Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе реализации проекта была разработана процедура выделения митохондрий из летательных мышц пчел (Аpis mellifera L.). Нами была установлена наиболее оптимальная схема измельчения и гомогенизации тораксов пчел. Необходимо использовать гомогенизатор типа Dounce (стеклянный стакан – стеклянный пестик) объемом 15 мл с пестиком, который свободно перемещался (“loose pestle A”, величина зазора 0.1-0.18 мм). Кроме того, необходимо использовать сахарозную среду. Установлена скорость дыхания митохондрий пчел при использовании различных субстратов. Наибольшая скорость дыхания в отсутствии ADP наблюдалась при дыхании с использованием FADH2-зависимого субстрата – α-глицерофосфата (357.97±44.7 нмоль/мин/мг белка). Наибольшее значение дыхательного контроля было отмечено при использовании в качестве субстрата для дыхания пирувата (12.71±2.5), и при использовании комбинации пирувата с глутаматом (9.67±1.34), с пролином (8.62±1.7) и малатом (8.33±1.5). При тестировании классических ингибиторов ЭТЦ митохондрий: ротенон, антимицин, цианид, миксотаизол и азид нами не были найдены существенные отличия в механизмах их действия по сравнению с классическими объектами исследования митохондрий – митохондрии печени и сердца крыс. При тестировании действия пестицидов (дельтаметрин, имидоклоприд, метрибузин, эсфенвалерат, дифеноконазол, пенконазол, малатион, ротенон, дитианон и циперметрин) на скорость дыхания митохондрий было установлено, что наиболее сильными ингибиторами митохондриального дыхания на NADH-зависимых субстратах являются ротенон, дифеноконазол и дитианон. Стоит отметить, что остальные пестициды, кроме имидоклоприда, в максимально возможных физиологических концентрациях также частично ингибировали дыхание на NADH-зависимых субстратах. В подтверждении измерению скорости дыхания мы показали, что изолированные митохондрии пчел формируют устойчивый мембранный потенциал, который разобщается за счет добавления 2,4-ДНФ и СССР. Добавление ротенона, антимицина, миксотиазола, цианида и азида при дыхании митохондрий на NADH-зависимых субстратах полностью блокировало формирование мембранного потенциала вследствие их ингибиторного действия на дыхание митохондрий. Стоит отметить, что при использовании сукцината в качестве субстрата мембранный потенциал не образовался. При тестировании влияния пестицидов на мембранный потенциал не были установлены разобщители митохондриального дыхания. Мы обнаружили, что наибольшая продукция H2O2 (в процентном отношении от скорости потребляемого кислорода) при отсутствии ADP наблюдается при дыхании субстратов, имеющих в составе малат. При дыхании только на малате 2.6±0.5% потребляемого O2 превращается в H2O2. Также большое количество H2O2 продуцируется на пируват-индуцированном дыхании – 1.8±0.2% и дыхании на α-глицерофосфате – 2.6 ± 0.5%. При фосфорилирующем дыхании (в присутствии ADP) при дыхании на всех NADH-зависимых субстратах значительно сокращается доля продуцируемой H2O2. Целостные митохондрии летательных мышц пчел практически не способны окислять ди- и трикарбоновые кислоты, что свидетельствует о чрезвычайно низкой (или полностью отсутствующей) активности ди- и трикарбоксилатного переносчика во внутренней мембране митохондрий. Было обнаружено, что митохондрии пчел не способны поглощать Ca2+. В ответ на добавление Ca2+ происходит увеличение флуоресценции CaGr, но не происходит последующего снижения флуоресценции, которое соответствовало бы поглощению Ca2+ митохондриями. Соответствующие данные были получены и при измерении мембранного потенциала. Добавление экзогенного Ca2+ к интактным митохондриям пчел не приводило к изменению мембранного потенциала. При исследовании влияния широко применяемых пестицидов на смертность шмелей нами было выбрана система оценки токсичности, которая заключается в контактном действии пестицидов. ЛД50 составило: дельтаметрин – 0,0021%; имидоклоприд – 0,0004%; метрибузин – свыше 0,1%; эсфенвалерат – 0,0008%; дифеноконазол – 0,006%; пенконазол – 0,08%; малатион – 0,002%; ротенон – 0,09%; дитианон – свыше 0,1%; циперметрин – 0,0042%. Таким образом, для шмелей наиболее опасными являются имидоклоприд и эсфенфалерат. Следует избегать обработки данными пестицидами сельскохозяйственных растений, которые опыляются шмелями. Была исследована генотоксичность пестицидов. Мы подобрали 3 пары праймеров, которые амплифицируют три протяженных фрагмента мтДНК Bombus terrestris для оценки количества повреждений. Мы установили, что оптимальная температуры элонгации составляет 66ºС. Для валидации данного метода мы индуцировали повреждения мтДНК за счет добавления пестицидов к изолированным митохондриям в присутствии дыхательных субстратов. Мы показали, что ротенон вызывает наиболее сильные повреждения мтДНК, в меньшей степени повреждения вызывало добавление дитианона. Дифеноконазол вызывал значительные повреждения, однако, только в 1 и 3 фрагментах. Следующим этапом являлось определение генотоксичности пестицидов после их попадания на поверхность тела шмеля. Среди ингибиторов комплекса I ЭТЦ только ротенон стабильно повреждает все три митохондриальных фрагмента. Дифениканозол повреждал главным образом только 3 фрагмент мтДНК, в то время как в остальных фрагментах статистически достоверных различий по сравнению с контролем не было найдено. Дитианон приводил к статистически достоверному увеличению количества повреждений мтДНК во 2 и 3 фрагменте. Удивительным выглядит тот факт, что ряд пестицидов, таких как малатион, пенконазол, имиодоплоприд вызывают снижение количества повреждений во всех фрагментах мтДНК по сравнению с контролем. Мы можем предположить, что данные пестициды могут специфически повреждать те фрагмента мтДНК, которые не покрываются нашей панелью праймеров. В результате этого происходит расслабление суперспиральной конформации мтДНК, что приводит к тому, что Encyclo-полимеразе проще связываться с мтДНК, в результате этого упрощается амплификация фрагмента. По этой причине при пересчете мы наблюдаем отрицательное количество повреждений. Другой вероятной причиной расслабления суперспиральной конформации мтДНК является активация процессов митохондриального биогенеза. Во время репликации мтДНК находится в более расслабленном состоянии, что так же может приводить к ложному «сокращению» количества повреждений мтДНК. Для доказательства данного предположения мы с помощью количественной ПЦР измерили уровень мтДНК (количество копий) относительно ядерной ДНК. Действительно, малатион, имиодоплоприд, пенконазол и метребузин вызывали увеличение количества копий мтДНК. Для всех остальных пестицидов не было выявлено увеличения количества копий митохондрий, за исключением дельтаметрина. Другим важным аспектом, который влияет на полетную активность является центральная нервная система шмеля. Мы протестировали ряд пестицидов, вызывающих наибольшую смертность шмелей, и обнаружили, что данные пестициды сильно повреждают первый фрагмент мтДНК в головах насекомых. Дифеноконазол, эсфенвалерат и малотион повреждают второй фрагмент мтДНК. Окисление имидазольного кольца пуриновых оснований также подвержена окислительным повреждениям в результате чего образуются 8-oxoA 8-oxoG. Для индукции разрыва цепи ДНК в месте 8-oxoG мы использовали фермент FPG, который специфичен к данной модификации гуанина. Ни для одного из пестицидов не было выявлено увеличение количество повреждений по сравнению с ДНК, не обработанной FPG. Кроме того, в ходе первого года реализации проекта было разработано устройство для автоматической регистрации полетной активности шмелей и пчел.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Нами были продолжены исследования по изучению генотоксичности пестицидов для насекомых-опылителей. С помощью разработанного в первый год реализации проекта метода нами была дополнительно протестирована группа пестицидов, которые имеют мишени в митохондриях, а также вновь синтезированные пестициды – синтетические пероксиды. Показано, что группа митохондриальных пестицидов вызывает меньшее количество повреждений мтДНК, чем группа пестицидов широко спектра действия, исследованная нами в течение 1 года реализации проекта. Среди синтетических пероксидов не было выявлено увеличение количества повреждений мтДНК. Ни один из пестицидов статистически достоверно не снижал активность ключевых ферментов катаболизма насекомых-опылителей. Тенденция к ингибированию активности сукцинатдегидрогеназы и цитратсинтазы была показана только для шмелей, употреблявших сироп с добавлением митохондриально-направленных пестицидов. При исследовании влияния пестицидов на полетную активность было выявлено, что шмели, которые контактировали с фунгицидами дифеноконазолом и пенконазолом снизили полетную активность в 1,4 и 1,3 раза соответственно. Инсектицид имидоклоприд в сублетальных концентрациях снизил полетную активность в 2,8 раза. Наибольший эффект на полетную активность показал эсфенвалерат, после контакта шмелей с этим инсектицидом в сублетальных дозах полетная активность шмелей снизилась в 12,5 раз. После контакта шмелей с циперметрином и дельтаметрином полетная активность шмелей также снизилась в 2,2 и 2,7 раза соответственно. Дитианон, малатион, ротенон и метрибузин не вызвали статистически значимого снижения полетной активности шмелей по сравнению с контролем. На следующем этапе нами было исследовано влияние 10 новых потенциальных пестицидов, включая 7 синтетических циклических пероксидов. Было установлено, что синтетические пероксиды не снижают скорость дыхания митохондрий летательных мышц шмелей и пчёл. Новые пестициды, имеющие группу –CN в структуре, незначительно снижали скорость дыхания митохондрий. Один из таких пестицидов (1-methyl-2,5-dithiocyanato-1H-pyrrole) приводил к снижению скорости продукции активных форм кислорода на 16% в митохондриях летательных мышц пчёл и на 21% в митохондриях летательных мышц шмелей, а также приводил к незначительному снижению мембранного потенциала. Другие пестициды не привели к изменению мембранного потенциала митохондрий летательных мышц шмелей и пчёл. В целом, синтетические пероксиды не оказали какого-либо влияния на биоэнергетические параметры митохондрий летательных мышц шмелей и пчёл. Нами было оценено влияние новых пестицидов на уровень смертности шмелей (ЛД50). Было установлено, что (1s,4s)-7-hexyl-1,4-dimethyl-2,3,5,6-tetraoxabicyclo[2.2.1]heptane имеет ЛД50 при концентрации пестицида в растворе равной 0,42%. (1s,4s)-7-adamant-1-yl-1,4-dimethyl-2,3,5,6-tetraoxabicyclo[2.2.1]heptane имел ЛД50 равной 0,54%. Пестицид 1-methyl-2,5-dithiocyanato-1H-pyrrole имел ЛД50 равной 0,11%. Для остальных пестицидов ЛД50 составило свыше 1%. Таким образом, можно утверждать, что новые пестициды в максимально возможных физиологических концентрациях не вызывают гибель шмелей. Также нами было оценено влияние новых пестицидов на скорость дыхания шмелей и величину дыхательного коэффициента. Дыхательный коэффициент в контрольной группе шмелей составил 0.94. При контакте шмелей с пестицидами дыхательный коэффициент не менялся. После контакта шмелей с пестицидами мы также не наблюдали снижение общей скорости дыхания шмелей. Более того, после контакта с тремя пестицидами из группы синтетических пероксидов наблюдалось небольшое повышение скорости дыхание. Возможно, повышение скорости дыхания шмелей связано с активацией окислительного метаболизма шмелей при действии на них циклических пероксидов. В ходе проведения экспериментов было выявлено, что синтетические пероксиды, а также два непероксидных пестицида не снижали полетной активности шмелей. Однако полетную активность шмелей на 24% снизило вещество 1-methyl-2,5-dithiocyanato-1H-pyrrole из группы новых пестицидов. Была оценена возможность применения синтетических пероксидов для лечения грибковой болезни шмелей и пчёл – аскофероза (возбудитель Ascosphaera apis). Было выявлено, что два пестицида – синтетического пероксида в концентрации 0,03% ингибировали рост патогенного гриба на 100%. Таким образом, эти синтетические пероксиды являются потенциальными агентами для лечения аскофероза шмелей и пчёл, которые при этом безопасны для насекомых-опылителей. При проведении сравнительного анализа была обнаружена положительная корреляция между полетной активностью и скоростью митохондриального дыхания для эсфенвалерата (rs=0,38, p<0,05) и дельтаметрина (rs=0,51, p<0,05). Также были установлены отрицательные корреляции между уровнем повреждений мтДНК и полетной активности для пеноканозола (p= -0.31, p<0.05), дельтаметрина (rs= -0,42, p<0,05) и имидоклоприда (rs= -0,37, p<0,05). С помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Ion torrent PGM в кишечнике шмелей были идентифицированы бактерии: Lactobacillus apis, Cutibacterium acnes, Peptostreptococcus russellii, Noviherbaspirillum massiliense, Bombiscardovia coagulans, Devosia albogilva, Bifidobacterium commune, Nocardioides soli, Brevundimonas bacteroides, Rheinheimera mesophila, Limnobacter thiooxidans, Empedobacter falsenii. При кормлении пестицидами нами не было отмечено статистически значимого отклонения в относительной обильности бактерий в кишечнике шмелей. Наблюдалось общее сокращение «ридов» секвенирования (на 22%) в кишечнике шмелей, которые потребляли сироп с пестицидом №7 (1-methyl-2,5-dithiocyanato-1H-pyrrole), что свидетельствует об общем сокращении биомассы бактерий в кишечнике шмелей. Отсутствие негативного действия новых пестицидов на бактерий было подтверждено нами на культурах грамположительных и грамотрицательных бактерий in vitro. Этим объясняется отсутствие влияния новых пестицидов на микробиом шмелей. Таким образом, новые пестициды избирательно действуют на эукариотические микроорганизмы, что позволяет их применять в качестве фунгицидов. В завершении нами был разработан биологический тест для анализа остаточных токсических веществ в тепличных неорганических субстратах с помощью микроколоний шмелей. Нами было установлено, что наиболее объективным показателем токсичности субстратов являлся индекс развития расплода. Была разработана балльная система оценки, основанная на скорости развития шмелей, а также смертности взрослых шмелей и личинок. Сумма баллов, набранных при тестировании, служит оценкой степени токсичности испытуемого субстрата. Разработанный метод позволит оценивать степень токсичности неорганических субстратов в крупных тепличных комбинатах для оптимизации опылительной активности насекомых. Запланированные задачи на 2 год реализации проекта выполнены в полном объеме. По итогам второго года реализации проекта опубликовано 3 статьи, индексируемые в Web of Science и Scopus; 1 статья входят в первый квартиль (Q1).