Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На первом этапе перед нами была поставлена задача создания штаммов бактерий-мишеней, используемых в дальнейшем в качестве репортерных штаммов для детекции антибиотической активности индивидуальных представителей бактериальных сообществ. Для этого в качестве модельных бактерий-репортеров были использованы штаммы грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, а также грамотрицательных Escherichia coli и дрожжевых клеток Pichia pastoris. Наиболее принципиальным моментом на данном этапе для нас являлось создание пары бактерий-репортеров, позволяющих детектировать антибактериальную активность как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий. Основными критериями для нас были интенсивность флуоресценции зеленого флуоресцентного белка (GFP), продуцируемого модельным микроорганизмом, а также узкое распределение клонов микроорганизмов по флуоресценции. В ходе реализации проекта созданы рекомбинантные репортерные штаммы грамположительных бактерий S. aureus и грамотрицательных E. coli, обладающих требуемым уровнем интенсивности и монодисперсности распределения капель по флуоресценции. Был проведен отбор микробиоты дикого фазана, добытого на охоте, а также жука-кожееда (Dermestes maculatus), питающегося останками теплокровных. Еще одним объектом исследований стали группы добровольцев в рамках подготовки к проведению 8-ми месячного изоляционного эксперимента, организуемого ИМБП РАН совместно с HRP NASA. Был проведен отбор микробиоты носоглотки, ротовой полости и паховой области у 6 добровольцев, лежащих в сухой иммерсионной ванне 5 дней с отбором в начале и по окончанию эксперимента; а также 3 добровольцев, находящихся в сухой иммерсионной ванне в течение 21 дня. В последнем случае был произведено три отбора перед началом эксперимента и на 11-ый и 21-ый дни исследований. Ранее нами было показано, что бактерии Propionibacterium acnes, компонент микрофлоры кожи, обладают высоким уровнем ингибирующей активности по отношению к золотистому стафилококку, мы полагаем, что в режиме ограниченного движения, заселенность закрытых областей кожи, в том числе паховой области, увеличит титр бактерий, в том числе и P.acnes. Проведены пробные отборы и криоконсервация уникальных бактериальных сообществ диких животных (фазан и жук кожеед). А также 9-ти добровольцев из программы подготовки к проведению 8-ми месячного изоляционного эксперимента, организуемого ИМБП РАН совместно с HRP NASA. На основании отобранных биообразцов проведен ряд предварительных отборов бактерий, обладающих антибиотическими свойствами в отношении бактерий S. aureus и E. coli. Проводится идентификация культивируемых штаммов методами широкомасштабного секвенирования. Проводится анализ их генома и метаболома с целью идентификации действующих веществ, обуславливающих эффекторные свойства отобранных штаммов. В результате полногеномного секвенирования бактерий, продемонстрировавших антагонистические свойства по отношению к репортерному штамму патогенных бактерий получен набор метагеномных данных и проведен их биоинформатический анализ с целью идентификации новых кластеров биосинтеза антимикробных агентов. Биоинформатический анализ позволил идентифицировать новое подсемейство AmiN-подобных киназ, обладающих уникальной субстратной специфичностью. Уникальные свойства AmiN-подобных киназ были исследованы методом рентгеноструктурного анализа, позволившего детализировать структуру активного центра фермента, а также основные структурные мотивы, обуславливающие функциональные свойства AmiN-подобных киназ. Полученные результаты легли в основу публикации статьи «A kinase bioscavenger provides antibiotic resistance by extremely tight substrate binding». На данный момент работа находится на рассмотрении в редакции журнала Science Advances (издатель AAAS, ИФ 12.804, Q1). А также представлению результатов на международной конференции FEBS2019, которые были опубликованы в специальном выпуске журнала ACTA NATURAE (ИФ 1.657, Q2).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На данном этапе проекта разработанная нами ранее ультравысокопроизводительная платформа скрининга была адаптирована для функционального профилирования микробиома диких животных. Принципиальная схема данной платформы заключается в следующем: микробиота диких животных подвергалась микрофлюидной компартментализации в каплях биосовместимой мирофлюидной эмульсии в присутствии полученных на предыдущем этапе штаммов-репортеров. Бактерии, подавляющие рост репортерных штаммов, были отобраны с использованием клеточного сортера (FACS) и проанализированы с использованием классических микробиологических методов, а также методов высокопроизводительной геномики и метаболомики. В результате экспедиции в коллаборации с Дальневосточным Федеральным Университетом произведены сбор и криоконсервация оральной микробиоты рыси (Lynx lynx), харзы (Martes flavigula) и енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides). В ходе скрининга были отобраны штаммы микроорганизмов, обозначенные как Р1, Х1, Х27, Е14, Е18, Е32. Для каждого из этих продуцентов была проведена масс-спектрометрическая идентификация. Обнаружено, что метаболиты бактерий Х27, Е18 и Е32, обеспечивающих антибиотическую активность. Е18 – штамм Staphylococcus pseudintermedius, продуцирующий в ростовую среду BHI соединение, активное в отношении S. aureus вплоть до 256-кратного разведения. Показано, что антибиотический эффект соединения сохраняется при инкубации в диапазоне pH 1.5-12.0 при температурах 25 и 37°С. При инкубации в течение 1.5 часов при 60°С наблюдалась потеря 90% активности. Соединение подвергается концентрированию на мембранах 30 кДа, что указывает на его высокомолекулярную природу. Были подобраны стадии его очистки, которые включают катионообменную хроматографию при использовании сорбента SP-sepharose и твердофазную экстракцию с применением сорбента LPS-500, позволяющее сохранить до 68 % антибиотической активности метаболита. Было установлено, что Е18 проявлял специфическую бактерицидную активность в отношении S. aureus – ингибирующее разведение равно 2048. С использованием хромато-масс-спектрометрического анализа было установлено, что продуктом, обладающим активностью в отношении S. aureus в случае бактерий рода Bacillus штаммов Р1, Х1 и Е14 является антибиотик амикумацин, продуцируемый в культивационную среду (BHI) до 64-кратного разведения в случае штамма Е14 и до 32-кратного разведения для Р1 и Х1. Используя данные полногеномного секвенирования, в геномах, отобранных ранее штаммов D10 и E14, удалось установить кластеры, отвечающие за биосинтез амикумацина. Организация доменов в обоих кластерах отличается от описанной ранее (Terekhov et al., PNAS 2018). В случае штаммов Р1 и Х1 очевидно требуется более глубокое секвенирование с использованием технологии NanoPore, которое будет выполнено в ходе работы следующего этапа. Полученная панель штаммов была использована для селекции наиболее эффективных продуцентов амикумацина (Ami). Была оптимизирована очистка Ami, которая была масштабирована для наработки сотен миллиграмм Ami. В рамках данного проекта мы также исследовали структурные особенности AmiN-подобных киназ, входящих в состав идентифицированных кластеров биосинтеза Ami. Эти ферменты являются принципиально важными для регуляции активности антибиотика и в раскрытии механизма авторезистентности. Полученные данные характеризуют AmiN как уникальный фермент, обладающий уникально эффективным связыванием своего субстрата (Ami). AmiN не обладает высоким сродством к АТФ, что является характерной чертой большинства цитоплазматических протеинкиназ и обусловлено, по-видимому, высокой естественной концентрацией свободного АТФ в живых клетках. Следует отметить, что эффективное связывание Ami возникает в присутствии АТФ, что подчеркивает необходимость образования тройного комплекса AmiN-ATP-Ami для максимально эффективного связывания субстрата. При этом ни комплекс AmiN-ADP, ни комплекс AmiN-AMP-PNP, не образовывали комплекс с продуктом реакции (Ami-P). Подобное поведение фермента принципиально важно в случае образования высокоаффинного комплекса с субстратом и, по-видимому, характерна для всех AmiN-подобных киназ. Для дальнейшего механистического исследования AmiN-подобных киназ были получены кристаллические структуры этих белков, а также их комплексов с субстратами и негидролизуемым аналогом и был установлен структурный механизм действия фермента. Было установлено, что уникальной отличительной чертой AmiN-подобных киназ является наличие дополнительной субстрат-связывающей петли, обеспечивающей формирование многочисленных π-π взаимодействий (π-бокс), и, таким образом, связывающей ароматический фрагмент Ami. Многие киназы, гомологичные AmiN, способны образовывать закрытую форму при связывании с субстратами. Мы показали, что закрытая форма гомологов AmiN-подобных киназ в большинстве случаев позволяет значительно снизить барьер реакции, позволяя произвести эффективный перенос фосфата. В то же время подсемейство AmiN-подобных киназ представляет собой некий исключительный пример, для которого уменьшение барьера реакции при закрытии активного центра фермента составляет более 30 ккал/моль. Таким образом, уникальная эффективность и специфичность AmiN-подобных киназ предопределена данным механизмом субстрат-индуцированного закрытия активного центра фермента. Одной из задач проекта является реконструкция обнаруженных кластеров биосинтеза антибиотиков в гетерологичной системе. Для доказательства того, что дрожжевые системы могут быть использованы для экспрессии антибактериальных агентов был создана модельная система экспрессии бактериоцина лизостафин в клетках P.pastoris. Было показзано, что, в отличие от родительского штамма GS115 P. pastoris, сконструированный rLys P. pastoris проявляет антагонистические свойства, опосредованные конститутивным продуцированием лизостафина. Антагонистические свойства rLys P. Pastoris были аналогичны спектру активности лизостафина. Наиболее эффективное ингибирование роста наблюдалось для S. aureus и S. vitulinus. Посредственное подавление наблюдалось для S. xylosus. Некоторые стафилококки (Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus warneri, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus epidermidis) и другие бактерии (Macrococcus caseolyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis и Escherichia pastoris не подавлялись у E. coli. Такая селективность благоприятствует практическому применению rLys P. pastoris, поскольку его можно использовать в качестве целевого агента биоконтроля для уничтожения S. aureus.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Идентифицированы структуры и кластеров биосинтеза антимикробных соединений, продуцируемых отобранными штаммами Streptococcus dysgalactiae Х27 и Staphylococcus pseudintermedius Е18. Гидрофильное низкомолекулярное соединение, секретируемое штаммом Streptococcus dysgalacticae X27, не удалось детально идентифицировать ввиду его нестабильности и высокой гидрофильности. Молекула не сорбировалась катионообменными и анионообменными сорбентами. Использование методов эксклюзионной хроматографии позволило получить обогащенную фракцию вещества, однако методы ЯМР свидетельствовали о том, что данный препарат содержал более 3 компонентов. Дальнейшая очистка приводила к более чем 90% потере активности на стадии концентрирования, даже с использованием низкотемпературной лиофильной сушки. Анализ окислительно-восстановительного потенциала свидетельствовал о том, что данное соединение является окислителем, и, по-видимому, представляет собой пероксид органической молекулы, вступающий в реакцию с самим собой в концентрированной фракции. Фракционирование активных метаболитов S. pseudintermedius E18 с использованием ионообменной хроматографии позволило выделить фракцию активного белка с молекулярной массой 27 кДа Детальный геномный анализ позволил установить последовательность белка, проявлявшего антимикробную активность. Идентифицированный антимикробный белок является новым и принадлежит семейству M23 протеаз и является дальним гомологом фермента лизостафина, обладающего высокоэффективной противостафилококковой активностью. Данный антимикробный фермент был назван ритафином. Установлен кластер его биосинтеза и проведена реконструкция его в геторологической системе. Проведен повторный анализ сообщества микроорганизмов из слюны енотовидной собаки при помощи платформы ультравысокопроизводительного скрининга. Это позволило обнаружить фенотипы, не отмеченные в образце ранее. Для отобранных штаммов, активность которых в отношении S. aureus детектировалась на чашках Петри в виде зон ингибирования роста патогена-мишени или в жидкой культуре, была произведена масс-спектрометрическая идентификация. Помимо представителей рода Bacillus, Staphylococcus pseudintermedius и Streptococcus dysgalacticae, был обнаружен ряд видов, не выявленных в данном образце ранее, а именно: Pasteurella dagmatis (EB10), Ralstonia insidiosa (EB16), Curtobacterium luteum (EB27), Brachybacterium spp (EB30). Проводится идентификация активных метаболитов. Были синтезировано пятнадцать стабильных синтетических аналогов антибиотика амикумацина, отобранного на предыдущих этапах. Было показано, что ряд синтезированных аналогов (AmiNHNH2, AXS1160D, AXS1160D1, AXS1160E2) обладает высокой цитостатической активностью (< 1 мкг/мл). Полученные данные свидетельствуют о том, что аналоги амикумацина (в особенности стабильные аналоги AXS1160D и AXS1160D1) могут быть детально исследованы в качестве принципиально новых антипролиферативных и противовоспалительных агентов. Работы опубликованы в специализированных изданиях (FEBS OpenBio и Pathogens).