КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-44-04005

НазваниеПоиск и изучение новых антибиотиков, подавляющих работу рибосомы.

РуководительОстерман Илья Андреевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2018 г. - 2020 г. 

Конкурс№17 - Конкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (DFG).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаАнтибиотики, рибосома, синтез белка, высокопроизводительный скрининг, крио-электронная микроскопия

Код ГРНТИ31.23.25

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
С каждый годом число устойчивых бактериальных штаммов возрастает, в то же время темпы создания новых антимикробных препаратов снижаются. Бактериальные инфекции представляют угрозу не только для стран третьего мира, но и для развитых. В связи с ростом числа резистентных штаммов в ближайшие десятилетия смертность от бактериальных инфекций может возрасти в разы или даже десятки раз. В связи с этим крайне актуальным является задача поиска новых антибиотиков. Большинство известных антибиотиков действуют по трем механизмам: нарушение синтеза клеточной стенки, синтеза нуклеиновых кислот или синтез белка. Более половины известных антибиотиков нарушают синтез белка, несмотря на структурную схожесть бактериальной и эукариотической рибосом, удается обнаружить такие небольшие молекулы, которые специфически ингибируют работу бактериальной. Кроме очевидного практического применения ингибиторы трансляции помогают разобраться в фундаментальных основах функционирования рибосомы. Рибосома, один из самых сложных рибонуклеопротеидных комплексов в клетке, осуществляют синтез белка, за счет координации сразу многих процессов: декодирование, пептидилтрансферазная реакция, движение рибосомы по мРНК и т.д. Все эти стадии могут быть специфически остановлены под действием различных антибиотиков. Это позволило провести структурные и биохимические исследования рибосомы в переходных функциональных состояниях, дав уникальную информацию о механизме работы аппарата трансляции. Нами разработана уникальная система скрининга, позволяющая in vivo в высокопроизводительном режиме определять механизм действия антибиотика, одновременно с оценкой эффективности его действия. В ходе выполнения проекта планируется проанализировать не менее десяти тысяч индивидуальных химически синтезированных и природных соединений и отобрать те, которые подавляют рост бактериальных клеток за счет нарушения процесса синтеза белка. Одновременно с этим будет проводиться оптимизация молекул-лидеров (см. задел), обнаруженных нашей группой ранее, при выполнении договора о предоставлении субсидии Минобрнауки 14.607.21.0086 (окончание 31.12.2016) и продемонстрировавших ингибирование трансляции. В данном проекте планируется исследовать обнаруженные ингибиторы и их производные с помощью как биохимических, так и структурных методов, таких, как рентгеноструктурный анализ (РСА) и криоэлектронная микроскопия (криоЭМ). Структурные данные позволят проводить рациональную оптимизацию молекул, основываясь на их месте их связывания с бактериальной рибосомой. Оптимизированные молекулы будут проверены на клинически значимых штаммах и, возможно, могут быть использованы для создания новых антимикробных лекарств. В лаборатории профессора Вилсона, немецкого партнера данного проекта, налажен метод криоЭМ комплексов рибосома-антибиотик. В ходе реализации проекта, кроме изучения новых синтетических соединений, планируется исследовать такие природные антибиотики как миксоваларгин, эланзолид и апидацин. Структура комплекса данных ингибиторов трансляции с рибосомой не известна, однако, предварительные данные показали возможность использования метода криоЭМ для решения данной задачи.

Ожидаемые результаты
Будет проанализирована антибактериальная активность большого набора (не менее десяти тысяч) химически синтезированных соединений и природных соединений, продуктов метаболизма почвенных и других микроорганизмов и проведена их классификация по механизму действия. На данный момент разработанная нами репортерная система является наиболее эффективной по скорости проведения эксперимента и себестоимости, она позволяет детектировать антибиотики, действующие на рибосому, а также вызывающие повреждения ДНК. Найденные в ходе запланированного в рамках данного проекта скрининга, а также обнаруженные нами ранее, новые ингибиторы синтеза белка будут оптимизированы с целью повышения их эффективности и селективности. Для этого будут проведены комплексные структурные исследования методами РСА и криоЭМ. Для оптимизированных молекул будет оценена эффективность подавления роста набора клинически значимых бактериальных патогенов, а также токсичность по отношению к клеткам человека. Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых лекарств и подходов к лечению инфекционных заболеваний. Также будут определены структуры комплекса антибиотик-рибосома для набора интересных ингибиторов трансляции - миксоваларгина, эланзолида и апидацина, предварительные эксперименты уже показали возможность использования данного метода для решения поставленной задачи.Исследование новых ингибиторов рибосомы востребовано мировым научным сообществом. Структурно-функциональные исследования подобного рода публикуются в высокорейтинговых научных журналах (Bulkley D, et al., Cell Rep. 2014 6:357-65; Polikanov et al., Mol Cell. 2014 56:541-50; Svidritskiy E, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 110:12283-8). Имеющиеся публикации нашей группы (Polikanov YS*, Osterman IA* et al., Mol Cell. 2014 56:531-40.* авторы, внесшие равный вклад в работу; Osterman IA. et al., Antimicrob Agents Chemother. 2016) и группы профессора Вилсона (Arenz S, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2016 113:7527-32; Seefeldt AC, et al., Nucleic Acids Res. 2016 44:2429-38; Polikanov YS, et al., Mol Cell. 2015 58:832-44; Seefeldt AC, et al., Nat Struct Mol Biol. 2015 22:470-5) также свидетельствуют о высоком интересе международного научного сообщества к данной теме, ее уровне и актуальности.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведен анализ антибактериальной активности и механизма действия более чем 5000 образцов природного и синтетического происхождения, обнаружены новые ингибиторы синтеза белка. Идентифицирован новый ингибитор синтеза белка – тетрациномицин Х. По структурной схожести с даунорубицином ранее для тетрациномицина предполагали аналогичный механизм действия, а именно, встраивание в ДНК, однако использование двойной репортерной системы pDualrep2 показало, что мишень действия тетрациномицина аппарат синтеза белка, это затем было подтверждено в бесклеточной системе. Отобран наиболее активно подавляющий бактериальный синтез белка 2-гуанидино-хиназолин. Начаты структурные исследования при помощи крио-электронной микроскопии комплекса тетрациномицина Х и 2-гуанидино-хиназолина с рибосомой. Показано, что клебсазолицин, новый тиазол-оксазол модифицированный микроцин, синтезированный в искусственной системе, способен подавлять трансляцию так же эффективно, как и выделенный из клеток штамма продуцента. Показано, что другой тиазол-оксазол-модифицированный пептид POP5 также нарушает синтез белка, начата работа по изучению структуры комплекса рибосомы с POP5. Подтверждено, что производные азитромицина двух классов – конъюгаты с ванкомицином или же с бензоксоборолом, эффективно подавляют рост бактерий за счет ингибирования синтеза белка. Детально изучен механизм действия и структура взаимодействия диритромицина, синтетического производного эритромицина, с рибосомой. Обнаружены дополнительные контакты между этим антибиотиком и рибосомой, неописанные для других макролидных антибиотиков, эти данные могут быть использованы для разработки новых более эффективных макролидных антибиотиков.

 

Публикации

1. А. О. Берестецкий, Ф. Б. Ганнибал, Е. В. Минкович, И. А. Остерман, Д. Р. Салимова, П. В. Сергиев, С. В. Сокорнова СПЕКТР БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГРИБОВ РОДА ALTERNARIA, ВЫЯВЛЕННЫХ В ФИЛЛОСФЕРЕ ТРАВЯНИСТЫХ РАСТЕНИЙ МИКРОБИОЛОГИЯ, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1134/S0026365618060034

2. Тевяшова А.Н., Бычкова Е.Н., Королев А.М., Исакова Е.Б., Мирчинк Е.П., Остерман И.А., Эрдеи Р., Зюцц З, Батта Г. Synthesis and evaluation of biological activity for dual-acting antibiotics on the basis of azithromycin and glycopeptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, - (год публикации - 2018)

3. Тевяшова А.Н., Королев А.М., Мирчинк Е.П., Исакова Е.Б., Остерман И.А. Synthesis and evaluation of biological activity of benzoxaborole derivatives of azithromycin Journal of Antibiotics, - (год публикации - 2018)

4. Травин Д.Я., Метелев М., Серебрякова М., Комарова Е.С., Остерман, И.А., Гиларов Д., Северинов К. Biosynthesis of Translation Inhibitor Klebsazolicin Proceeds through Heterocyclisation and N-terminal Amidine Formation Catalysed by a Single YcaO Enzyme Journal of the American Chemical Society, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1021/jacs.8b02277

5. Д. Лукьянов, Е. Комарова, Д. Ширяев, Ю. Закалюкина, М. Бирюков, Д. Скворцов, Д. Ребриков, М. Подольская, И. Хвен, В. Ташлицкий, Т. Зацепин, М. Серебрякова, В. Полшаков, А. Богданов, П. Сергиев, О. Донцова, И. Остерман Tetracenomycin X novel inhibitor of translation FEBS Open BIO, - (год публикации - 2018)

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведен широкомасштабный скрининг нескольких тысяч природных и синтетических образцов и обнаружены новые соединения, подавляющие рост бактериальной клетки за счет ингибирования синтеза белка. Обнаружено присутствие ингибитора синтеза белка в культуральной жидкости штамма Actinoplanes sp. 49252, исходя из полученных структурных и биохимических данных данная молекула представляет собой новый антибиотик. Изучен механизм действия нового ингибитора синтеза белка, фазолицина, продуцируемого штаммом Rhizobium Pop5, биохимические данные и структурные данные, полученные при помощи КриоЭМ, продемонстрировали, что фазолицин связывается в рибосомном туннеле и блокирует синтез белка. При помощи КриоЭМ удалось определить место связывание нового ингибитора синтеза белка, тетрациномицина Х, в отличие от похожего по структуре тетрациклина, тетрациномицин связывается с большой субчастицей рибосомы в начале пептидного туннеля. Завершено структурное исследование макролида диритромицина при помощи различных структурных и биохимических методов. В результате выполнения проекта в 2019 году обнаружены и изучены новые ингибиторы синтеза белка, которые могут быть использованы для разработки новых антибиотиков.

 

Публикации

1. Ли Ф, Лю С, Лу Ц, Чжэн Х, Остерман И. А., Лукьянов Д. А., Сергиев П. В., Донцова О. А., Лю С, Е Ж, Хуан Д, Сунь С. Studies on Antibacterial Activity and Diversity of Cultivable Actinobacteria Isolated from Mangrove Soil in Futian and Maoweihai of China. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1155/2019/3476567

2. Травин Д.Ю., Ватсон З.Л., Метелев М., Уорд Ф.Р., Остерман И.А., Хвен И.М., Хабибуллина Н.Ф., Серебрякова М., Мергаерт П., Поликанов Ю.С., Кейт Ю.Х.Д., Северинов К. Structure of ribosome-bound azole-modified peptide phazolicin rationalizes its species-specific mode of bacterial translation inhibition. NATURE COMMUNICATIONS, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1038/s41467-019-12589-5

3. Хабибуллина Н.Ф., Терещенков А.Г., Комарова Е.С., Сыроегин Е.А., Ширяев Д.И., Палескава А., Карцев В.Г., Богданов А.А., Коневега А.Л., Донцова О.А., Сергиев П.В., Остерман И.А., Поликанов Ю.С. Structure of Dirithromycin Bound to the Bacterial Ribosome Suggests New Ways for Rational Improvement of Macrolides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1128/AAC.02266-18

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Увеличение числа патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью сокращает наш текущий арсенал клинически используемых антибиотиков, что подчеркивает острую необходимость в новых соединениях-лидерах с новыми участками связывания, чтобы избежать перекрестной устойчивости. В ходе исследований на завершающем году исследования было закончено изучение биохимических (российский группа) и структурных (немецкий партнер) особенностей механизма действия тетрацeномицина Х. Мы обнаружили, что ароматический поликетидный антибиотик тетраценомицин (TcmX) является мощным ингибитором синтеза белка и не вызывает повреждение ДНК, как считалось ранее. Несмотря на структурное сходство с хорошо известным ингибитором трансляции тетрациклином, мы показали, что TcmX не взаимодействует с малой субъединицей рибосомы, а связывается с большой субъединицей в рибосомном туннеле. Нами обнаружен новый сайт связывания, который расположен рядом с сайтом связывания макролидов. TcmX взаимодействует с неканонической парой оснований, образованной U1782 и U2586 23S рибосомной РНК. Обнаружение нового ингибитора синтеза белка и нового сайта связывания открывает путь к разработке новых антибиотиков. Кроме того, был детально изучен механизм действия антибиотики диритромицина, который является производным эритромицина с дополнительной гидрофобной боковой цепью. Макролиды - один из наиболее успешных и широко используемых классов антибактериальных средств, которые убивают или останавливают рост патогенных бактерий, связываясь вблизи активного центра рибосомы и препятствуя синтезу белка. В нашем недавнем исследовании мы обнаружили, что боковая цепь диритромицина образует стэкинг-взаимодействие с ароматическим имидазольным кольцом остатка His69 в рибосомном белке uL4 рибосомы Thermus thermophilus 70S. В текущей работе мы обнаружили, что ни наличие боковой цепи, ни дополнительный контакт с рибосомой не улучшают аффинность связывания диритромицина с рибосомой. Тем не менее, удалось показать, что диритромицин является более сильным ингибитором синтеза белка in vitro по сравнению с его исходным соединением, эритромицином. Используя криоэлектронную микроскопию высокого разрешения, мы определили структуру диритромицина, связанного с транслирующей рибосомой 70S Escherichia coli, что позволяет предположить, что лучшие ингибирующие свойства препарата могут быть объяснены боковой цепью диритромицина, направленной в просвет туннель выхода растущего пептида, где он может мешать нормальному прохождению растущей полипептидной цепи. Данные результаты могут быть использованы для дальнейшего улучшения структуры макролидных антибиотиков.

 

Публикации

1. Остерман И.А., Виланд М., Тинаше П. М., Лашкевич К.А., Лукьянов Д.А., Комарова Е.С., Закалюкина Ю.В., Бушауэр Р., Ширяев Д.И., Лейн С.А.,... Донцова О.А., Уилсон Д.Н. и Сергиев П.В. Tetracenomycin X inhibits translation by binding within the ribosomal exit tunnel Nature Chemical Biology, - (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41589-020-0578-x

2. Пичкур Б.Е., Палескава А., Терещенков А.Г., Касацкий П., Комарова Е.С., Ширяев Д.И., Богданов А.А., Донцова О.А., Остерман И.А., Сергиев П.В., Поликанов Ю.С., Мясников А.Г., Коневега А.Л. Insights into the improved macrolide inhibitory activity from the high-resolution cryo-EM structure of dirithromycin bound to the E. coli 70S ribosome RNA, - (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1261/rna.073817.119

3. Цзян З. К., Ху X.X., Сяо Л.Л., Рен Ю.Р., Шахтина А.Н., Лукьянов Д.А., Остерман И.А., Сергиев П.В., Донцова О.А., Ванг Хао., Ву Г., Ю X.Ф. и Сун Ч.Х. Beilunmycin, a new virginiamycins antibiotic from mangrove-derived Streptomyces sp. 2BBP-J2 and the antibacterial activity by inhibiting protein translation Journal of Asian Natural Products Research, - (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1080/10286020.2020.1810669

4. - В каждой бочке затычка: как тетраценомицин X затыкает бактериальные и эукариотические рибосомы Биомолекула, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Обнаружены и изучены новый ингибиторы синтеза белка, которые при дальнейшей работе могут стать основой для разработки новых антибиотиков.