экскреторно-секреторного продукта (ЭСП) возбудителя описторхоза кошачьей двуустки Opisthorchis felineus оказывают патогенное действие на окружающие ткани хозяина, включая индукцию холангиоканцерогенеза. В развитие этой гипотезы мы предположили, что ЭСП гельминтов может участвовать в активации окислительного стресса тканей желчевыводящих путей, что приводит к их патоморфологическим изменениям. Для проверки этого предположения в экспериментах по изучению молекулярных механизмов патогенеза описторхоза были использованы антиоксиданты различного механизма действия - Ресвератрол (3,4',5-тригидроксистильбен), являющийся природным фитоалексином, и SKQ1-10-(6'-Plastoquinonyl)decyltriphenylphosphonium, относящийся к классу митохондриально-направленных антиоксидантов. В результате полуколичественного анализа патоморфологических изменений гепатобилиарной системы золотистых хомячков, инфицированных O. felineus (1 и 3 месяца после заражения), была проведена оценка пролиферации и дисплазии эпителия желчных протоков, выраженности фибротических изменений в перидуктальной области, и воспалительных инфильтраций. Показано, что антиоксиданты, вне зависимости от природы вещества и механизма действия, снижали уровень воспалительных инфильтраций, пролиферации эпителия и дисплазии холангиоцитов, однако не влияли на развитие перидуктального фиброза. Этот результат свидетельствует о том, что окислительный стресс и активные формы кислорода, по-видимому, играют существенную роль в формировании предракового состояния эпителия желчевыводящих путей - дисплазии и неоплазии холангиоцитов. Улучшение функционального состояния печени животных, получавших антиоксиданты, было подтверждено биохимическими показателями крови. В частности, Ресвератрол и SKQ1 достоверно понижали высокие уровни аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы у животных, инфицированных O. felineus. Важный результат был получен при сравнении оксистерольных метаболитов различных видов печеночных сосальщиков. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии растворимой фракции лизатов O. felineus и O. viverrini было обнаружено, что спектр оксистерольных метаболитов у этих близкородственных видов отличается. В лизате O. viverrini оксистеролов было больше как по представленности пиков, так и по их площади. Таким образом, O. viverrini производит больше оксистеролов, чем O. felineus. В отличие от O. felineus и O. viverrini, в лизатах трематоды Fasciola hepatica не было найдено специфических оксистеролов. Поскольку при фасциолезе не отмечено формирование злокачественных опухолей, этот факт указывает на существенную роль оксистерольных метаболитов в малигнизации органов, заселенных паразитами. Считается, что оксистеролы в эукариотических организмах синтезируются в основном ферментами системы биотрансформации ксенобиотиков. Чтобы выяснить, насколько полно представлена эта система у печеночных сосальщиков был проведен анализ геномных и транскриптомных данных O. felineus. В результате нами выявлены 86 генов, кодирующих белки биотрансформации ксенобитиков и липофильных соединений, включая фазы биотрансформации, конъюгации и клеточного транспорта. Наиболее представлены альдо-кето редуктазы (8 генов), альдегид дегидрогеназы (10 генов), глутатион-S-трансферазы (9 генов), сульфотрансферазы (9 генов) и АТФ-зависимые транспортеры (23 гена). С помощью анализа консервативных белковых мотивов (структурно-функциональных доменов) в базе неаннотированных последовательностей транскриптома и генома выяснено, что в геноме O. felineus присутствуют гены всех трех фаз биотрансформации ксенобитиков. На основании вычисленных и стандартизованных параметров экспрессии (Fpkm, Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million bases) была определена представленность мРНК этих белков в транскриптомах двух стадий развития O. felineus, взрослого гельминта и метацеркарии. Установлено, что наиболее высоко экспрессируемыми генами среди всех генов биотрансформации ксенобиотиков у двух стадий O. felineus являются практически все глутатион-S-трансферазы (GST). Наибольшую экспрессию демонстрирует ген, кодирующий 28 kDa GST сигма (простагландин синтетаза), уровень его экспрессии на стадии взрослого червя превышал уровни экспрессии всех других генов этой системы на 2-3 порядка. Кроме того, высокими уровнями экспрессии обладали также гены, кодирующие альдегид дегидрогеназу и АТФ-зависимые транспортеры класса В1. Интересно, что экспрессия генов, кодирующих сульфотрансферазы, метилтрансферазы и альдо-кето редуктазы практически отсутствовала. Таким образом, в результате проделанной работы на этапе выполнения 1 года Проекта нам удалось определить состав трех фаз системы биотрансформации ксенобиотиков O. felineus, продуктами которой являются, вероятно, паразит специфические оксистеролы. Кроме того, мы показали, что антиоксиданты существенно улучшают состояние печени животных, инфицированных O. felineus. В частности, антиоксиданты понижают уровни хронического воспаления и предраковых изменений эпителия желчных протоков. Эти факты указывают на значимую роль активных форм кислорода и окислительного стресса в патогенезе описторхоза, а также развитии сопутствующих заболеваний печени и желчевыводящих протоков. По результатам 1-го года подготовлено и отослано в журналы первого квартиля Web of Science 3 статьи. Одна из статей принята в печать в журнала первого квартиля Web of Science.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
При выполнении работ по Проекту в 2019 году с помощью иммуногистохимических методов анализа было продемонстрировано значительное накопление окислительных повреждений в динамике описторхоза в тканях печени. В частности, в тканях печени незараженных животных маркеры перекисного окисления липидов, 4-гидроксиноненаль (4-HNE) и малоновый диальдегид (МДА), практически не были заметны. Однако в печени животных с описторхозом 4-HNE и МДА присутствовали, начиная с 1 месяца инфекции. Специфические сигналы 4-HNE и МДА были, в-основном, ассоциированы с клетками, находящимися в области перидуктального фиброза, и возле кровеносных сосудов. Уровень сигнала 4-HNE и МДА рос с длительностью инфекции животных. В тканях печени животных с описторхозом 1.5 года были обнаружены наиболее интенсивные сигналы 4-HNE и МДА. Окраска, соответствующая 4-HNE и МДА была видна не только в клетках в районе перидуктального фиброза, но и в паренхиме печени и клетках эпителия желчных протоков. На дальнейшем этапе, мы оценивали уровень окислительных повреждений ДНК, в частности 8-гидроксигуанина в моче зараженных животных. Этот показатель считается основным для демонстрации окислительного стресса в организме. И действительно, уровень 8OH-dG в моче повышен у животных с описторхозом на всех сроках инфекции, начиная от 1 месяца (p=0.0008) до 1.5 лет (p=0.04). Таким образом, при патогенезе описторхоза окислительный стресс играет значительную роль. На следующем этапе выполнения работ Проекта, с помощью ПЦР анализа с детекцией в режиме реального времени в образцах печени, полученных в 2018 году, была проведена оценка уровней экспрессии мРНК генов, ассоциированных с воспалением и фибиногенезом, а также генов системы антиоксидантной защиты. В частности, соотношение уровня экспрессии генов TNF-a, ALOX5, iNOS, ANXA1 и CK7 (цитокератин 7) в контрольной группе и группах с антиоксидантами были одинаковыми. Тогда как в инфицированных группах (1 и 3 месяца) уровни экспрессии TNF-a, ALOX5, iNOS и ANXA1 были повышены. Применение антиоксидантов на фоне описторхоза, вызванного O. felineus, снижают повышенные уровни мРНК генов, кодирующих воспалительные и связанные с фиброгенезом белки и гены. В частности, как ресвератрол, так и SKQ1значимо снижали повышенную экспрессию мРНК TNF-a и iNOS через 1 и 3 месяца после инфицирования. Кроме того, ресвератрол и SKQ1 уменьшали повышенную экспрессию мРНК Acta2, причем SKQ1 проявлял свой положительный эффект в большей степени через 3 месяца. Мы также оценивали уровни мРНК цитокератина 7 (CК7), который выступает в качестве маркера пролиферации холангиоцитов. Антиоксиданты значительно снижали повышенный уровень экспрессии мРНК CК7 через 1 и 3 месяца. Данные, полученные с помощью оценки уровня мРНК генов, соответствовали данным, полученным с помощью Вестерн-блот анализа. Антиоксиданты значительно снижали повышенные уровни CD68 (n = 7; р <0,01), TNF-a (n = 7; р <0,01) через 3 месяца после инфекции. Кроме того, антиоксиданты ослабляли повышенные уровни содержания маркеров пролиферации клеток эпителия CK7 и PCNA у животных, инфицированных O. felineus. Для оценки фиброгенных процессов мы проверили уровень белка a-SMA в тканях печени. Наибольшее содержание a-SMA наблюдалось в группах, инфицированных O. felineus, через 1 и 3 месяца после заражения. Антиоксиданты значительно уменьшали повышенные количества белка a-SMA через 1 (n = 5; p <0,01) и 3 месяца после инфекции (n = 7; p <0,005). С целью исследования наиболее распространенных осложнений хронического описторхоза у людей, вызванного кошачьей двуусткой O. felineus, а именно, перидуктального фиброза, была проведена работа по оценке адекватности модели экспериментального описторхоза с использованием золотистых хомячков для изучения фиброгенеза при перидуктальном фиброзе и холангите, обусловленным инвазией O. felineus. В частности, была проведена оценка фиброгенеза, состава коллагенов и внеклеточного матрикса при хроническом экспериментальном описторхозе, а также в образцах печени людей, страдающих хроническим описторхозом. В качестве контрольной группы людей были взяты образцы у группы пациентов с холециститом без хронического описторхоза. С помощью окраски парафиновых срезов печени по Ван-Гизону (с детекцией соединительной ткани), окраски серебром (с детекцией молодых аргирофильных волокон соединительной ткани), и иммуногистохимии тканей печени определено содержание в печени некоторых типов коллагенов (коллаген 1, коллаген 3, коллаген 4). Кроме того, определено содержание белков внеклеточного матрикса и регуляторов фиброгенеза (TGFβ1, альфа актина гладких мышц (α-SMA), металлопротеиназы 2 (MMP2), металлопротеиназы 9 (MMP9), 1 тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 (TIMP); а также других маркеров фиброгенеза: FSP-α, GFAP. Характеристики хронического описторхоза, связанного с инфекцией O. felineus, сходны у людей и сирийских хомячков и включают в себя хорошо выраженное развитие фиброзных осложнений в паренхиме печени. Обнаружен схожий характер холангиофиброза печени у людей и сирийских хомяков, ассоциированный с инфекцией O. felineus, что подтверждает пригодность модели золотистых хомячков в качестве экспериментальной модели для изучения описторхоза.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Возбудители описторхоза, печеночные сосальщики Opisthorchis felineus, паразитируют в желчевыводящих путях человека и животных. Однако при описторхозе могут страдать не только органы гепатобилиарной системы. Так, на модели экспериментального описторхоза в динамике заболевания от 1 до 18 месяцев были обнаружены структурные нарушения ткани почек. В частности, показано наличие белковых цилиндров в просвете канальцев почек. Как в мозговом, так и в корковом веществе почек площадь среза, занимаемая цилиндрами, достоверно увеличивалась по мере увеличения срока заболевания. Пространство капсулы Боумена было достоверно расширено на всех сроках заболевания. Отмечено наличие интерстициального фиброза, наиболее ярко проявляющегося при длительности инвазии более тринадцати месяцев. Динамику развития почечной патологии оценивали также на основании определения уровня креатинина в сыворотке крови, содержания белка в моче и уровня маркера почечной патологии KIM-1 в моче и в сыворотке крови. Установлено, что с первого месяца инфекции повышается уровень креатинина и KIM-1, с третьего месяца растет уровень белка в моче. Концентрация биомолекул, характерных для развития почечной недостаточности, достоверно зависела от длительности заболевания. Таким образом, при описторхозе страдают почки, органы, удаленные от гепатобилиарной системы. Это указывает на системное воздействие инвазии O. felineus на организм хозяина. Для определения эффекта антиоксидантов на уровень окислительного стресса в тканях печени при экспериментальном описторхозе была использована технология иммуногистохимического окрашивания замороженных срезов. Установлено, что интенсивность сигналов маркеров перекисного окисления липидов HNE (4-гидрокси-2-ноненаль) и MDA (малондиальдегид) увеличивается прямо пропорционально срокам заболевания. На поздних сроках инфекции специфические сигналы отмечали не только в области кровеносных сосудов и эпителия желчных протоков, но и в паренхиме печени. Митохондриально-направленный антиоксидант SKQ1 существенно подавлял накопление маркеров перекисного окисления липидов. Понижение интенсивности окислительного стресса после действия антиоксидантов было подтверждено также с помощью определения уровня 8-OHdG (8-hydroxy-2′-deoxyguanosine) в моче. Маркер 8-OHdG отражает накопление окислительных повреждений ДНК в организме. Через месяц после инфицирования уровень 8-OHdG у экспериментальных животных повышается почти в 7 раз. SKQ1 снижал уровень 8-OHdG в 3 раза, а ресвератрол в 3,8 раза. В результате исследования влияния антиоксидантов на продукцию белков, участвующих в регуляции воспаления и фиброгенеза, показано следующее. При экспериментальном описторхозе в тканях печени животных происходит время зависимое увеличение содержания маркера воспаления TNF-а (R = 0,79; p = 0,000). Уровни содержания маркера пролиферации эпителия CK7 и маркера фиброгенных процессов альфа-SMA также повышаются у инфицированных животных. Маркер клеток моноцитарного происхождения и тканевых макрофагов CD68 не определяется у интактных животных, однако даёт четко выраженный сигнал у инфицированных. Через 3 месяца после инфицирования ресвератрол в 7 раз снижал уровень TNF-a и CD68. Кроме этого, ресвератрол снижал уровень CK7 в 4,5 и 2,9 раз через 1 и 3 месяца инфекции соответственно. SKQ1 также оказывал позитивный эффект: через 1 месяц после инфицирования этот антиоксидант в 2,3 раза понижал уровень TNF-a и в 3,6 раза CD68. SKQ1 значительно снижал уровень альфа-SMA (р=0,001) через 1 месяц инфекции. Таким образом, представленные данные по содержанию белков воспаления и фиброгенеза в печени экспериментальных животных соответствуют оценке экспрессии генов, выполненной на втором этапе исследования Проекта (2019 год). В целом эти результаты четко коррелируют с характеристикой развития патологических процессов при описторхозе, полученной с помощью количественной морфометрии гистологических срезов (2018 год Проекта). В рамках работ 2020 года показано влияние секретируемого продукта взрослых особей O. felineus на показатели пролиферации и миграции иммортализированной клеточной линии холангиоцитов человека H69. В качестве контроля были взяты опухолевые клетки печени человека HepG2. В отличие от HepG2, пролиферация клеток H69 при бесконтактном со-культивировании с различным числом особей O. felineus увеличивалась от 4 до 17 раз (р <0.05). Кроме того, при со-культивировании были зарегистрированы морфологические изменения клеток H69, увеличение скорости их миграции, а также появление индивидуального характера миграции клеток.