Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект направлен на конструирование живой гриппозной вакцины (ЖГВ), обладающей широким спектром действия, т.е. способной защищать от широкого круга дрейфовых вариантов вирусов гриппа А. Одной из перспективных стратегий усиления кросс-протективных свойств ЖГВ типа А является направленная индукция антител к консервативному участку М2 белка – его эктодомену (М2е). Данный участок состоит из 23-х аминокислотных остатков и является высококонсервативным среди всех вирусов гриппа А, циркулирующих среди людей, свиней и птиц. Однако сам белок М2е является очень слабым иммуногеном, поскольку он имеет чрезвычайно малые размеры и представлен в вирусной частице в малом числе копий на вирион. В настоящем Проекте изучается возможность усиления анти-М2е иммунного ответа за счет встраивания четырех тандемных повторов М2е в молекулу гемагглютинина вакцинного штамма ЖГВ, тем самым значительно увеличивая число эктодоменов М2, экспрессируемых на поверхности вирусной частицы. На начальном этапе исследования были проанализированы имеющиеся данные об использовании M2e-эпитопов с помощью различных баз данных. Были использованы два подхода к поиску консенсусных последовательностей М2е эпитопов, что позволило смоделировать два варианта последовательностей вставок из интересующих M2e-эпитопов для конструирования живой гриппозной вакцины с максимально широким покрытием вирусов гриппа, циркулирующих как среди людей, так и среди свиней и птиц. Используя один из вариантов смоделированных последовательностей 4хМ2е, был сконструирован набор химерных генов гемагглютинина вакцинных штаммов ЖГВ, несущих M2e-эпитопы между сигнальным пептидом и субъединицей НА1. С использованием классических методов обратной генетики были получены жизнеспособные рекомбинантные вакцинные штаммы, экспрессирующие отобранные M2e-эпитопы на поверхности вирусной частицы. Корректная укладка М2е эпитопов на поверхности вирионов была подтверждена методом вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела 14С2, специфичного М2е белку. Кроме того, встроенные в геном вакцинных штаммов ЖГВ тандемные повторы М2е были генетически стабильны, т.е. сохранялись в составе вирусных частиц после множественных пассажей вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Изучение трех пар вакцинных штаммов подтипов Н1N1, Н3N2 и Н7N9 (рекомбинантные вирусы, несущие вставку 4хМ2е, с их классическими аналогами) in vitro показало, что вставка из 4-х повторов М2е не влияет на репликативные свойства вакцинных вирусов, при этом не нарушаются основные фенотипические признаки, свойственные холодоадаптированным штаммам ЖГВ, а именно температурочувствительность (ts фенотип) и холодоадаптированность (са фенотип). Кроме того, рекомбинантные штаммы ЖГВ+4М2е были безвредны для мышей при интраназальном заражении. На примере прототипного вакцинного штамма ЖГВ подтипа H7N9, несущего дополнительные М2е эпитопы в составе молекулы НА, были получены предварительные данные о более выраженной способности такого рекомбинантного штамма защищать мышей от инфекции, вызванной гетерологичным летальным вирусом подтипа H1N1, по сравнению с классическим вакцинным штаммом ЖГВ H7N9. Эти результаты свидетельствуют о перспективности разрабатываемой стратегии конструирования универсальной живой гриппозной вакцины за счет увеличения числа экспрессируемых эпитопов М2е на поверхности вирусной частицы. В дальнейших исследованиях будут проведены эксперименты, позволяющие выявить роль анти-М2е антител в такой гетеросубтипической защите.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения второго этапа реализации проекта была сконструирована репрезентативная панель кандидатов в универсальную гриппозную вакцину – рекомбинантных штаммов живой гриппозной вакцины (ЖГВ), несущих в своем геноме дополнительные кассеты из 4-х тандемных повторов М2е белка. При этом фрагмент 4М2е встраивался как в молекулу гемагглютинина вакцинного вируса гриппа, так и в рамку считывания усеченного до 126 аминокислот неструктурного белка NS1. Наличие дополнительной генетической информации в геноме вакцинного штамма ЖГВ не сказывалось на фенотипических характеристиках вирусов, а также на их способности вызывать образование гуморального иммунного ответа к цельному вирусу гриппа при интраназальной иммунизации мышей линии BALB/c. Тем не менее, в группах мышей, привитых вакцинами ЖГВ+4М2е, обнаруживались достоверно более высокие уровни сывороточных IgG антител, связывающихся с рекомбинантным М2е белком в иммуноферментном анализе. Несмотря на то, что преимущественно образуются антитела класса IgG1, антитела класса IgG2a также вырабатывались на достаточно высоком уровне, что указывает на защитный потенциал М2е-специфичных антител. Поскольку анти-М2е антитела не обладали нейтрализующей активностью, была изучена функциональная активность антител в тестах антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-связывающей цитотоксичности (CDC). Проведенные исследования показали, что М2е-специфические антитела, индуцируемые химерной вакциной, обладают выраженной комплемент-зависимой цитотоксичностью, что может являться одним из защитных механизмов кросс-протективного действия вакцины. Индукция ADCC антител была менее выраженной как в группе химерной вакцины, так и в группе контрольной ЖГВ, указывая на то, что данный механизм не является первостепенным для усиления иммуногенности химерной вакцины. Сравнение кросс-протективной активности химерных вакцин и соответствующих классических вариантов ЖГВ в экспериментах на мышах выявила равноценно высокую степень защиты обеих вакцин в отношении различных антигенно-удаленных вирусов гриппа А при заражении ими в дозах до 30 LD50. Однако при увеличении заражающей дозы летального челлендж-вируса защитный эффект ЖГВ снижался, тогда как химерная вакцина продолжала обеспечивать существенный уровень защиты, указывая на способность индуцированных М2е антител оказывать протективное действие в отношении гетерологичных вирулентных вирусов гриппа. При использовании режима пассивной иммунизации удалось установить, что усиленная защитная активность вакцин ЖГВ+4М2е опосредуется антителами, а не Т-клетками, поскольку при введении иммунных сывороток от мышей, привитых штаммами ЖГВ и ЖГВ+4М2е, защитное действие в группе химерной вакцины существенно превосходило таковое в группе ЖГВ. В экспериментах на хорьках была показана безвредность и иммуногенность сконструированных рекомбинантных вакцинных вирусов на основе ЖГВ H3N2, несущих вставку 4М2е либо в гене НА, либо в гене NS1. Животные, иммунизированные двукратно интраназально изученными вакцинными вирусами, не проявляли никаких признаков заболевания в период иммунизации, при этом вакцинные вирусы активно реплицировались в верхних дыхательных путях хорьков, вне зависимости от наличия или отсутствия вставки 4М2е. Гистопатологические исследования также не выявили никаких патологических процессов в органах респираторного тракта животных. Кроме того, было показано, что гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа был сопоставим во всех вакцинных группах, что указывает на отсутствие негативного влияния вставки 4М2е на иммуногенность живой гриппозной вакцины в целом. На следующем этапе будет завершен анализ гуморального и Т-клеточного ответа хорьков на иммунизацию рекомбинантными вакцинными вирусами, а также оценена эффективность вакцин при заражении животных высокой дозой гетерологичного вируса гриппа подтипа H1N1. В результате выполненных исследований в 2020 году была опубликована статья в журнале Vaccines (Basel). Также две статьи находятся на этапе рецензирования в журналах Scientific Reports и Biomedicines.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В заключительном отчетном периоде была апробирована альтернативная стратегия интегрирования М2е эпитопа в геном вакцинного штамма живой гриппозной вакцины. В отличие от стратегии, использованной ранее в ходе выполнения проекта (встраивание 4-х тандемных повтора М2е белка с N- конца субъединицы НА1), в данном случае иммуногенный участок М2е белка встраивался непосредственно в один из антигенных сайтов (Sa) глобулярного домена гемагглютинина вируса гриппа подтипа H1N1. Включение эпитопа М2е усиливало продукцию перекрестно-реагирующих М2е-специфичных антител, по сравнению с классическим вариантом ЖГВ. Кроме того, сравнение двух вакцинных прототипов, один из которых содержит М2е эпитоп в Sa антигенном сайте НА, а другой – 4М2е на N-конце НА1, показало, что они стимулируют равное количество M2e-специфических IgG антител несмотря на различия в количественном присутствии М2е эпитопов у обоих вариантов. Однако следует учитывать, что внесение М2е эпитопов в антигенные сайты глобулярного домена молекулы НА является более трудоемким процессом, поскольку у различных подтипов НА вирусов гриппа А оптимальные участки для встраивания существенно варьируют, тогда как включение тандемных повторов М2е эпитопов с N-конца субъединицы НА1 является универсальным подходом и не зависит от сероподтипа вируса. В 2021 г. было завершено проведение доклинического исследования рекомбинантых вакцинных штаммов H3N2+4M2e на модели хорьков, начатое в предыдущем отчетном периоде. Было показано, что сконструированные вакцинные прототипы ЖГВ/HA+4M2e и ЖГВ/NS+4M2e, в отличие от классическим вариантом ЖГВ подтипа H3N2, индуцируют высокие уровни сывороточных M2e-специфических IgG антител, которые обладают широкой кросс-реактивностью. При этом у группы со вставкой 4М2е в молекуле HA значимый ответ наблюдался уже после 1-й иммунизации с последующим усилением после однократной иммунизации, тогда как модификация NS привела к формированию анти-M2e ответа только после двукратной иммунизации. Экспериментальное заражение иммунизированных хорьков патогенным гетерологичным вирусом гриппа подтипа H1N1 показало различную степень защищенности при иммунизации животных различными вакцинными кандидатами. Наиболее выраженный протективный эффект показал вариант ЖГВ/HA+4M2e, который способствовал существенной снижению вирусной нагрузки как в верхних, так и в нижних отделах респираторного тракта животных. Вариант ЖГВ/NS+4M2e частично защитил животных от размножения вируса в тканях легких, трахей и носовых ходов, тогда как классический вариант ЖГВ снизил вирусную нагрузку только в верхних дыхательных путях, вероятнее всего за счет индукции кросс-реактивных IgA антител на слизистых ВДП. Более детальное изучение различных звеньев вирусспецифического иммунитета (включая уровни антиген-специфического В- и Т-клеточного иммунитета) показало, что наиболее вероятным механизмом, обеспечивающим перекрестную защиту иммунизированных животных от заражения гетерологичным вирусом гриппа, является секреция М2е-специфических антител В-клетками, расположенными в медиастинальных лимфатических узлах хорьков. Именно их способность продуцировать IgG антитела в ответ на антигенную стимуляцию коррелировала со снижением вирусной нагрузки в легких хорьков после челленджа. Кроме того, эксперименты по пассивной иммунизации мышей сыворотками иммунизированных хорьков показали наиболее широкий спектр защиты у образцов из группы ЖГВ/HA+4M2e, что также указывает на вклад М2е-специфических антител в усиление защиты от заражения гетерологичными вирусами гриппа. Таким образом, в результате третьего года исследований была дана полная характеристика рекомбинантных штаммов ЖГВ+4M2e после проведения доклинических испытаний вакцин на модели хорьков. В результате была показана перспективность использования кандидата ЖГВ/HA+4M2e в 1-й фазе клинических испытаний на добровольцах.