Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году работа по Проекту велась в пяти направлениях. Помимо четырех, перечисленных в заявке, были инициированы работы, связанные с развитием методов компьютерного моделирования и спектроскопии ЯМР для исследования структуры и динамики мембранных белков. В рамках первого направления основная задача — это добиться понимания того, как изменения в пространственной структуре рецептора P75 приводят к запуску каскада внутри клетки. Для этого было принято решение изучить структурные и динамические характеристики самого рецептора, его внутриклеточных адаптерных белков, а также ключевые параметры их взаимодействия между собой методом ЯМР. Так как использование ЯМР требует наличия миллиграммовых количеств изотопно-меченых вариантов белков, то первый этап Проекта был посвящен сборке экспрессионных конструкций для бактериальной экспрессии, разработке протоколов продукции и очистки нескольких белков и проведению ЯМР-исследований изолированных доменов смерти рецептора P75. Были получены конструкции для доменов смерти рецепторов человека и крысы, адаптерных белков RhoGDI и TRAF6, а также рецепторов P75 человека состоящих из трансмембранного и внутриклеточного доменов. Для доменов смерти рецепторов P75 и белка RhoGDI были оптимизированы протоколы культивирования рекомбинантных штаммов, а также разработаны протоколы их очистки. С использованием методов ЯМР и ДРС было показано, что домены смерти находятся в растворе в мономерной форме даже при высоких концентрациях (до 1 мМ), что опровергает ранее представленные в литературе данные. Кроме того, было обнаружено, что домен смерти p75 человека подвержен необратимой модификации, природу которой предстоит изучить на следующем этапе Проекта. В рамках второго направления, посвященного исследованию комплексов потенциал-чувствительных каналов с лигандами, был предложен новый подход к структурным исследованиям комплексов калиевых каналов с токсинами поровыми блокаторами. В основе подхода лежит селективное введение фторсодержащих групп в молекулу канала. Ядро 19F очень удобно для ЯМР-исследований больших белков благодаря высокой чувствительности и отсутствию фона (природные ионные каналы не содержат атомов фтора). Для валидации предложенного подхода получены четыре мутантных варианта химерного канала KcsA-Kv1.3, содержащих неспаренные остатки Cys во внеклеточных петлях, примыкающих к сайту связывания поровых блокаторов. Разработан протокол селективного введения в каналы метки 3-бром-1,1,1-трифторацетона (BTFA). На примере фтор-меченного канала KcsA-Kv1.3 (T57С-BTFA) и рекомбинантного аналога агитоксина-2 показана принципиальная возможность изучения комплексов калиевых каналов с поровыми блокаторами методами 19F-ЯМР. Методами биоинженерии сконструированы и получены 4 варианта гибридных белков, в которых поровый блокатор калиевых каналов хонготоксин 1 (HgTx1) объединен через гибкий линкер с N-концевым или C-концевым зеленым или красным флуоресцирующим белком (ФБ, GFP или TagRFP). На основе предложенных флуоресцентных зондов ФБ-HgTx1 и клеток E.coli, экспрессирующих в плазматической мембране гибридные каналы KcsA-Kv1.x (x=1,3,6), разработаны прототипы клеточных тест-систем для поиска и анализа аффинности пептидных блокаторов калиевых каналов. Среди 4 созданных нами конструкций белки GFP-L1a-HgTx1 и HgTx1-L3-RFP являются наиболее эффективными генокодируемыми флуоресцентными лигандами каналов Kv1.1 и Kv1.3 (Kd в наномолярном диапазоне), способными различать близкие по аффинности пептидные блокаторы. Методами КД и ЯМР-спектроскопии исследована пространственная структура и механизм взаимодействия с липидными везикулами и мицеллами детергента нового токсина CM-g из яда одиночной осы, блокирующего инактивацию натриевых каналов. Показано, что CM-g не упорядочен в воде, а при связывании с поверхностью мембраны образует амфифильную спиральную структуру. Токсин обладает большим сродством к мембранам, содержащим анионные липиды. На основании данных мутагенеза построена модель комплекса токсина CM-g с четвертым потенциал-чувствительным доменом (ПЧД-IV) канала BgNav насекомых. Токсин связывается в полости, на внеклеточной стороне домена, взаимодействуя со спиралью S2 и петлями S1-S2 и S3-S4. Связывание CM-g препятствует переходу ПЧД-IV в активированное состояние, что в свою очередь ингибирует процесс инактивации канала. Для исследования молекулярных механизмов биологической активности рибосом-инактивирующих белков, которые ингибируют белковый синтез в эукариотических клетках, созданы высокоэффективные протоколы для бактериальной продукции, фолдинга и очистки изотопно-меченого рекомбинантного растительного токсина Трихобакин (TBK) из растения Trichosantes и производного от него иммунотоксина (ATF-TBK) с целевым пептидом (активатором плазминогена урокиназы), который распознает опухолевые клетки. Наработаны миллиграммовые количества белков TBK и ATF-TBK, включая их изотопно-меченые производные 15N, 15N-13C для проведения структурно-динамических исследований. Проведен подбор условий для изучения структуры белков TBK и ATF-TBK в растворе и мембраноподобных средах, содержащих мицеллы или бицеллы. Препараты белков охарактеризованы различными физико-химическими методами, в том числе гетероядерной спектроскопией ЯМР. Отнесение 1H/13C/15N-химических сдвигов ТВК было помещено в международную базу данных BMRB. Для изучения структурных основ функционирования люцифераз первый этап Проекта также был посвящен разработке методов получения белков. В качестве первых объектов исследования были выбраны полноразмерный и укороченный варианты гена люциферазы из грибов Neonotopanus nambi (nLuz и ΔnLuz). Были созданы сразу несколько различных экспрессионных конструкций, включающих гены белков-партнеров или аффинных тагов. Для полученных гибридных конструкций был проведен широкомасштабный подбор условий культивирования бактериальных штаммов и найдены оптимальные параметры для наработки белков, позволяющих получать десятки миллиграмм целевого белка. Были наработаны необходимые количества белков и разработаны протоколы их очистки, позволяющие получать образцы с чистотой достаточной, для проведения ЯМР-экспериментов. Наконец, был проведен подбор условий ренатурации nLuz и ΔnLuz в различных условиях с применением сред, имитирующих мембранное окружение. Была проведена оценка активности люцифераз и найден целый ряд сред, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым методом ЯМР. Было обнаружено, что в присутствии детергента DPC белок ΔnLuz обладает в несколько раз большей активностью, чем в стандартно используемом для тестов детергенте DDM. Помимо запланированных работ, в ходе выполнения проекта проведено исследование динамики молекул воды в термочувствительном канале TRPV1. Показано, что поведение воды существенно зависит от области ее контакта с белком. Так, в различных мономерах канала наблюдается асимметрия в свойствах воды и это может иметь большое значение при отрывании или закрывании канала. Проведенные исследования имеют большую фундаментальную ценность, проясняя механизм работы исследуемого канала. Кроме того, разработанные алгоритмы будут очень полезны при исследовании поведения воды в других мембранных белках. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей является полезным методом исследования взаимодействия белков с липосомами, которые служат хорошими моделями биологической мембраны. Этот метод позволяет получить информацию о свойствах бислоя, размерах липосом и характере взаимодействия белка с мембраной. При этом на спектры рассеяния могут оказывать влияние такие факторы как разнообразие липосом по размеру и форме. Учет структурных параметров липосом повысит качество интерпретации экспериментальных данных. В ходе выполнения проекта разработана программа, позволяющая анализировать экспериментальные данные и получать информацию о размере и форме исследуемых липосом. Использование этого подхода позволит повысить совмещение спектров с сохранением качества информации на уровне структуры бислоя. В целом можно заключить, что первый этап Проекта был во многом подготовительным. Для большинства направлений Проекта велись работы по поиску методов получения препаратов белков. Тем не менее, удалось получить ряд значимых результатов, которые уже в первый год были опубликованы в двух статьях в рецензируемых журналах, один из которых входит в первый квартиль JCR. При этом, практически все планы первого этапа Проекта были выполнены. Ряд работ по второму направлению Проекты были не проведены из-за изменения плана, в силу появления новых, более эффективных методик, которые необходимо применить для достижения поставленных целей. Взамен невыполненных были инициированы новые исследования, которые принесли положительные результаты. Отметим, что полученные результаты соответствуют ожиданиям и позволяют перейти к следующему этапу.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Данный Проект посвящен исследованию структуры мембранных белков и их лигандов, для создания новых лекарственных и диагностических средств. В рамках Проекта планировалось исследования нескольких классов объектов - клеточных рецепторов, ионных каналов, люцифераз, рибосом-инактивирующих белков, антимикробных пептидов и токсинов, с использованием широкого круга методов - от компьютерного эксперимента, до работ на человеческих клетках. Широкий набор объектов исследования и их природа потребовала развития методологической базы. На текущем этапе Проекта работа велась в нескольких направлениях. Было продолжено исследование структурных основ активации рецептора нейротрофинов р75, задействованного в процессах нейрогенеза и нейродегенерации. Исследования взаимодействий между внутриклеточными доменами рецептора, показало, что у них отсутствует какая-либо выраженная склонность к димеризации, а поведение доменов, которое ранее принималось за проявление димеризации, оказалось связано со спонтанным дезамидированием одного из остатков аспарагина. Полученная структурная информация, совместно с результатами экспериментов по изучению влияния активирующих мутаций на поведение белка позволили предложить новый механизм активации рецептора, который согласуется со всем объемом экспериментальных данных (http://www.ibch.ru/press/news/science/3372). На текущем этапе были инициированы работы по исследованию латентного мембранного белка LMP1 вируса Эпштейна-Барр. Данный белок имитирует рецептор CD40 и является основным онкогеном вируса. Была разработана методика для анализа сложных равновесий олигомерных форм мембранных белков, с использованием которой удалось показать, что низкомолекулярный ингибитор LMP1, пентамидин, взаимодействует с заряженной формой остатка D150 LMP1, нарушая олигомеризацию белка высокого порядка. В дальнейшем планируется исследование более эффективных ингибиторов, что, как мы надеемся позволит установить взаимосвязь структура-функция (http://www.ibch.ru/press/digests/114). Проведена оптимизация протокола получения и очистки 19F-меченых вариантов химерного канала KcsA-Kv1.3 для последующего изучения методами ЯМР. Удалось существенно повысить выходы канала в нативной форме тетрамера. Получены миллиграммовые количества 19F-меченых вариантов канала T57C и V85C, и проведено их исследование методами 19F ЯМР. Показано наличие в молекуле канала мкс-мс конформационных флуктуаций в районе остатка 57. Исследование взаимодействия с токсином AgTx-2 из яда скорпиона показало, что присоединение токсина вызывает большие структурные изменения вблизи от остатка 85 во всех четырёх субъединицах канала. Получены рекомбинантные аналоги малоизученных токсинов Ce1, Ce4 и Ce5 семейства альфа-KTx2 токсинов скорпионов, блокирующих калиевые каналы Kv1. Кроме того был сконструирован и получен в рекомбинантной форме пептид Се5-mut3, в котором произведена замена 4-х вариабельных а.о. в С-концевой области пептида на соответствующие а.о. HgTX1. Активность токсинов исследована в биоинженерной тест-системе на гибридных каналах KcsA-Kv1.x (x=1, 3, 6). В качестве пептида сравнения использовали высокоаффинный блокатор каналов Kv1. - HgTX1. Измеренные значения констант диссоциации комплексов KcsA-Kv1.3 с токсинами Ce1, Ce4 и Ce5 находятся в наномолярном диапазоне концентраций. В случае каналов KcsA-Kv1.x (x=1,6) наблюдалось слабое взаимодействие (микромолярный диапазон концентраций) с токсинами Се1 и Се5. Методом ЯМР-спектроскопии установлена химическая и пространственная структура новых циклических липогликопептидных антибиотиков Гауземецина А и Б. Определены пространственная структура и динамика новых антимикробных пептидов - кателицидина-1 (ChDode) из домашней козы Capra hircus и капителлацина (Capitellacin) из морского червя Capitella teleta. Показано, что в воде ChDode образует ковалентные бета-структурные димеры, а при взаимодействии с мембраноподобным окружением формируются тетрамеры (димеры ковалентных димеров) пептида. Капителлацин в воде имеет структуру правозакрученной бета-шпильки и при встраивании в модельную мембрану сохраняет свою структуру. Определена структура инсектотоксина Tbo-IT2 из паука Tibellus oblongus. Одним из значительных достижений на данном этапе Проекта является определение пространственной структуры рибосом-инактивирующего токсина TBK массой 29 кДа, что лежит на границе применимости современной ЯМР-спектроскопии. Полученная структура была использована для компьютерного моделирования гомологичного TBK иммунотоксина ATF-TBK. Анализ результатов компьютерного эксперимента выявил возможные состояния N-концевого региона белка, а также позволил объяснить его склонность к олигомеризации. Большой объем работ в рамках текущего этапа был посвящен изучению структуры люцифераз nLuc и oLuc. С целью увеличения стабильности структуры белка nLuz, были проведены эксперименты по подбору оптимальных условий для анализа его струткуры. Снижение добавление додецилфосфохолина и бицелл DMPC/CHAPS, позволили значительно улучшить термостабильность фермента, которая, тем не менее, все равно оказалась недостаточной для проведения длительных экспериментов ЯМР и кристаллизации. Были созданы различные экспрессионные конструкции для бактериальной экспрессии гена люциферазы oLuz с помощью которых удалось получить целевой белок в виде телец включения, а затем выделить высокоочищенный препарат белка. Была протестирована возможность рефолдинга фермента при различных условиях, однако получить функционально активный белок не удалось. Впоследствии, было показано, что природный белок oLuz содержит дисульфидные связи, что позволяет предложить новые подходы для ренатурации люциферазы, которые будут опробованы на следующем этапе Проекта. Помимо этого в процессе работы над проектом был получен ряд конструкций для экспрессии гена люциферазы oLuz в клетках дрожжей Pichia pastoris, содержащих ген люциферазы oLuz, а также ген альфа фактора дрожжей, отвечающего за секрецию продукта изучаемого гена в культуральную среду. На всем протяжении Проекта планировалось развивать методологию ЯМР и компьютерного моделирования. Определенные успехи на этом пути были достигнуты и на отчетном этапе. Во-первых, были проведены работы по оптимизации программного обеспечения. В ходе этапа была разработана библиотека предоставляющая быстрый доступ к данным МД больших систем. Во-вторых, было проведено исследование липидных бислоев. Показано что введение пентановых колец в ацильные хвосты липидов повышает стабильность мембран. МД бислоев с различным липидным составом помогло объяснить этот эффект. Изучение неоднородностей плотности, водородных связей и коллективных движений показало, что эти свойства зависят от липидного состава мембраны и изменяются при встраивании белка. Полученные данные полезны при исследовании взаимодействия белков с мембраной. Кроме того, в ходе этапа начаты работы по изучению чувствительности пептидов к искривлениям на мембране. Разработана и протестирована модель мембраны для таких исследований. Разработан подход для расчета сродства пептидов к искривлениям. С помощью этих методик проведено тестирование для ряда природных мембраноактивных пептидов и выдвинута гипотеза о свойствах пептидов, определяющих чувствительность к искривлениям. Первоначальные результаты по моделированию пептидов с искривленными мембранами подтверждают сделанные предположения и позволяют надеяться, что разработанный подход можно использовать для дизайна пептидов чувствительных к искривлениям на мембране. В заключение, отметим, что в прошедшем году в рамках Проекта был выполнен значительный объем работ, направленных как на развитие новых методов структурной биологии, так и на непосредственное получение новой информации о структуре мембранных и мембраноактивных белков и пептидов, а также их лигандов, которые являются либо потенциальными мишенями для новых лекарств, либо представляют собой основу для их дизайна. Были предложены новые методы для изучения свойств мембран с использованием компьютерных экспериментов, методы для исследования олигомеризации мембранных белков в мембраноподобных средах, подходы для получения фтор-меченых производных ионных каналов. Разработаны протоколы для гетерологической продукции ряда важнейших объектов. Определена пространственная структура пяти ранее неизученных белков. Полученная на текущем этапе информация о структурной организации рецептора нейротрофинов р75 позволила выдвинуть новую гипотезу о механизмах активации белка, которая согласуется со всем объемом экспериментальных данных. Исследования латентного мембранного белка I вируса Эпштейна-Барра позволили выявить механизм действия низкомолекулярного ингибитора данного белка, что в будущем должно привести к установлению взаимосвязи структура/функция для потенциальных лекарств, нацеленных на LMP1. За год опубликованы 8 статей в международных изданиях, в том числе 6 в журналах первого квартиля баз данных WOS или Scopus. Двигаясь одновременно в нескольких направлениях, коллектив Проекта постепенно заполняет "белые пятна" в структурной биологии мембранных белков, совершенствует методологическую базу, что готовит почву для новых открытий и разработок, в том числе в области фармакологии.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Данный Проект посвящен исследованию структуры мембранных белков и их лигандов, для создания новых лекарственных и диагностических средств. В рамках Проекта планировались исследования нескольких классов объектов - клеточных рецепторов, ионных каналов, люцифераз, рибосом-инактивирующих белков, антимикробных пептидов и токсинов, с использованием широкого круга методов - от компьютерного эксперимента, до работ на человеческих клетках. Широкий набор объектов исследования и их природа потребовала развития методологической базы. На текущем этапе Проекта работа велась в нескольких направлениях. Было продолжено исследование структурных основ функционирования рецепторов р75, задействованного в процессах нейрогенеза и нейродегенерации. Были разработаны методики синтеза, выделения и очистки С-концевого домена адаптерного белка TRAF6, показана его функциональность. В нескольких экспериментах было показано, что TRAF6 способен взаимодействовать с внутриклеточным примембранным регионом р75 в модельной системе. Это первые данные, напрямую демонстрирующие взаимодействие между TRAF6 и р75, проведенная работа создает основу для получения структуры комплекса в следующем году. Продолжены работы по изучению латентного мембранного белка LMP1 вируса Эпштейна-Барр. Было показано, что низкомолекулярный ингибитор белка способен нарушать олигомеризацию LMP1 в мицеллах, однако взаимодействует с белком иначе, чем изученный ранее другой ингибитор пентамидин. С целью изучения молекулярных детерминант взаимодействия пептидов α-KTx2 с Kv1 каналами была произведена замена вариабельных (для пептидов семейства α-KTx2) участков низкоаффинного пептида Ce5 соответствующими участками высокоаффинного HgTX1, что позволило доказать важную роль участка 19 - 24 а.о. в модуляции аффинности и селективности пептидов α-KTx2 к каналам Kv1. Получен мутантный пептид, характеризующийся высокоаффинным и селективным взаимодействием с сайтом связывания поровых блокаторов фармакологически значимого канала Kv1.3. Установлено, что С-концевая аминокислотная последовательность пептидов α-KTx2 (35 - 39 а.о.) определяет аффинность к сайтам связывания поровых блокаторов каналов Kv1.1 и Kv1.3, наиболее вероятно, в области, примыкающей к селективному фильтру этих каналов. Были проведены исследования структуры и механизмов функционирования трех пептидных антимикробных соединений: вискотоксина А3 из полупаразитического растения омелы белой, капителлацина из многощетинкового червя и гауземицина Б из бактерии Streptomyces, являющегося продуктом нерибосомального пептидного синтеза. Несмотря на разное происхождение, эти соединения объединяет общая мишень действия — клеточная мембрана. Поиски антибиотиков, действие которых связано со взаимодействием с мембранами, в настоящее время вызывают повышенный интерес, поскольку предполагается, что такие вещества помогут в решении проблемы антибиотикорезистентности. Для вискотоксина А3 полученные данные позволили предположить механизм разрушения мембраны клетки-мишени, основанный на формировании олигомеров в присутствии отрицательно заряженных липидов. Показано индуцированное мембранным окружением формирование антипараллельных димеров из бета-шпильки капителлацина. Для гауземицина Б показано связывание с мембраной и формирование сайта связывания двухвалентных катионов с возможным участием полярных групп липидов. Исследован молекулярный механизм взаимодействия соединений аналогов хромофора зелёного флуоресцентного белка с фрагментом ДНК (G-квадруплексом) из вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1). Показано наличие двух конкурирующих сайтов связывания противовирусных соединений на молекуле G-квадруплекса. В ходе выполнения проекта исследовано взаимодействие белка TBK с мембраноподобными супрамолекулярными частицами с помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Показано, что токсин ТВК эффективно взаимодействует только с отрицательно заряженными липидными бислоями. С помощью молекулярного моделирования с использованием разработанных алгоритмов была получена информация не только о местах связывания, но и о конформационных перестройках, сопутствующих адаптации белка TBK к липидной мембране, моделирующей мембрану ЭР. В 2021 году был проведен существенный объем работ по изучению структуры люцифераз nnLuz и oLuz. Был выполнен анализ функциональной активности полноразмерной люциферазы nnLuz из грибов Neonothopanus nambi, полученной из мембранной фракции дрожжей, в мембраноподобных структурах (бицеллах) для дальнейшего установления структуры белка методом ЯМР. С целью повышения термостабильности фермента был проведен случайный мутагенез фермента и создана библиотека мутантов, функциональность которых была оценена в дрожжах Pichia pastoris. Для этого была разработана скрининговая платформа и проведена оценка термостабильности 15 отобранных мутантных вариантов. Помимо этого, была предпринята попытка рефолдинга люциферазы oLuz из Odontosyllis undecimdonta, в последовательности которой присутствуют 12 цистеинов. Несмотря на то, что получить активный рекомбинантный фермент не удалось, был изучен эффект удаления N-концевого участка на активность люциферазы путем экспрессии транкированных вариантов в клетках эукариот. Важнейшие результаты были достигнуты на пути развития методологической базы для структурных исследований. Была разработана методика оценки чувствительности (т.е. особенностей связывания) пептидов к искривлениям на поверхности мембраны. В вычислительных МД-экспериментах установлены основные факторы подобной чувствительности. Полученные результаты позволили спроектировать модели пептидов, демонстрирующих наиболее эффективное связывание именно с искривленными областями мембраны. Рассчитаны энергетические характеристики прохождения индивидуальных гидрофобных ионов через мембрану, а также их комплексов с пальмитиновой кислотой. Результаты позволяют объяснить на молекулярном уровне различную биологическую активность исследуемых ионов. С помощью длительного расчета МД впервые охарактеризованы этапы спонтанного встраивания кардиотоксина 2 в модельный липидный бислой. Изучение распределения значений молекулярного гидрофобного потенциала на поверхности пор каналов семейства TRPV позволило предложить механизм прохождения катионов через гидрофобные ворота канала TRPV1. Проведено исследование двухкомпонентных липидных бислоев ПОФХ/ПОФГ с различным соотношением липидов. Показано, что оптимальное взаимодействие бислоя с внешними молекулами (в частности, с фосфолипазой) достигается при концентрации ПОФГ ~20%. Наконец, была разработана и апробирована на Тау-белке уникальная методика ЯМР-спектроскопии FOSY для отнесения сигналов белков в растворе в режиме реального времени. В заключение отметим, что в отчетном году были проведены работы, направленные как на развитие методологии научных исследований, так и на получение новой информации о структуре и механизмах функционирования нескольких белков и пептидов. Были разработаны протоколы гетерологической продукции ряда белков, получены пространственные структуры новых мембраноактивных антибиотиков, ингибиторов ионных каналов, проведены компьютерные эксперименты для выяснения структурных основ их механизмов функционирования. Методами ЯМР-спектроскопии исследована структура нескольких крупных мембранных белков, таких как рецептор нейротрофинов р75, TRAF6 и рибосом-инактивирующий токсин. Разработаны новые актуальные методы компьютерного моделирования и ЯМР-спектроскопии. По результатам Проекта в отчетном году удалось опубликовать 12 статей в рецензируемых журналах, в том числе 8 статей в журналах первого квартиля баз данных WOS и Scopus, 2 из которых вышли в престижном журнале Angewandte Chemie. Как и ранее, двигаясь одновременно в нескольких направлениях, коллектив Проекта получает новые данные о структурной организации мембранных белков, совершенствуя методологическую базу.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Данный Проект посвящен исследованию структуры мембранных белков и их лигандов, для создания новых лекарственных и диагностических средств. В рамках Проекта планировались исследования нескольких классов объектов - клеточных рецепторов, ионных каналов, люцифераз, рибосом-инактивирующих белков, антимикробных пептидов и токсинов, с использованием широкого круга методов - от компьютерного эксперимента, до работ на человеческих клетках. Широкий набор объектов и их природа потребовала развития методологической базы. На текущем этапе Проекта работа велась в нескольких направлениях. В рамках первого направления Проекта продолжалась работа по изучению рецепторов I типа, а также латентного мембранного белка вируса Эпштейн-Барр, который имитирует рецептор I типа CD40. В отчетном годы были проведены работы по локализации взаимодействия между адаптерным белком TRAF6 и рецепторном нейротрофинов р75. Удалось показать, что C-концевой домен TRAF6 взаимодействует с примембранным регионом р75, причем для этого взаимодействие необходимо наличие трансмембранного домена, а внутриклеточный глобулярный домен смерти существенно стабилизирует комплекс p75 и TRAF6. Помимо того, исследовалось взаимоедйствие между TRAF6 и внутриклеточными доменом рецептора SORCS2, а также были продолжены работы по изучению латентного мембранного белка LMP1 вируса Эпштейна-Барр. Вместо исследования отдельного трансмембранного сегмента был получен полноразмерный шестиспиральный трансмембранный домен LMP1, было показано, что белок склоннен к образованию олигомеров высокого порядка. В рамках второго направления продолжались исследования потенциал-зависимых каналов и их лигандов, а также мембраноактивных соединений. Так, был разработан протокол получения спин-меченого аналога токсина AgTx2 с помощью посттрансляционной ковалентной модификации пептида с присоединением парамагнитного агента по аминогруппе. Получены препараты спин-меченого токсина. С помощью физико-химических методов, таких как ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР полученные образцы были охарактеризованы, была показана чистота и однородность препаратов. Показано, что с токсином связывается одна спиновая метка. Определен сайт связывания — N-концевая аминогруппа. Показано сохранение функциональной активности спин-меченого токсина на уровне немеченого. Экспериментально определены ключевые аминокислотные остатки центральной вариабельной области пептидов семейства α-KTx 2, определяющие аффинность их взаимодействия с сайтами связывания калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1.1 и Kv1.3. Установление молекулярных детерминант, определяющих высоко-аффинное взаимодействие пептидов с имеющими фармакологическое значение каналами Kv1.1 и Kv1.3, важно для решения задач по разработке лекарственных средств на основе пептидных блокаторов этих каналов. Методами ЯМР спектроскопии была исследована пространственная структура и динамика антимикробного пептида Лихеницидина α (Lhcdα) из бактерии Bacillus licheniformis, штамм VK21. Были исследованы структуры в различных окружениях: растворе метанола, в водном растворе и в составе мицелл DPC. Исследовано взаимодействие Lhcdα с предполагаемой молекулой-мишенью — липидом II. Показано связывание Lhcdα с липидом II в мицеллах DPC, определены сайты связывания: на молекуле липида II - в центре пирофосфатного фрагмента, на молекуле Lchα — в области колец C и D (остатки Abu22-Asn32). В рамках проекта для сравнительного изучения структурно-динамических свойств токсинов РИБ I и II типов вместе с изучением РИБ I трихобакина (ТВК) проводились исследования пластичности каталитической альфа-субъединицы РИБ II рицина (RTA), которая отщепляется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) от подвижной бета-субъединицы для дальнейшей атаки рибосом и является структурным аналогом РИБ I типа. Проведен сравнительный анализ РИБ I TBK и субъединицы РИБ II RTA на основе расчетов полноатомных МД в мембраноподобных средах, имитирующих мембранное окружения в области поверхности мембраны и внутри липидного бислоя. По результатам проведения МД-симуляций РИБ I TBK и РИБ II RTA можно сделать вывод, что оба токсина при прохождении через липидный бислой должны подвергаться глобальным конформационным перестройкам, различающимся из-за разной пластичности структуры токсинов. На основе МД симуляций в крупнозернистом поле определены области контакта токсинов РИБ I и II типов с модельной мембраной с липидным составом, имитирующем мембрану ЭР. Показано, что для РИБ I TBK характерна только одна мода связывания с мембраной, в то же время ля РИБ II RTA реализуется 3 моды связывания. На основе полученных в ходе проекта модельных и экспериментальных данных были выявлены структурно-динамические различия между токсинами РИБ I и II типов, предположительно определяющих их различные пути проникновения в цитоплазму до ингибирования рибосом эукариот. В результате, на примере РИБ I TBK и РИБ II RTA предложены различные механизмы взаимодействия РИБ I и II типов с поверхностью клеточной мембраны и пошагового проникновения в цитоплазму. С помощью методов моделирования было проведено исследование структуры и свойств пор трех каналов в различных состояниях: TRPV1, TRPV3 и TRPV6. Установлены общие для всех каналов TRPV три консервативные группы состояний поры, характеризующиеся специфическим распределением гидрофобности в области ворот. С помощью разработанной методики исследования взаимодействия белок-мембрана описан процесс спонтанного встраивания в модельный липидный бислой лантибиотика лихеницидин и охарактеризованы два основных мотива связывания пептида с мембраной. Методами МД исследованы липидные бислои различного состава, разработаны методы исследования латеральной гетерогенности (липидных нанодоменов) в модельных мембранах различного состава. Установлено, что динамика и взаимодействия кластеризованных липидов зависят от состава мембраны, а также обусловливают возникновение групповых свойств липидов, что приводит к возникновению латеральной гетерогенности химических свойств на поверхности мембраны. Усовершенствовано программное обеспечение, использующееся для анализа данных МД в части построения карт поверхностей молекулярных объектов и поиска внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Оптимизированы протоколы ускоренной адаптации экспериментально определённых структур мембранных белков к явно заданному липидному окружению с валидацией условий моделирования на основе сравнения экспериментальных и извлекаемых из МД-траекторий набора релаксационных параметров ЯМР. Создан ряд узконаправленных FOSY методик селективного отнесения резонансов боковых цепей остатков высокоподвижных белков, которые апробированы при отнесении 1Н/13С-резонансов метильных групп для ряда комплексных белковых систем из различных организмов. Подводя итог, в рамках проекта в отчетном году были получены важнейшие данные о функционировании трех классов белков - клеточных рецепторов, ионных каналов и рибосом-инактивирующих белков, получены пространственные структуры нескольких мембранных и водорастворимых белков, а также небольших пептидов, которые можно рассматривать как потенциальные лекарственные средства. Разработана методологическая база для последующих исследований объектов схожей природы. Все запланированный работы были проведены в полном объеме, результаты были достигнуты. Часть работы были проведены сверх плана.