КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-74-00092

НазваниеРазработка улучшенных генетически кодируемых флуоресцентных меток на основе LOV-доменов

РуководительРемеева Алина Анваровна, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2020 

Конкурс№29 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаФлуоресцентная микроскопия, флуоресцентные белки, флуоресцентные метки, LOV-домены, мутагенез, рентгеновская кристаллография, структурная биология, белковый дизайн

Код ГРНТИ34.15.15

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В данном проекте предлагается провести структурные и биофизические исследования термостабильных флавин-связывающих флуоресцентных белков из семейства LOV (Light Oxygen Voltage)-доменов. Эти белки являются многообещающей альтернативой зеленым флуоресцентным белкам (GFP), а также близким к ним циановым, желтым и красным флуоресцентным белкам (CFP, YFP, RFP) и их производным, на данный момент широко используемым в методах флуоресцентной микроскопии и оптогенетики, но обладающим несколькими существенными ограничениями. По сравнению с GFP и подобными белками, LOV-домены обладают меньшим размером (12-16 кДа) и могут быть использованы в анаэробных условиях. На данный момент, по сравнению с GFP-подобными белками, LOV-домены менее детально изучены, имеют меньший коэффициент экстинкции и квантовый выход флуоресценции. Также, отсутствуют варианты LOV-доменов с значительно смещенными максимумами поглощения. Лишь в 2017 г. были идентифицированы первые термостабильные LOV-домены, однако на данный момент информация о них крайне ограничена. Отсутствуют сведения об их олигомерном составе, структурном устройстве, механизме температурной и оптической стабилизации, и оптимальных, с точки зрения применения в методах флуоресцентной микроскопии, вариациях белков. Данное исследование направлено на усовершенствование белковых флуоресцентных меток на основе LOV-доменов посредством изучения и модификации новых белков из термофильных микроорганизмов. В частности, предлагается изучение влияния мутаций на обнаруженный нами термостабильный LOV-домен из Chloroflexus aggregans по ключевой для функционировании белка позиции, а также исследование новых, ранее не изучавшихся LOV-доменов из родственных термофильных микроорганизмов. Ожидается, что в результате работы будут сконструированы и идентифицированы термостабильные варианты LOV-доменов со смещенным максимумом поглощения. В рамках предварительных исследований по проекту был идентифирован термостабильный LOV-домен из Chloroflexus aggregans, продемонстрирована его высокая термо- и оптическая стабильность, высокий уровень экспрессии, и способность к росту кристаллов, дифрагирующих до высокого разрешения. Проверена возможность внесения мутаций в данный LOV-домен, и получена предварительная информация по одному из шести предлагаемых к изучению мутантов. Руководитель проекта, А.А. Ремеева, обладает большим опытом работы структурных и биофизических исследований белков, обучалась в аспирантуре Института структурной биологии г. Гренобль и постдокторантуре Университета г. Левен, Бельгия. Предполагается, что в проекте также будет участвовать В.В. Назаренко, в данный момент проходящая практику под руководством руководителя проекта и поступающая в 2018 г. в аспирантуру МФТИ, обладающая навыками клонирования, внесения точечных мутаций, экспрессии и очистки белков. Проект будет выполняться на базе созданных в МФТИ биохимических и биофизических платформ, оснащенных всем необходимым оборудованием, включая роботизированные кристаллизационные станции.

Ожидаемые результаты
В рамках данного проекта планируется детальное исследование оптических, биофизических и структурных свойств LOV-доменов из трех близких термофильных микроорганизмов Chloroflexus aggregans, Chloroflexus aurantiacus и Chloroflexus islandicus. Планируется изучить влияние мутированных вариантов термостабильного LOV-домена в ключевой для функционировании белка позиции. Такие мутации могут позволить манипулировать оптическими свойствами LOV-домена, в частности приводить к смещению максимума поглощения белка, что позволит значительно расширить возможности применения LOV-доменов в качестве флуоресцентных меток в микроскопии, а также в качестве оптогенетических инструментов. На сегодняшний день отсутствует структурная информация об эффектах данных мутаций на ближайшее окружение хромофора флавин-мононуклеотида (FMN) и на общую пространственную организацию белка, и данный проект предполагает получение такой информации. Кроме того, планируется провести детальное изучение новых LOV-доменов из термофильных организмов, сравнение их с ранее изучаемыми белками этого семейства с целью выявления наиболее подходящих, с точки зрения стабильности и оптических свойств, кандидатов для дальнейшего использования в микроскопии и оптогенетике.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Данный проект направлен на усовершенствование белковых флуоресцентных меток на основе LOV-доменов посредством изучения и модификации новых белков данного семейства из термофильных микроорганизмов. В отчетном периоде целью работы являлось изучение мутированных вариантов основанного на флавине флуоресцентного белка из термофильной бактерии Chloroflexus aggregans (CagFbFP) в ключевой для функционировании белка позиции. В частности, планировалось создать генетические конструкции, кодирующие мутированные варианты CagFbFP, провести экспрессию, очистку и определить спектральные характеристики белков. Для всех мутированных вариантов планировалось получить кристаллы и определить трехмерные структуры высокого разрешения. В рамках проекта в отчетном периоде проведены все заявленные работы и получены все заявленные научные результаты, а именно: - созданы генетические конструкции, кодирующие варианты основанного на флавине флуоресцентного белка из бактерии Chloroflexus aggregans (CagFbFP) с измененными спектрами поглощения и эмиссии видимого света, посредством мутирования консервативной аминокислоты глутамина 148 на различные полярные и заряженные аминокислоты. - проведена экспрессия, очистка и биофизическая характеризация данных вариантов флуоресцентного белка CagFbFP. - получены кристаллы и определены трехмерные структуры высокого разрешения всех изучаемых вариантов флуоресцентного белка CagFbFP, раскрывающие механизмы влияния внесенных мутаций на хромофор флавинмононуклеотид (ФМН).

 

Публикации

1. Ремеева А., Назаренко В., Ковалев К., Юденко А., Гончаров И., Горделий В., Гущин И. Characterization of thermostable LOV-based fluorescent protein variants with mutations of a highly conserved glutamine JOURNAL OF BIOENERGETICS AND BIOMEMBRANES, Том: 50 Выпуск: 6 Стр.: 575-575 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1007/s10863-018-9775-7

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Данный проект был направлен на усовершенствование белковых флуоресцентных меток на основе LOV-доменов посредством изучения и модификации новых белков данного семейства из термофильных микроорганизмов. В отчетном периоде целью работы являлось изучение двух новых флуоресцентных LOV-домен содержащих белков из термофильных организмов Chloroflexus aurantiacus и Chloroflexus islandicus. В частности, планировалось создать генетические конструкции, кодирующие белки CaurFbFP и CisFbFP, провести экспрессию, очистку, определить спектральные характеристики и уровень термостабильности. Планировалось получить кристаллы изучаемых белков с целью определения их пространственной структуры. В рамках проекта в отчетном периоде были получены следующие результаты: - Разработаны генетические конструкции, кодирующие новые флуоресцентные LOV-домен содержащие белки из термофильных организмов Chloroflexus aurantiacus и Chloroflexus islandicus. - Проведена экспрессия, очистка и биофизическая характеризация данных белков. - Были получены белковые кристаллы, работы по снятию дифракционных данных ведутся. Дальнейшие исследования касались изучения потенциальных возможностей для улучшения свойств флавин-связывающих флуоресцентных белков с использованием как информации об изученных флуоресцентных белках, так и данных о структуре белка CagFbFP, полученной нами ранее. Для этого: - Были разработаны генетические конструкции, кодирующие варианты белка CagFbFP с точечными мутациями аланина на пролин в позициях 56, 58 и 95. - Была проведена экспрессия, очистка и биофизическая характеризация данных вариантов флуоресцентного белка CagFbFP. - Было показано, что вносимые мутации увеличивают термическую стабильность флуоресцентных белков на основе LOV-доменов. - Были получены кристаллы и определены трехмерные структуры высокого разрешения мутированных вариантов CagFbFP: CagFbFP-A56P и CagFbFP-A95P.

 

Публикации

1. Ремеева А.А., Назавернко В.В., Ковалев К., Гончаров И.М., Юденко А.Н., Асташкин Р., Горделий В.И., Гущин И.Ю. Insights into the mechanisms of light-oxygen-voltage domain color tuning from a set of high-resolution X-ray structures PROTEINS : Structure, Function, and Bioinformatics, 2021; 89: 1005 - 1016 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/prot.26078

2. Ремеева А.А., Назаренко В.В., Гончаров И.М., Юденко А.Н., Смоленцева А., Семенов О., Ковалев К., Гулбахар К., Шванеберг У., Давари М., Горделий В.И., Гущин И.Ю. Effects of Proline Substitutions on the Thermostable LOV Domain from Chloroflexus aggregans Crystals, Crystals 2020, 10(4), 256 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/cryst10040256

3. - Наука в МФТИ. Дайджест. 16–29 марта 2020. Ученые повысили термостабильность LOV-домена За науку, - (год публикации - )

4. - Лаборатория структурного анализа и инжиниринга мембранных систем МФТИ: в любой непонятной ситуации — моделируй! Биомолекула, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут быть использованы при разработке технологий по использованию генетически кодируемых быстрофолдирующихся флуорецсцентных меток, работающих в бескислородных условиях, для фундаментальных и прикладных исследований в области клеточной биологии и биотехнологий.