Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Реорганизация клеточных покровов динофлагеллят (в т.ч. экдизис) в ответ на внешние воздействия – уникальный и малоизученный процесс, представляющий интерес как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения. В частности, реорганизация покровов этих водных микроорганизмов имеет значение для различных аспектов ведения аквакультуры. Основной целью нашего проекта является характеристика реорганизации покровов и механизмов, запускающих ее, с помощью методов клеточной биологии. На основании полученных результатов будут даны рекомендации по выращиванию динофлагеллят и контролю их численности в аквакультурных хозяйствах. В 2018-2019 гг. проведена работа, представляющая собой важный задел для успешного выполнения проекта. Основные результаты, полученные в отчетный период: (1) Подготовлена обзорная статья, посвященная анализу данных о взаимосвязи инцистирования динофлагеллят и масштабной перестройки их клеточных покровов (амфиесмы), в том числе экдизиса. В рамках обзора обобщены доступные на сегодняшний день сведения о клеточных процессах, сопровождающих формирование и развитие цист динофлагеллят, что послужит основой для анализа данных, полученных в ходе выполнения настоящего проекта, а также при планировании дальнейших работ по проекту. Matantseva O. 2019. Cellular mechanisms of dinoflagellate cyst development and ecdysis - many questions to answer. Protistology. 13 (2), 47–56 doi: 10.21685/1680-0826-2019-13-2-1 (2) В ходе экспериментов с культурой армированных динофлагеллят P. minimum показано, что механический стресс (центрифугирование), понижение температуры до 0 градусов Цельсия, воздействие 2,3-дихлорбензонитрила, повышение и понижение солености на 15 промилле влекут за собой статистически значимый рост уровня экдизиса в культуре динофлагеллят P. minimum CCAP 1136/16. Интересно, что воздействие тетрациклина снижает уровень экдизиса по сравнению с контролем. Эта неожиданная находка нуждается в дополнительной экспериментальной проверке. В связи с этим запланировано проведение дополнительных экспериментов, в том числе по изучению комбинированного воздействия тетрациклина и механического стресса, что может иметь практическое значение для выращивания динофлагеллят в качестве ценного питательного ресурса при ведении аквакультуры. Установлено, что внешние стрессовые факторы приводят к масштабным структурным изменениям клеточных покровов динофлагеллят сразу после воздействия, при этом жизнеспособность клеток после исследованных воздействий сохраняется. На ультраструктурном уровне продемонстрировано слияние внутренних мембран амфиесмальных пузырьков, сбрасывание старой плазматической мембраны и наружных мембран амфиесмальных пузырьков сразу после центрифугирования, а также последующее сбрасывание целлюлозных текальных пластин и формирование новой амфиесмы. Показано образование ювенильных амфиесмальных везикул в кортикальной области цитоплазмы и закладка новых тонких текальных пластин в процессе реорганизации клеточных покровов. (3) На основании ультраструктурных данных сделан вывод о том, что клеточные покровы неармированных динофлагеллят также подвержены реорганизации под воздействием факторов окружающей среды. Показано, что после центрифугирования нарушается целостность плазматической мембраны и наружных мембран амфиесмальных пузырьков у клеток неармированных динофлагеллят Amphidinium carterae. При этом, как и у армированных видов, происходит формирование новой плазматической мембраны путем слияния внутренних мембран амфиесмальных пузырьков. Также в аморфном слое цитоплазмы, расположенном под новой плазматической мембраной, наблюдается формирование ювенильных амфиесмальных пузырьков. Выдвинуто предположение об отсутствии особого слоя амфиесмы, характерного для многих динофлагеллят, – пелликулы – у представителей рода Amphidinium. На основании впервые полученных данных о перестройке покровов неармированных динофлагеллят A. carterae в ответ на механическое воздействие подготовлена и принята к печати в журнале Protistology статья. Berdieva M., Safonov P. and Matantseva O. 2019. Ultrastructural aspects of ecdysis in the dinoflagellate Amphidinium carterae. Protistology. (4) Протестированы ранее полученные антитела против транспортеров нитрат-ионов NRT2.1 и мочевины DUR3. С помощью окрашивания антителами показано в целом равномерное распределение транспортеров питательных соединений в плазматической мембране нативных клеток динофлагеллят P. minimum, т.е. клеток, не подвергавшихся воздействиям, вызывающим реорганизацию покровов. Примечательно, что антителами против NRT2.1 наиболее ярко окрашивается район жгутикового кармана, что подтверждается визуализацией корешкового аппарата жгутиков и отсутствием окрашивания целлюлозы в этой области. Данный факт свидетельствует в пользу предложенной нами ранее гипотезы о том, что жгутиковый карман играет важную роль в питании динофлагеллят, имеющих сложно устроенные клеточные покровы, которые могут затруднять транспорт питательных соединений в клетку (Kalinina et al., 2018). (5) Отработан протокол фиксации клеток динофлагеллят с целью окрашивания антителами, мечеными коллоидным золотом, для дальнейшего исследования локализации белков в клетках динофлагеллят на ультраструктурном уровне методами трансмиссионной электронной микроскопии. (6) Получена РНК клеток P. minimum, находящихся в процессе индуцированной центрифугированием реорганизации клеточных покровов, а также нативных клеток этих динофлагеллят. В настоящее время производится секвенирование образцов в Автономной некоммерческой образовательной организации высшего образования «Сколковский институт науки и технологий». Начат анализ транскриптомов нативных клеток клонов динофлагеллят P. minimum из базы данных проекта Marine Microbial Eukaryote Transcriptome Sequencing Project (MMETSP), которые послужат в качестве референсных при сборке секвенированных транскриптомов модельной культуры CCAP1136/16, используемой в данном проекте.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном периоде обобщены данные о спектре и силе воздействия факторов, вызывающих реорганизацию клеточных покровов у динофлагеллят Prorocentrum minimum. На основании этих данных, а также данных об ультраструктуре экдизирующих клеток, полученных с помощью просвечивающей электронной микроскопии (transmission electron microscopy, TEM), сделан вывод о том, что у P. minimum как инцистирование, так и эксцистирование осуществляются посредством экдизиса: сбрасывание старой плазматической мембраны и внешней мембраны амфиесмальных пузырьков приводит к формированию временной цисты, не имеющей пелликулы и защищенной старыми текальными пластинами, а выход из текальных пластин – к возвращению клетки в вегетативное состояние. У прочих динофлагеллят временная циста формируется в результате полностью пройденного экдизиса и имеет пелликулярный слой. По-видимому, особый способ формирования временных цист у пророцентроидных динофлагеллят связан с их крупными текальными пластинами, способными выполнять защитную функцию вместо пелликулы. Кроме того, исследовано влияние бактериостатического антибиотика тетрациклина на естественный уровень экдизиса в культурах динофлагеллят, а также на уровень экдизиса, индуцированного механическим стрессом. Продемонстрировано, что размер и форма клеток динофлагеллят зависят от типа источника азота в среде. Полученные данные будут учтены при интерпретации результатов измерений размера и формы клеток после прохождения реорганизации клеточных покровов. С помощью иммуноцитохимического окрашивания целых клеток и срезов клеток динофлагеллят исследована локализация транспортеров ионов нитрата NRT2.1 в клетках, находящихся на различных этапах реорганизации амфиесмы. Показано, что транспортеры NRT2.1 распределены по плазматической мембране нативных клеток, а также находятся в небольших цитоплазматических везикулах, вероятно, представляющих собой запас транспортеров, который необходим для формирования новой функциональной мембраны в случае инициации экдизиса. После начала реорганизации клеточных покровов число цитоплазматических везикул, несущих транспортеры NRT2.1, возрастает, особенно в кортикальном слое цитоплазмы; при этом транспортеры выявляются и в новой плазматической мембране. По мере прохождения экдизиса, распределение транспортеров нитрата NRT2.1 возвращается к паттерну, характерному для нативных клеток динофлагеллят. На важную роль везикулярного транспорта в процессе реорганизации клеточных покровов указывают и результаты экспериментов по влиянию веществ-ингибиторов функционирования цитоскелета на уровень экдизиса в культурах. В наших экспериментах блокатор полимеризации актина цитохалазин Д значительно снижал уровень экдизиса, а блокатор полимеризации микротрубочек нокодазол и ингибитор функционирования миозина 2,3-бутандион монооксим задерживали прохождение экдизиса у P. minimum. Протестированы антитела против ионных каналов, управляемых циклическими нуклеотидами, и Na+/K+-АТФазы, нобходимые для исследования локализации этих мембранных белков во время реорганизации клеточных покровов. Произведена сборка и аннотация транскриптомов нативных клеток динофлагеллят и клеток, претерпевающих экдизис. Показано, что по сравнению с нативными клетками у клеток в процессе экдизиса снижена экспрессия более 4000 тысяч генов и повышена экспрессия более 5000 генов. Среди дифференциально экспрессирующихся генов наибольшее внимание обращают на себя категории генов, гомологичных охарактеризованным генам других организмов, связанным с дыханием и фотосинтезом (экспрессия снижена во время реорганизации клеточных покровов), а также с трансмембранным транспортом питательных веществ, устойчивостью к тяжелым металлам и мейозом (экспрессия повышена во время реорганизации покровов). Изучено поглощение питательных субстратов – ионов нитрата и бикарбоната – клетками P. minimum, находящимися на различных стадиях реорганизации клеточных покровов. Для этого проведены эксперименты, в которых клетки инкубировали с субстратами, мечеными тяжелыми стабильными изотопами азота и углерода, а также разработан подход к изучению одних и тех же отдельных клеток динофлагеллят методами TEM и масс-спектрометрии вторичных ионов в наномасштабе (nanoscale secondary ion mass spectrometry, NanoSIMS). В рамках этого подхода клетки фиксировали и заключали в смолу, после чего делали смежные срезы толщиной 100-120 нм. Из каждой пары смежных срезов один срез помещали на никелевую сетку для последующего исследования ультраструктуры клеток методом TEM, а второй срез – на подложку из оксида цинка для последующего определения изотопного состава клеток (отражает в том числе поглощение питательных субстратов клетками) методом NanoSIMS. С целью проведения анализа NanoSIMS предпринята командировка в Институт исследований Балтийского моря, Германия. Отработано измерение изотопного состава срезов клеток методом NanoSIMS, а также сопоставление данных NanoSIMS и TEM, позволяющее точно установить стадию реорганизации покровов, на которой находились анализируемые клетки в момент фиксации, и идентифицировать субклеточные структуры с необычным изотопным составом. Установлено, что как сразу после инициации экдизиса, так и на более поздних его этапах клетки продолжают потреблять источники азота и углерода. При этом поглощенные азот и углерод распределены по клеткам неравномерно: в объеме клеток, претерпевающих экдизис, наблюдаются отдельные зоны с высоким содержанием вновь поглощенных азота и углерода. В частности, у клеток, готовящихся к выходу из текальных пластин, наблюдается обогащение тяжелыми изотопами углерода в области сутур – мест смыкания двух текальных пластин, что подтверждено данными TEM. На основании полученных результатов за отчетный период подготовлено три статьи для рецензируемых журналов и сделано два доклада на VIII Европейском протистологическом конгрессе, проходившем 28 июля-2 августа 2019 г. в Риме, Италия.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном периоде продолжены работы по выявлению роли везикулярного транспорта в реорганизации клеточных покровов динофлагеллят Prorocentrum cordatum, исследованию дифференциальной экспрессии генов, локализации мембранных транспортеров и поглощения питательных субстратов на разных этапах этого процесса. Эксперименты с добавлением в культуральную среду блокатора антероградного везикулярного транспорта брефельдина А показали, что динофлагелляты P. cordatum хорошо переносят добавление брефельдина А в концентрациях, не превышающих 0.5 мкг/мл. Кроме того, экспериментально было доказано, что брефельдин А проявляет свою активность в отношении динофлагеллят P. cordatum, вызывая дезорганизацию комплекса Гольджи в клетках после их обработки этим веществом в концентрации 0.1 мкгмл в течение 1 ч. Эксперименты по выявлению роли везикулярного транспорта в процессе экдизиса показали, что обработанные брефельдином А клетки с дезинтегрированным комплексом Гольджи вступали в индуцированный экдизис так же, как и контрольные клетки: сразу после центрифугирования при 4500 g в течение 5 мин свыше 90% таких клеток сбрасывало плазматическую мембрану и внутреннюю мембрану амфиесмальных пузырьков, становясь текальными цистами. Более того, вторая стадия экдизиса - выход из текальных пластин - также осуществлялась без статистически значимых отличий от контрольных клеток. При этом смертность в культуре, обработанной брефельдином А, не отличалась от контрольной через 0 и 4 ч после центрифугирования и лишь на несколько процентов превышала таковую через 24 ч. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что функционирование антероградного везикулярного транспорта на участке от ЭПР до комплекса Гольджи и плазматической мембраны не является обязательным не только для инициации реорганизации покровов, но и для выхода из текальных пластин. Тем не менее, можно предполагать, что нормальное созревание новой плазматической мембраной и амфиесмы в целом должно быть cущественно затруднено при заблокированном антероградном везикулярном транспорте. Таким образом, клетки, покинувшие старые текальные пластины, вероятнее всего, имеют незрелую амфиесму. Исследование дифференциальной экспрессии генов во время реорганизации клеточных покровов у динофлагеллят путем анализа транскриптомных данных показало, что по сравнению с нативными клетками в клетках, находящихся в процессе экдизиса (текальных цистах) снижена экспрессия 166 генов, вовлеченных в процесс фотосинтеза, в первую очередь, генов, кодирующих компоненты фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Также в значительной степени снижена экспрессия генов, вовлеченных в клеточное дыхание, в том числе компонентов дыхательной цепи митохондрий. В случае генов, экспрессия которых была повышена, наиболее подверженной изменениям оказалась экспрессия генов, вовлеченных во внутриклеточную сигнализацию и ионный транспорт, генов элементов цитоскелетной системы и моторных белков, трансмембранных транспортеров, генов, участвующих в транскрипции и трансляции, а также половом процессе, синтезе и метаболизме мембранных липидов и белков, деградации сложных полимерных углеводов, синтезе целлюлозы и других бета-глюканов, а также генов, вовлеченных в клеточный ответ на стресс. В целом, данные об изменениях в экспрессии генов, сопровождающих формирование текальных цист P. cordatum в процессе экдизиса, свидетельствуют о том, что, с одной стороны, текальные цисты имеют черты других типов цист динофлагеллят, такие как подавление дыхания и фотосинтеза, то есть интенсивность некоторых клеточных процессов в них ожидаемо снижена. С другой стороны, повышенная экспрессия свыше чем 5000 генов говорит о том, что такие цисты далеки от "спящего" состояния, а метаболические процессы в них чрезвычайно интенсивны. Паттерн экспрессии генов показывает масштабность реконструкции мембранной системы клеток и огромную роль цитоскелета в этом процессе. Транскриптомные данные позволили выявить сигнальные пути, вовлеченные в процесс реорганизации клеточных покровов. По-видимому, основную роль играют кальций-зависимый сигналинг и сигнальные пути MAPK. Кроме того, обращает на себя внимание набор генов, связанных с подавлением сигнальных путей, которые регулируются фитогормоном абсцизовой кислотой. Данные по экспрессии генов, полученные методами количественной ПЦР в режиме реального времени и иммуноблоттинга, подтверждают результаты транскриптомного анализа. Были завершены эксперименты по поглощению питательных веществ клетками динофлагеллят, находящимися на различных стадиях реорганизации амфиесмы. Анализ полученных данных показал, что текальные цисты P. cordatum (клетки, претерпевающие экдизис) не только поглощают питательные вещества, но и делают это с более высокой скоростью, чем вегетативные клетки динофлагеллят. Детальный анализ отдельных клеток подтвердил, что все цисты, окруженные старыми текальными пластинами, имеют повышенное обогащение тяжелыми изотопами углерода на полюсах клеток, соответствующих зонам смыкания текальных пластин, и по периметру клеток. Вероятно, оно отражает процесс, необходимый для выхода клетки из старых текальных пластин и, возможно, связанный с организацией цитоскелета, или синтез новой целлюлозы. На основании обобщения данных, полученных на всех этапах выполнения проекта, была создана концептуальная модель реорганизации клеточных покровов динофлагеллят, которая позволила сделать рекомендации не только по масштабному культивированию динофлагеллят и преодолению ограничений, связанных с воздействием механического стресса, но и предложить способы борьбы с цветениями опасных динофлагеллят в зонах аквакультуры, особенно в закрытых и полузакрытых системах (Matantseva al., 2021). С одной стороны, ограничения масштабного культивирования динофлагеллят, связанные с перемешиванием культур в биореакторах, могу быть преодолены выявлением границ толерантности значимых видов к механическому воздействию и применением способов перемешивания, вызывающих минимальное трение клеток о жидкую среду. С другой стороны, стресс-индуцированный экдизис может быть эффективно использован для сдерживания роста динофлагеллят во время цветений. Наиболее перспективным в этом отношении является механических стресс, поскольку он не будет оказывать значимого воздействия на организмы, культивируемые в аквакультуре (рыба, моллюски и т.д.), а также на другие компоненты экосистемы, в отличие от химических, вирусологических и подобных им методов, применяемых для борьбы с цветениями в настоящее время. Механический стресс может быть обеспечен периодическим перемешиванием специальными помпами. Важно отметить, что искусственное перемешивание в аквакультуре уже применялось в других целях. Для внедрения предложенного метода в практику необходимы дополнительные исследования, призванные определить параметры перемешивания и доказать безопасность данного метода для других компонентов экосистемы. Кроме того, созданная нами модель реорганизации клеточных покровов позволила охарактеризовать потенциальную роль этого процесса в динамике популяций динофлагеллят, а также формировании и терминации их цветений. Тот факт, что текальные цисты метаболически активны и способны к поглощению питательных веществ, должен учитываться в биогеохимических моделях, особенно в случае, если текальные цисты широко распространены в природных экосистемах. Помимо высокой активности в отношении поглощения питательных субстратов, цисты характеризуются неподвижностью, в результате чего они могут попадать в более глубокие слои воды с большей концентрацией питательных субстратов, а при возвращении в верхние слои и прорастании цист такие клетки могут привносить в них новый азот и углерод. Прорастание цист, которые приобрели запас питательных субстратов в глубоких слоях воды, после возвращения в фотический слой, например, в результате апвеллинга, может быть одной из причин инициации вредоносных цветений, в то время как индуцирование экдизиса в результате штормовой активности может приводить к их завершению. По результатам проекта в отчетном периоде было подготовлено 2 статьи в журнал Protistology (Q3), а также статья в журнал Q1. lya Pozdnyakov, Mariia Berdieva, Vera Kalinina, Sofia Pechkovskaya and Olga Matantseva (2021) Brefeldin A disturbs Golgi complex integrity but does not impair ecdysis in the dinoflagellates Prorocentrum cordatum. Protistology (Q3, принята в печать) Olga Matanseva, Mariia Berdieva, Vera Kalinina, Sofia Pechkovskaya, Pavel Safonov and Ilya Pozdnyakov (2021) Sensitivity of dinoflagellates to mechanical stressors as potential target to control harmful blooms in aquaculture. Protistology (Q3, принята в печать) Olga Matantseva, Ilya Pozdnyakov, Anna V. Klepikova, Mikhail I. Schelkunov, Pavel Safonov, Mariia Berdieva and Sergei Skarlato (2021) A transcriptomic study reveals high metabolic activity in thecate cysts of the dinoflagellate Prorocentrum cordatum. New Phytologist (Q1, подана)