Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Настоящая работа посвящена дизайну и получению селективных лигандов двух фармакологически важных изоформ калиевых каналов (Kv1.3 и Kv10.1). Гомотетрамеры Kv1.3 гиперэкспрессируются на поверхности иммунных клеток в процессе развития таких заболеваний, как: рассеянный склероз, ревматоидный артрит, псориаз и др [1–3]. Показано, что селективное ингибирование данного канала приводит к угнетению функций аутореактивных лимфоцитов и как следствие может служить одним из способов терапии аутоиммунных заболеваний [4]. Другая важная изоформа – Kv10.1 – играет важную роль в онкогенезе, поэтому может представлять собой потенциальную онкомишень [1,5,6]. Ингибирование Kv10.1 возможно в частности и полипептидными лигандами, однако в настоящее время количество селективных пептидов крайне ограничено [7–9]. Цель данной работы как раз состоит в том, чтобы разработать и получить полипептидные лиганды, селективно действующие на Kv1.3 и Kv10.1. Селективный лиганд на Kv1.3 было предложено получать на структурном «каркасе» ранее выделенной и охарактеризованной нами молекулы: MeKTx13-3 [10]. По гомологии с ранее известной структурой другого родственного токсина BmKTХ была построена модель пространственной структуры нашего полипептида. Для того чтобы идентифицировать детерминанты токсина, которые принимают участие во взаимодействии рецептором, мы сгенерирована модель изоформы Kv1.1 на базе кристаллической структуры Kv1.2. Подобная модель для Kv1.3 была получена нами ранее. На основе структуры комплекса химерного канала Kv1.2/2.1 с харибдотоксином [11] посредством серии пространственных выравниваний была построена модель комплекса MeKTx13-3 с каналами Kv1.1-Kv1.3. Для полученной модели комплексов MeKTx13-3 с обозначенными калиевыми каналами произведен расчет траекторий молекулярной динамики. С использованием специально разработанного программного обеспечения для траектории молекулярной динамики выполнен анализ межмолекулярных контактов. С применением метода белковой топографии рассчитаны динамические карты распределения электростатического потенциала на поверхности Kv1.1-Kv1.3 и MeKTx13-3 в составе их комплекса. Для оптимизации электростатического потенциала на поверхности молекулы лиганда с целью увеличения аффинности взаимодействия с каналом Kv1.3 предложены конкретные структурные изменения (аминокислотная замена). Помимо этого, был произведен анализ литературных данных о структурных аналогах MeKTx13-3 и физиологической активности этих полипептидов. На основе данного анализа были предложены дополнительные производные MeKTx13-3 с аминокислотными заменами, которые вносят наибольший вклад в селективность по отношению к Kv1.3. Были получены векторные конструкции, кодирующие MeKTx13-3 и его производные на базе плазмиды pET-32b для продукции данных полипептидов в рекомбинантной системе экспрессии. В настоящее момент ведутся работы по получению полипептидов с целью их последующей электрофизиологической характеристики на панели K+ каналов. Блокатор Kv10.1 было предложено конструировать на молекулярном «шаблоне» известного токсина BeKm1, который эффективно действует на родственный подтип K+ каналов, а именно: hKv11 или hERG [12]. Для начала, была построена модель hERG на базе структуры данного канала, полученного с помощью криоэлектронной микроскопии [13]. В данной модели были достроены недостающие участки канала, поскольку они не были разрешены полностью, но принимают важное участие в образовании комплекса с BeKm1. Использование метода молекулярного докинга позволило построить комплекс hERG с токсином BeKm1. В расчет также были взяты экспериментальные данные, полученные в ходе сайт-направленного мутагенеза как канала, так и токсина. Для данного комплекса были выявлены наиболее важные аминокислотные остатки, вовлеченные в процесс взаимодействия: для BeKm1 (K18 и R20); для канала (S631 и Q592). В настоящий момент ведется работа по получения модели комплекса BeKm1 с Kv10.1, опираясь на пространственную структуру Kv10.1, исследованную недавно с помощью метода криоэлектронной микроскопии [14]. Помимо модельных экспериментов мы дополнительно реализовали нашу классическую стратегию по поиску новых лигандов ионных каналов. Для этого были получены ооциты шпорцевой лягушки с экспрессированными на поверхности Kv10.1. С помощью электрофизиологический измерений методом двухэлектродной фиксации потенциала были протестированы 11 ядов членистоногих на наличие эффекта ингибирования данной изоформы Kv. В результате были идентифицированы яды двух паукообразных (Leiurus quinquestriatus и Eresus niger), в которых содержаться потенциальные блокаторы Kv10.1. В настоящий момент ведутся работы по хроматографическому разделению этих ядов и выделению активных соединений в индивидуальном состоянии. Список литературы: [1] H. Wulff, N.A. Castle, L.A. Pardo, Voltage-gated potassium channels as therapeutic targets., Nat. Rev. Drug Discov. 8 (2009) 982–1001. doi:10.1038/nrd2983. [2] H. Wulff, B.S. Zhorov, K+ channel modulators for the treatment of neurological disorders and autoimmune diseases., Chem. Rev. 108 (2008) 1744–73. doi:10.1021/cr078234p. [3] G. Panyi, L.D. Possani, R.C. Rodríguez de la Vega, R. Gáspár, Z. Varga, K+ channel blockers: novel tools to inhibit T cell activation leading to specific immunosuppression., Curr. Pharm. Des. 12 (2006) 2199–220. [4] C. Beeton, M.W. Pennington, R.S. Norton, Analogs of the sea anemone potassium channel blocker ShK for the treatment of autoimmune diseases., Inflamm. Allergy Drug Targets. 10 (2011) 313–21. [5] L.A. Pardo, D. del Camino, A. Sánchez, F. Alves, A. Brüggemann, S. Beckh, W. Stühmer, Oncogenic potential of EAG K+ channels, EMBO J. 18 (1999) 5540–5547. doi:10.1093/emboj/18.20.5540. [6] B. Hemmerlein, R.M. Weseloh, F. Mello de Queiroz, H. Knötgen, A. Sánchez, M.E. Rubio, S. Martin, T. Schliephacke, M. Jenke, Heinz-Joachim-Radzun, W. Stühmer, L.A. Pardo, Overexpression of Eag1 potassium channels in clinical tumours., Mol. Cancer. 5 (2006) 41. doi:10.1186/1476-4598-5-41. [7] L. Moreels, S. Peigneur, D.T. Galan, E. De Pauw, L. Béress, E. Waelkens, L.A. Pardo, L. Quinton, J. Tytgat, APETx4, a Novel Sea Anemone Toxin and a Modulator of the Cancer-Relevant Potassium Channel KV10.1., Mar. Drugs. 15 (2017) 287. doi:10.3390/md15090287. [8] L.A. Pardo, W. Stühmer, The roles of K(+) channels in cancer., Nat. Rev. Cancer. 14 (2014) 39–48. doi:10.1038/nrc3635. [9] L.A. Pardo, W. Sühmer, Eag1 as a cancer target., Expert Opin. Ther. Targets. 12 (2008) 837–43. doi:10.1517/14728222.12.7.837. [10] A.I. Kuzmenkov, A.A. Vassilevski, K.S. Kudryashova, O.V. Nekrasova, S. Peigneur, J. Tytgat, A.V. Feofanov, M.P. Kirpichnikov, E.V. Grishin, Variability of potassium channel blockers in Mesobuthus eupeus scorpion venom with focus on Kv1.1: An integrated transcriptomic and proteomic study, J. Biol. Chem. 290 (2015). doi:10.1074/jbc.M115.637611. [11] A. Banerjee, A. Lee, E. Campbell, R. Mackinnon, Structure of a pore-blocking toxin in complex with a eukaryotic voltage-dependent K(+) channel., Elife. 2 (2013) e00594. doi:10.7554/eLife.00594. [12] Y. V Korolkova, S.A. Kozlov, A. V Lipkin, K.A. Pluzhnikov, J.K. Hadley, A.K. Filippov, D.A. Brown, K. Angelo, D. Strøbaek, T. Jespersen, S.P. Olesen, B.S. Jensen, E. V Grishin, An ERG channel inhibitor from the scorpion Buthus eupeus., J. Biol. Chem. 276 (2001) 9868–76. doi:10.1074/jbc.M005973200. [13] W. Wang, R. MacKinnon, Cryo-EM Structure of the Open Human Ether-à-go-go-Related K+ Channel hERG., Cell. 169 (2017) 422-430.e10. doi:10.1016/j.cell.2017.03.048. [14] J.R. Whicher, R. MacKinnon, Structure of the voltage-gated K+ channel Eag1 reveals an alternative voltage sensing mechanism., Science (80-. ). 353 (2016) 664–9. doi:10.1126/science.aaf8070.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Производные MeKTx13-3 были получены в бактериальной системе экспрессии в виде слитых белков с белком-носителем тиоредоксином (Trx). Для расщепления гибридного белка по сайту DDDDR была использована легкая цепь рекомбинантной энтеропептидазы человека. Чистоту целевых пептидов проверяли с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии и аналитической хроматографии. Таким образом был получены рекомбинантный MeKTx13-3 и его ряд его мутантов, а измеренные молекулярные массы очищенных пептидов были равны рассчитанным значениям. Конечный выход пептидов составлял ~ 5 мг на 1 л бактериальной культуры. Следующим важным этапом работы стало физиологическое тестирование рекомбинантного токсина и всех его полученных аналогов. Активность полученных рекомбинантных пептидов первоначально оценивали в концентрации 1 мкМ против 8 изоформ Kv (Kv1.1-Kv1.5, Kv2.1, Kv3.1, Kv4.2). Природный MeKTx13-3, непосредственно выделенный из яда, служил контролем. При 1 мкМ рекомбинантный MeKTx13-3, а также природный токсин полностью ингибировали токи через каналы Kv1.1 и Kv1.3, в то время как на Kv1.2 блокировалось ~ 85% тока. На другие изофрмы Kv токсины не были активны. Важно отметить, что не было обнаружено различий в значениях IC50 для природного и рекомбинантного MeKTx13-3, несмотря на отсутствие С-концевого амидирования в рекомбинантном пептиде. Полипептиды со внесенными мутациями также тестировались на панели калиевых каналов, а для тех изоформ, где наблюдался эффект были построены кривые доза-ответ и рассчитаны значения концентрации полуингибирования. Стоит отметить, что желанный эффект, а именно переключение селективности с Kv1.1 на Kv1.3, был достигнут лишь для одного производного: MUT_tab1. Данное производное продемонстрировало сопоставимую активность с MeKTx13-3 на Kv1.3 (IC50 = 8,5 ± 1,2 нМ), тогда как его аффинность на Kv1.1 резко снизилась (IC50 = 541,5 ± 48,6 нМ вместо 1,9 ± 0,2 нМ для MeKTx13-3 ). MUT_tab1 также показал снижение активности на Kv1.2 (IC50 = 217,7 ± 14,3 нМ вместо 105,9 ± 14,6 нМ для MeKTx13-3). Таким образом, были достигнуты два важных результата: во-первых, получен высокоселективный пептид MUT_tab1 к Kv1.3, во-вторых, впервые было произведены точечные изменения в интерфейсе взаимодействия MeKTx13-3 с каналом, что привело к переключению селективности токсина с Kv1.1 на Kv1.3. Для получения лиганда Kv10.1, на следующем этапе было произведено пространственное выравнивание комплекса Kv11.1 (hERG) с BeKm1 и Kv10.1 (EAG). Наибольший интерес представлял поровый участок, поэтому выравнивание поровых петель каналов было в приоритете: 415-486 а.о. Kv10.1 и 603-674 а.о. Kv11.1. Для проведения молекулярной динамики (МД) полученная модель комплекса Kv10.1 с BeKm1 помещали в нейрональную липидную мембрану. Полученные молекулярные ансамбли помещали в прямоугольные ячейки, которые впоследствии заполняли молекулами воды и ионов в количестве, необходимом для поддержания электронейтральности. С использованием программного обеспечения, разработанного членами нашего научного коллектива, был проведен анализ межмолекулярных контактов и энергетических параметров связывания для выявления различий во взаимодействии Kv10.1 и Kv11.1 c токсином. Так как достоверно было установлено, что наибольший вклад в формирование комплекса со стороны токсина вносят остатки K18, R20, а в стороны Kv11.1 - S631, Q592 двух соседних субъединиц, важной задачей была локализация топологических детерминант в Kv10.1. В данных позициях у EAG располагаются D397 и A443. Кроме того, важно и окружение данный аминокислотных остатков – так как в одном и втором случае в этих областях формируются гидрофобные кластеры. Для формирования контакта с этими гидрофобными участками, были предложены мутанты BeKm1, несущие в ключевых позициях гидрофобные аминокислотные остатки с небольшими радикалами, а именно BeKm1 [K18A], BeKm1 [R20A], BeKm1 [K18A, R20A]. Выход целевых пептидов составил ~1-3 мг с литра культуры. Для пептидов было показана корректность фолдинга, замыкания дисульфидных связей, а также измерена молекулярная масса. Данные мутанты, а также природный BeKm1, были протестированы на Kv10.1, экспрессированных в ооцитах шпорцевой лягушки, однако, как для BeKm1, так и для его производных не было идентифицировано никакого эффекта вплоть до 5 мкМ. Несмотря на то, что данные каналы (hERG и EAG) являются очень похожими, а внесенные мутации предполагали, что создаваемые лиганды приобретут активность на Kv10.1, данный канал по-прежнему остается мишенью без известных поровых блокаторов. Совместно с бельгийскими коллегами, мы продолжаем скрининг различных ядов и других источников (потенциально предполагающих наличие лигандов Kv10.1), но желаемый эффект во-первых, или лишь найдет в немногих из них, во-вторых, очень слабый. Возможным объяснением этого может служить тот факт, что два остатка канала N388 и N406, располагающиеся в непосредственной близости к поре канала, гликозилированы. В этом положении углеводная цепь может окружить внеклеточное отверстие в пору и препятствовать связыванию ингибирующих токсинов. В связи с этим нами были предложены эксперименты, которые могут подтвердить/опровергнуть это, а именно внесение точечных мутаций в эти позиции, для предотвращения образования сайтов гликозилирования. Было проведено хроматографическое разделение яда скорпиона Leiurus quinquestriatus и паука Eresus niger. Разделение осуществлялось с помощью гель-фильтрации с последующей стадией ОФ-ВЭЖХ. На каждом этапе, полученные фракции тестировались на Kv10.1, экспрессированных в ооцитах X. laevis. Все фракции и субфракции L. quinquestriatus после разделения потеряли активность. Было высказано предположение, что яды – сложные биологические смеси – могут содержать в своем составе двухвалентные ионы, которые и демонстрируют ложноположитльные результаты. Фракции от деления яда Eresus niger тестировались аналогичным образом, но в этом случае удалось обнаружить активность в одной из фракций. Исключение ложноположительного результата проводилась по средствам предварительного обессоливания, а также наблюдением дозозависимого ответа. Последующий раунд очистки позволил выделить вещество (предположительно пептидной природы) в индивидуальном состоянии. В настоящее время ведутся работы по установлению его структуры. Помимо запланированных работы, также был протестирован ряд веществ: различных производных токсинов и синтетических пептидов. В результате масштабного скрининга удалось идентифицировать активность на Kv10.1 у одного из производных Tk-hefu, а именно Th-24. Соединение продемонстрировало ингибирующий эффект порядка 20% при аппликации 10 мкМ.