Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В качестве узнающих элементов аптасенсоров выбраны аптамеры к гемагглютинину вируса гриппа, который является поверхностным белком, отвечающим за узнавание клетки-хозяина. Специфичность 10 ДНК-аптамеров к была оценена на нескольких подтипах вируса гриппа. В качестве лидеров выбраны аптамеры с широкой специфичностью и наибольшей интенсивностью сигнала. Интерферометрическим методом и аптаферментным анализом были определены константы взаимодействия вирусов разных подтипов с аптамерами BV42 и RHA0385. Сравнение аптамера RHA0385 и его производных, G7-1, G7-2 и G7-3, показывает, что все они обладают высокой аффинностью к вирусным частицам (кКд ниже 20 нМ). Однако, в случае G7-3 аффинность к вирусу H3N2 понижена в 10 раз; следовательно изменение последовательности нуклеотидов большой петли влияет на селективность аптамеров. Наименьшая амплитуда изменения селективности была у аптамера G7-1 (в 1,2-1,7 раза). Кроме того, методы ЯМР и ВЭЖХ гель-фильтрации показали, что G7-1 содержит наименьшее число олигомеров, а его мономерная фракция представляет собой индивидуальный конформер. Были изучены разные модификации аптамера RHA0385. Производные были изучены методами спектроскопии кругового дихроизма и ВЭЖХ гель-фильтрации. Тиоловая модификация по 5’- или 3’-концам незначительно влияет на термодинамические параметры G-квадруплекса. Модификации флуоресцентным красителем могут оказывать более выраженное влияние. Так, введение Cy5 привело к снижению абсолютных значений энтальпии и энтропии. Аптасенсор с производным Cy5 был единственным, не давшим рамановского спектра красителя. Производное RHA0385-3’-Cy3 обладало наибольшими абсолютными значениями термодинамических параметров; данный аптамер был успешно использован для детекции вируса гриппа. Наиболее близкие к исходному аптамеру термодинамические параметры были у производного с красителем BDP FL, который также успешно использован для детекции вируса гриппа. В качестве SERS-сенсоров были испытаны несколько вариантов: А) Коллоидные металлические наночастицы различных форм и размеров Б) многослойные металл-диэлектрические структуры с различными комбинациями металлов (Ag, Au, Al) и диэлектриков (SiO, SiO2, Al2O3, TiO2) В) островковые металлические слои на поверхности диэлектриков Г) периодические диэлектрические структуры с толстым металлическим слоем, в которых реализуется гигантское усиление сигналов рамановского рассеяния света и люминесценции за счет комбинации диэлектрического и плазмонного резонанса. Предварительные испытания разных типов SERS-сенсоров выявили подложки типа В и Г как дающие наибольшую интенсивность сигнала. Отжиг подложек типа В и этап напыления хрома на подложки типа Г улучшают адгезивные свойства поверхностей подложек соответствующего типа, что препятствует их повреждению в процессе выполнения эксперимента по высокочувствительному выявлению вируса гриппа. Подложки типа Г изготавливаются с помощью методов электронной литографии и плазмохимического травления, в связи с чем они являются дорогостоящими и их массовое производство для создания методики по экспресс-определению вируса гриппа в низких концентрациях затруднено. В дальнейшем в рамках данного проекта планируется при производстве подложек данного типа переход на фотолитографию, что позволит масштабировать их выпуск. Подложки типа В достаточно просты в изготовлении, обладают высоким коэффициентом усиления оптического отклика от исследуемых молекул и являются экономически обоснованными при производстве. Именно на этих подложках была разработан прототип SERS-сенсора для высокочувствительного выявления вируса гриппа. В процессе выполнения проекта был произведен сравнительный анализ различных SERS-репортеров с целью оптимизации по чувствительности полного «сэндвич»-метода. При возбуждении лазерным светом с длиной волны 532 нм были проверены различные резонансные (Су3, TAMRA, BDP R6G) и нерезонансные (Cy5, Cy5.5, Cy7, FAM, BDPFL, MG) для такого излучения красители. В эксперименте по детектированию вируса гриппа были использованы вторичные аптамеры, меченные коммерчески доступными активированными эфирами Cy3 и BDPFL, обладающими хорошим рамановским откликом при относительно низкой фотолюминесценции. Используя SERS-подложки типа В и производные аптамера RHA0385, был создан и протестирован прототип аптасенсора для определения вируса гриппа. Аптасенсор представляет собой сэндвич из первичного аптамера (тиол-модифицированный аптамер, иммобилизованный на SERS-подложке с наноструктурированном серебром), вируса гриппа и вторичного аптамера (аптамер, модифицированный SERS-активным соединением). Детектируемый сигнал – интенсивность одной из линий рамановского спектра SERS-активного соединения. Интенсивность сигнала коррелирует с количеством вируса, сорбированного на сенсоре. Выбор сэндвич-методики основан на том, что такие методики обладают большей чувствительностью за счет снижения уровня фонового сигнала. Предложенная методика подробно описана в разделе о фактическом выполнении плана работ. Для комбинации производных аптамера RHA0385, (SH-(CH2)6)- 5’-RHA0385 и Cy3-5’-RHA0385, был определен предел обнаружения вируса гриппа. Для штамма H3N2, A/England/42/1972 предел обнаружения составил 5∙10^4 вирусных частиц в мл. Аналогичное значение предела обнаружения штамма H3N2, A/England/42/1972 было определено для комбинации производных аптамера RHA0385, (SH-(CH2)6)- 5’-RHA0385 и BDP FL-5’-RHA0385. Предложенный прототип аптасенсора (с Cy3 меткой вторичного аптамера) был опробован на нескольких штаммах вирусов, включая подтипы Н1, Н3, Н4, Н5, Н9, Н12. Все перечисленные подтипы вируса гриппа А были успешно детектированы. Кроме того, были опробованы комбинации разных аптамеров, например, SH-5’-RHA0385 и BV42-Cy3, SH-5’-RHA0385 и RHA0006-Cy3, SH-5’-RHA0385 и A22-Cy3. Все комбинации успешно детектировали вирус гриппа подтипа H3N2. Однако, наибольший сигнал был достигнут в исходной комбинации модифицированных аптамеров RHA0385. Дальнейшая работа будет направлена на снижение фонового сигнала аптасенсора, что может повысить предел обнаружения вируса гриппа.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Раздел 1. Аптасенсоры к вирусу гриппа. Аптамеры к гемагглютинину вируса гриппа Подробно исследованы G-квадруплексные аптамеры на основе аптамера RHA0385 (G7), обладающие широкой штамм-специфичностью к разным штаммам вируса гриппа А. Показано, что только аптамеры G7-1 и G7-2 представлены в виде 1 конформации, в то время как G7 и G7-3 – смесь нескольких конформеров. Эти результаты подтверждены результатами эксклюзионной ВЭЖХ, где очевидно, что аптамеры G7 и G7-3 содержат большую фракцию олигомеров при концентрациях 200-400 мкМ. Аптамеры G7-1 и G7-2 остаются преимущественно мономерными даже при концентрации 400 мкМ. Указанные особенности должны оказывать сильный эффект на аффинность аптамеров. Однако, результаты по аффинности аптамеров к рекомбинантным белкам и вирионам гриппа А показывают, что аптамер G7 остается лидером по сравнению со всеми его модификациями. Вероятно, такой результат связан с низкими концентрациями аптамеров, использованными в экспериментах по определению аффинности (менее 1 мкМ). Что касается необычно широкой штамм-специфичности этих аптамеров, то проведенные детальные исследования показывают, что она обусловлена вариабельностью в каком-то конкретном сайте белка и не коррелирует с дивергенцией гемагглютининов в целом (т.е. сиквенсов всего белка). Эксперименты с SERS-подложками. Замена наностровковых подложек с номинальной толщиной серебра 6 нм на подложки из нешлифованного кремния с напыленным серебром толщиной 8 нм позволили не только увеличить соотношение опыт/контроль, но и добиться лучшей воспроизводимости сигнала. Также в работе хорошо себя показали подложки с напыленным толстым слоем (60 нм) серебра поверх периодических SiO2 - столбиков, полученных с помощью методов литографии и плазмохимического травления. Эксперименты с наночастицами. Была предложена следующая методика: предварительно собирались агрегаты наночастиц, модифицированные аптамерами G7-SH, которые в присутствии биологических жидкостей без вируса быстро разрушались, что приводило к мгновенному падению SERS-сигнала. А в образцах, содержащих вирионы вируса гриппа А, падение сигнала было значительно менее выражено. Предположительно, причины резкого падения сигнала связаны с неспецифическим разрушением агрегатов наночастиц в биологических жидкостях. В случае добавления вирусных частиц, наночастицы сорбируются на вирус за счет специфического взаимодействия с аптамером к гемагглютинину, что приводит к небольшому падению сигнала, но не к его исчезновению, как в случае вируса гриппа В или аллантоисной жидкости. Эксперименты по оптимизации аптасенсоров к вирусу гриппа. Были оценены причины различий предела обнаружения вирусов гриппа для разных штаммов. Показано, что диапазон определения вируса A/chiken/Kurgan/3654-at/2005 (H5N1) аптамером i5: диапазон составил Nvir = 10^3 – 10^7 частиц/мл. Сравнение с проведенными ранее опытами показывает, что смена узнающего элемента и штамма вируса значительно влияет на диапазон определения: диапазон составлял примерно 10^5 – 10^8 частиц/мл для аптамера RHA0385 с разными SERS-метками. Данное наблюдение приводит к необходимости проверки диапазона определения или оптимизации методики для расширения диапазона определения. Что касается оптимизации аптасенсоров, то были проведены работы по оптимизации методики проведения анализа (разные способы забивки, температурный режим, вариации времени сорбции, использование разных буферов, использование разных узнающих элементов), а также были протестированы разные подложки. Было обнаружено, что замена буферного раствора с PBS на HEPES или MES или добавление к PBS MgCl2 заметно усиливают SERS сигнал Cy3-меченного аптамера. Оптимальная температура проведения анализа - 25°С. Были исследованы разные варианты забивки поверхности. Дальнейшие исследования по этому направлению будут сосредоточены на подборке забивки среди низкомолекулярных тиолов или дисульфидов (тиофенол, липоевая кислота, 6-меркаптогексанол и др.). С целью повышения чувствительности методики проводилась предварительная концентрация образца аллантоисной жидкости с вирусом методами центрифугирования или железооксидными наночастицами. Концентрация центрифугированием хоть и показала свою эффективность, но увеличила время проведения анализа более чем два раза. В дальнейшем планируется для этих целей использовать быструю магнитную сепарацию с помощью железооксидных наночастиц, модифицированных аптамером RHA0385. Исследовалась возможность предварительной модификации поверхности серебряных наноостровков тиомодифицированными аптамерами в течение 24 ч с последующей обработкой модификатором в течение 45, 90 и 180 мин. Длительная модификация серебряных наноостровков первичными аптамерами и забивкой оказались неэффективными в нашей работе. Был опробован альтернативный способ посадки первичных аптамеров на подложки. Для этого вместо тиогруппы были исследованы последовательности-«якори» на основе аптамеров к наночастицам серебра. Аптамеры к серебряным наночастицам оказались эффективными на наших подложках. Оптимизирован способ нанесения на поверхность сенсоров: наиболее эффективна пред-сборка комплекса при комнатной температуре с последующей сорбцией на наноструктурированную поверхность. Данный подход будет в дальнейшем использован нами в работе по детекции биологических объектов как альтернатива тиомодифицированным олигонуклеотидам. Раздел 2. Создание прототипа аптасенсора к раковым клеткам. За основу был выбран ДНК-аптамер GR200, взаимодействие которого с EGFR (рецепторный белок клеток многих тканей человека, его суперэкспрессия характерна для рака эпителиальных тканей, легких и глиомы) и его мутантной формой EGFR vIII (экспрессируется только в некоторых раковых клетках глиомы и рака легких, его экспрессия коррелирует с агрессивностью опухоли) было исследовано ранее. Однако, длина аптамера GR200 достаточно велика – 50 нуклеотидов, а структурирование средней части олигонуклеотида неоднозначно, поскольку возможно несколько конкурирующих вторичных структур. Для оптимальной работы SERS-аптасенсора важен размер узнающего элемента и стабильность его конформации. В рамках данного проекта были предложены и изучены 5 укороченных модификаций ДНК-аптамера GR200. Все предложенные аптамеры имеют наномолярные константы диссоциации к EGFR и его мутантной формы EGFRvIII. При этом есть примеры уменьшения и увеличения аффинности. Во-первых, укорочение аптамера было достигнуто за счет укорочения дуплекса, образованного между 5’- и 3‘-концами аптамера с 10 пар нуклеотидов до 6-7 пар. Укорочение дуплекса не нарушило аффинность, поэтому конец дуплекса, видимо, не участвует в узнавании белка непосредственно. Это наблюдение позволило пропустить этап оптимизации места введения модификаций для SERS: можно использовать 5’- или 3‘-концы будут удачным местом для таких модификаций, поскольку модификатор не попадет в интерфейс комплекса. Изучена корреляция структура-функция для предложенных аптамеров. Аптамер можно укоротить на треть с сохранением его функциональности. При этом важно сосуществование 2 дуплексов, а жесткость структуры будет определять аффинность к EGFR vIII. Эта же серия аптамеров была протестирована на клетках линий рака человека. Выбор линий клеток. В качестве модельных объектов были выбраны линия с суперэкспрессией EGFR – эпидермальная линия А431, со средней экспрессией EGFR – нейральная линия U87 и линии с низкой экспрессией EGFR - HEK293 (из почек) и MCF7 (из молочной железы). Взаимодействие аптамеров с линиями клеток. На первом этапе была исследована способность разработанных ДНК-аптамеров связывать клетки разных линий. Эксперименты были проведены на аптамерах GR20, GREG4 и GREG5. Аптамер GR20 содержит нестабилизированный дуплекс. Аптамер GREG4 – содержит стабилизированный дуплекс, а аптамер GREG5 - содержит и стабилизированный дуплекс, и укороченные петли. Форма кривой аптамера GR20 указывает на наличие связывания, однако, не позволяет рассчитать константы. В отличие от GR20, аптамеры GREG4 и GREG5 имеют экспоненциальную форму кривой ассоциации, что позволяет рассчитать кинетические константы ассоциации. Еще один признак специфичности – близость платовых значений кривых, что наблюдается для аптамеров GREG4 и GREG5 и линии А431. Наиболее перспективен аптамер GREG4 – он наиболее аффинный к клеткам линии А431 с наибольшей экспрессией EGFR (кКд=0,19 фМ), менее аффинный к клеткам линии U87 со средним уровнем экспрессии EGFR (кКд=0,91 фМ) и на порядок менее аффинный к клеткам с низкой экспрессией EGFR – MCF7 (кКд=2,1 фМ) и HEK293 (кКд=1,1 фМ). Подбор SERS-сенсора, подходящий для высокочувствительной и специфичной детекции раковых клеток. В этом году мы успели провести опыты с линией клеток со средней экспрессией EGFR - клетки линии U87. Проводили эксперимент SERS (а) на подложках, (b) на подложках с коллоидами серебра, (c) с коллоидами серебра без подложек. Снимали спектр SEL (surface-enhanced luminescence) и SERS. Было обнаружено, что в ходе всех экспериментов удалось получить удовлетворительный сигнал SEL только на подложках без наночастиц или их агрегатов, однако из-за большого расстояния Cy3 метки от серебряных наноостровков спектр Cy3 не имеет SERS линий. На следующем этапе работы планируется модификация этой методики с целью получения характеристического SERS-спектра. Раздел 3. Создание наноструктурированных подложек для создания аптасенсоров Во время второго года выполнения проекта решались задачи по улучшению воспроизводимости свойств подложек и увеличению коэффициента усиления SERS-подложек за счет сдвига их плазмонного резонанса ближе к частоте зондирующего лазерного излучения и эффективному возбуждению входного (на частоте лазерного излучения) и выходного (на частоте рассеянного излучения) резонансов. Для этого SERS-подложки островкового типа были усовершенствованы за счет оптимизации режимов отжига подложек на плитке. При этом при каждом режиме отжига перебирался параметр толщины напыленного слоя серебра и золота (он варьировалась от 4 нм до 20 нм с шагом 1 нм), а также исследовалась подложка с комбинированным нанесением серебра толщиной 6 нм и золота толщиной 2 нм. Таким образом, в результате оптимизации процессов вакуумного термического напыления и режимов отжига подложки (после напыления) удалось создать SERS-структуру с коэффициентом усиления Рамановского рассеяния на порядок большим, чем у структуры, оптимизированной в конце первого года выполнения проекта. В ходе выполнения второго года проекта были исследованы свойства периодических диэлектрических структур SiO2, покрытых толстым слоем металла, которые позволяют усиливать сигнал оптического отклика более чем на восемь порядков при длине волны лазерного возбуждения 532 нм. Из зависимости сигнала от высоты столбиков (глубины травления) видно, что можно реализовать по крайней мере три геометрических резонанса, связанных с образованием стоячих плазмон-поляритонных волн в диэлектрических столбиках. Первый (основной) геометрический резонанс проявляется при h = 130 нм, второй при h = 255 нм, третий - при h = 400 нм. Эти три резонанса отвечают отношениям высоты к длине волны лазерного излучения 532 нм как: 1/4, 1/2 и 3/4. Следует заметить, что такой набор резонансов является довольно необычным. Проявление дополнительного резонанса при h/λ = 1/2 очевидно отвечает стоячей волне, которая образуется между двумя металлическими поверхностями, находящимися на верхней и нижней части столбиков. Этот случай отвечает симметричным граничным условиям и поэтому соотношение h/λ =1/2 является естественным результатом. Таким образом, в результате выполнения проекта удалось создать SERS-структуру с оптимальной реализацией диэлектрического и плазмонного резонансов с гигантским усилением Рамановского рассеяния на восемь порядков. Исследование свойств наночастиц серебра Положение, ширина, добротность, мультиплетность контура поверхностного плазмонного резонанса золей наночастиц серебра зависят от трех параметров: форма и размер частиц, а также химический состав поверхностного слоя. Сферические наночастицы размером от единиц до десятков нм имеют одну полосу поглощения шириной на половине высоты от 60 - 90 нм в области 400 - 420 нм. В области 530 нм поглощение этой полосы не превышает 15-20 % от максимума. Методом целенаправленного химического синтеза получены золи треугольных наночастиц серебра средним размером 35 нм, имеющий поглощение при 530 нм на уровне 80-85 % от максимального. Химическое модифицирование поверхности наночастиц серебра цистеамином позволяет смещать положение максимума поглощения в красную область и достигать высоких значений поглощения в области 530 нм. Величина дзетта-потенциала за границами диапазона [-30;+30] мВ соответствует высокой агрегационной устойчивости коллоидных систем, ±(10-30) мВ – умеренной стабильности, [-10;+10] мВ – свидетельствует о склонности наночастиц к агрегации. Таким образом, если дзетта-потенциал по абсолютной величине превышает 30 мВ, система может считаться агрегационно устойчивой.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В этом году были разработаны новые аптасенсоры для специфического определения вируса гриппа А. Использование наночастиц серебра в виде коллоидного раствора вместо напыленных наночастиц на твердотельные подложки позволило получить аптасенсор для количественного определения вируса гриппа А. В случае использования наночастиц, покрытых аптамерами с тиольной группой, удалось достигнуть предел обнаружения 2 10^5 VP/mL, а динамический диапазон составил 2∙10^5-2∙10^6 VP/mL. У разработанного ранее твердотельного аптасенсора предел обнаружения составлял 2∙10^4 VP/mL, что на порядок ниже, чем у коллоидных НЧ, однако, у твердотельного аптасенсора не было монотонной зависимости SERS от концентрации вируса. Дополнительная модификация аптасенсора позволила несколько расширить диапазон детектирования вируса гриппа за счет изменения цвета образцов, которое можно оценить спектрофотометрически. Изменение цвета образцов наблюдается при концентрациях вируса гриппа А 10^7-10^9 VP/mL. Таким образом, если совместить 2 способа оптической детекции – Рамановскую спектроскопию и спектроскопию в видимом диапазоне – возможно количественное определение вируса гриппа А в диапазоне 10^5-10^9 VP/mL. Этот подход представляется очень перспективным для быстрой детекции патогенных вирусов. Время анализа составляло не более 10 минут, включая пробоподготовку и измерение SERS. В качестве контрольных объектов были использованы вирус гриппа В и парамиксовирус. Оба вируса можно отличить от вируса гриппа А и с использованием Рамановской спектроскопии, и спектроскопии в видимом диапазоне. Полученные результаты не имеют аналогов в мире, поскольку удалось получить чувствительность выше, чем у тест-полосок с антителами при сравнимом времени, затрачиваемом на анализ. При этом в качестве узнающего элемента использован аптамер, связывающий разные штаммы вируса гриппа А, что позволяет не разрабатывать новый аптасенсор для новых штаммов (по данным на сегодняшний день, полученным исследованием взаимодействия аптамера с разными штаммами вируса гриппа А). Работоспособность аптасенсоров была исследована для разных биологических объектов (большая часть работ проведена для вируса гриппа А). Показано, что обнаружение вируса в мазке из носа не отличается по эффективности от обнаружения вируса в буфере. В концентрированных биологических жидкостях с большим количеством растворенных белков (плазма крови, сыворотка крови) происходит тушение SERS за счет неспецифического взаимодействия белков с наночастицами. Обнаружение вируса гриппа А требует разведения плазмы крови в 100-1000 раз, т.е. аптасенсор сможет обнаружить в крови лишь 10^7 VP/mL и более. Преодоление этого ограничения возможно с использованием магнитных частиц, покрытых аптамером к вирусу гриппа А. Комбинация концентрирования вирусных частиц c помощью магнитных частиц и коллоидного аптасенсора позволила снизить пределе обнаружения до 10^4 VP/mL. Таким образом, при необходимости чувствительность метода может быть улучшена за счет дополнительного концентрирования. Помимо практических задач была решена фундаментальная задача: мы выяснили какой элемент структуры аптамера к гемагглютинину (RHA0385) отвечает за высокоспецифичное узнавание гемагглютининов вируса гриппа А. Оказалось, что любой параллельный G-квадруплекс с тремя G-квартетами имеет аффинность как к рекомбинантному гемагглютинину, так и к вирионам гриппа А (работа проведена на штамме гриппа H5N1). Показано, что неканоническая структура аптамера находит сайт связывания на вирусном белке, отвечая за специфичность, а последовательности петель и фланкирующие участки влияют на селективность в отношении разных подтипов гемагглютининов. Этот результат – первый в мире пример неканонической структуры аптамера как основной детерминанты специфического узнавания белков с идентичной пространственной укладкой цепи, но низкой степенью идентичности последовательности. В этом году совместно с вирусологами Института полиомиелита был найден штамм вируса гриппа А, к которому аптамер RHA0385 имеет наибольшую аффинность из всех исследованных штаммов: A/FPV/Rostock/34 R6p (Н7N2). Константа диссоциации аптамера с вирусом была 7±3 фМ, что в пересчете на гемагглютинин составляет 3,6±1,6 пкМ. Аффинность к данному штамму на несколько порядков выше, чем к H5N1. Сейчас проводится сравнительный анализ штаммов со средней аффинностью (напр., H5N1) и с ультравысокой аффинностью (H7N2) для выяснения детерминант высокоаффинного связывания данного аптамера. Переходя к более сложному объекту, эукариотической клетке, а именно клетки линии рака кожи человека А431, были адаптированы подходы, разработанные для вирусов. В качестве аптамера к поверхностному рецептору (EGFR) был использован ДНК-аптамер GR200, разработанный нами ранее (10.1089/nat.2019.0830). Показано, что для работы с иммобилизованными клетками может быть получен SEL-аптасенсор, т.е. аптасенсор, работающий по принципу поверхностно усиленной люминесценции (флуоресценции). Для создания SERS-аптасенсора с возможностью количественного определения клеток, экспрессирующих EGFR, был использован подход с коллоидными наночастицами, который хорошо себя зарекомендовал с вирусами. Использование сэндвич-системы (комбинация аптамера с тиольными группами для иммобилизации на наночастицах, клетки и аптамера с SERS-активной меткой) дало монотонное специфическое изменение SERS в диапазоне 10^3-10^4 клеток в образце. Для определения большего содержания клеток, чем 10^4 клеток в образце, комплекс клеток А431 с аптамером GR200 был осажден магнитными частицами, покрытыми стрептавидином и биотинилированным аптамером GR200. Изменения SERS регистрировались в супернатанте, т.е. проводили определение остаточной концентрации меченного аптамера в пробе. В этом случае возможно определение количеств клеток 10^4-10^5 штук в пробе, т.е. на порядок больше, чем без отделения клеток. Образцы с концентрацией клеток более 10^5 штук в пробе имели желтую окраску. Комбинируя несколько приемов, можно работать в диапазоне концентраций 10^3-10^5 клеток в образце. Полученные данные уникальны и не имеют аналогов. Следующий объект – АМР, низкомолекулярное соединение, которое дает слабые SERS-сигналы. Присутствие АМР можно увидеть по SERS-спектру в концентрации 20 мкМ и выше по пику аденина при 734 см-1. Для увеличения чувствительности был разработан оригинальный аптасенсор с использованием аптамера к АМР. Структура данного аптамера содержит G-квадруплекс, однако, комплекс аптамера с АМР – шпилька с мисматчем без G-квадруплекса. Мы использовали соединение, специфически взаимодействующее с G-квадруплексами в качестве конкурента АМР за связывание с аптамером. Краска взаимодействует с одной конформацией олигонуклеотида, а АМР – с другой. Предложен аптасенсор, в котором аптамер иммобилизовали на серебряных наночастицах (коллоидные наночастицы), инкубировали с АМР, а затем добавляли краску к G-квадруплексам. АМР был детектирован уже при концентрации 200 нМ. Этот показатель несколько выше предела обнаружения, оценка предела обнаружения интерполяцией дает значение порядка 50 нМ. Аптасенсор позволяет дискриминировать пурины от пиримидинов, но также детектирует высокие (микромолярные) концентрации GMP. На этом объекте была получена чувствительность, сравнимая с лучшими аптасенсорами, опубликованными ранее. Однако, данный сенсор быстрее (менее 10 мин) и имеет динамический диапазон в 3 порядка, что как минимум на порядок больше, чем у ближайших аналогов (10.1039/C5AN01347J, 10.1002/adma.200602256, 10.1016/j.bios.2021.113196). Для лазерного возбуждения, лежащего в ИК-диапазоне, были созданы нанопериодические SERS-структуры, представляющие собой кварцевые квадратные столбики, запыленные толстым слоем металла. В таких периодических структурах плавная подстройка резонанса задается ее периодом, который должен быть примерно равен длине волны зондирующего излучения. Были созданы SERS-структуры с оптимальной реализацией диэлектрического и плазмонного резонансов с гигантским усилением (более 7 порядков) Рамановского рассеяния при длинах волн лазерного возбуждения 532, 633, 785 и 1064 нм – однородно-заполненные диэлектрическими квадратными столбиками высотой 130, 160, 190 и 250 нм (соответственно) с периодом 500, 600, 750 и 1000 нм (соответственно) и толщиной серебряного слоя 40, 50, 60 и 80 нм (соответственно). Была создана двухзонная SERS-подложка с воспроизводимым коэффициентом усиления по всей площади SERS-активных зон. Одна зона предназначена для контрольных опытов, а вторая – для исследуемых образцов. На разработанных подложках поверхность представлена крупными (порядка 50 нм) изолированными наночастицами серебра с хорошими адгезивными свойствами, что позволяет использовать подложки при работе в различных буферных средах. SERS-активная поверхность подложки выдерживала длительную сорбцию в фосфатных и цитратных буферах, использующихся в экспериментах по создания оптического аптасенсора. Выработаны технические требования к раман-люминесцентному анализатору и программному обеспечению для проведения быстрого диагностического теста по выявлению различных биологических структур полным «сэндвич-методом».