Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Среди механизмов возникновения таких социально значимых заболеваний, как аутизм, шизофрения и депрессия, часто называют стресс в раннем детском возрасте. Одной из моделей такого стресса является провоспалительная провокация: введение эндотоксина, приводящее к активации не только иммунной системы, но и системы стресс-реакции организма. Такое воздействие отражается на всех клеточных элементах развивающегося мозга. В глиальных клетках происходит, так называемое, «праймирование», закладывающее способ реагирования клеток на молекулярные индикаторы стресса на протяжении всей последующей жизни. Дисфункция глиальных клеток в норме и/или в ответ на стрессирующие события может способствовать возникновению вышеупомянутых заболеваний. Подобное изменение глиальных клеток можно обнаружить не только с помощью молекулярных и биохимических методов исследования, но и по оценке таких показателей как число клеток и их морфологическое состояние. В нашей лаборатории была разработана методика оценки морфологии клеток микроглии с помощью автоматического анализа, который позволяет описать морфологию клетки одним показателем — фрактальной размерностью. Объекты, обладающие сложной формой, такой, например, как ветвящиеся отростки рамифицированных клеток микроглии имеют фрактальную размерность близкую к 2. У объектов с редуцированными отростками, по форме более близких к кругу, фрактальная размерность будет ближе к 1. Оценивая фрактальную размерность клеток микроглии и плотность их популяции, можно определить степень их активированности. Такие данные позволят судить о масштабе влияния провоспалительного процесса на состояние микроглии, а значит, помогут в выяснении этиологии социально значимых психоневрологических заболеваний. Для исследования глиальных изменений, вызванных стрессом в раннем онтогенезе (СРО), мы использовали модель введения липополисахарида (компонент клеточной стенки бактерий, эндотоксин) на 3 и 5 постнатальные дни (ПД). Эндотоксин вводили подкожно, в дозе 50 мкг/кг. Контрольным крысятам вводили физ. раствор в эквивалентном объеме. В дальнейшем исследовали влияние СРО на поведенческие характеристики крыс и на состояние микроглии в гиппокампе. Для исследования поведения проводили тесты: открытое поле (ОП), приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) и тест Порсолта, в двух возрастах — подростковом (1 мес.) и взрослом (3 мес.). Исследование микроглии проводили в полях СА1 и СА3 и в хилусе зубчатой фасции дорсального и вентрального отделов гиппокампа для двух возрастов: ювенильного (ПД18) и подросткового (1 мес.). Для исследования изменений микроглиальных клеток в лаборатории была доработана методика автоматической оценки морфологического состояния микроглии и подобраны параметры фильтров, используемых для обработки изображений. Исследование поведения и состояния микроглии в ответ на СРО проводили в контексте рассмотрения половых различий. Исследование микроглии в гиппокампе контрольных крыс ювенильного и подросткового возрастов показало достоверное уменьшение числа клеток микроглии в полях СА1 и СА3 гиппокампа с возрастом, независящее от пола животных. Для ювенильного возраста (ПД18) мы наблюдали некоторый след реакции микроглии на СРО. Он проявлялся в уменьшении фрактальной размерности клеток микроглии в поле СА3 гиппокампа, что говорит об отставленном более активированном по сравнению с контролем состоянии клеток. В дополнение к этому у самок, подвергнутых СРО, в хилусе зубчатой фасции число клеток микроглии было уменьшено по сравнению со своим контролем и с числом клеток в этом отделе мозга у самцов. Указанные изменения обнаружены только в дорсальном отделе гиппокампа. В подростковом возрасте (1 мес.) указанные отличия микроглии контрольных крыс и крыс, подвергнутых СРО, пропадали. Более того, нам не удалось обнаружить какого бы то ни было влияния СРО на состояние клеток микроглии ни у самцов, ни у самок. Однако при этом начал ярче проявляться половой диморфизм. Если в ювенильном возрасте достоверность различий по фактору «пол» проявлялась только в контексте последствий влияния СРО, то в подростковом возрасте различия по фактору «пол» были независимы от фактора «СРО». Так, например, в большинстве исследованных областей гиппокампа фрактальная размерность клеток микроглии у самок была несколько ниже, чем у самцов. Достоверности это различие достигало только в поле СА1 вентрального гиппокампа, а в поле СА3 дорсального гиппокампа и в хилусе зубчатой фасции обоих отделов гиппокампа носило характер тенденции. В дополнение число клеток микроглии в хилусе зубчатой фасции дорсального гиппокампа было достоверно выше у самок крыс, чем у самцов. В поле СА1 дорсального гиппокампа мы наблюдали аналогичное различие, но лишь на уровне тенденции. Интересно, что именно в возрасте 1 месяца у крыс начинает проявляться половой диморфизм в поведении (M. Bell, 2018). В нашем эксперименте половой диморфизм поведения проявился в тесте ПКЛ: самки вели себя более тревожно. Это проявлялось в достоверно меньшем числе входов в открытые рукава лабиринта и достоверно меньшем времени, проведенном в открытых рукавах и в центре лабиринта, по сравнению с самцами. Как и в случае с отличиями, обнаруженными в состоянии глиальных клеток, отличия в поведении в ПКЛ не зависели от наличия СРО. Зато эффект СРО проявился в тесте ОП. Здесь и самцы, и самки, подвергнутые СРО, проходили меньшую дистанцию и делали меньше выходов в центр. При этом у групп животных, подвергнутых СРО, было увеличено число актов груминга. Такой паттерн поведения говорит о повышении уровня тревожности животного. Во взрослом возрасте (3 месяца) паттерн поведения крыс, подвергнутых СРО, в тестах ОП и ПКЛ изменился. В тесте ОП больше не было отличий между группами по фактору «СРО», но появились отличия по фактору «пол». Так, самки крыс проходили большее расстояние, но делали меньшее число стоек, чем самцы. Это различие характерно для крыс и хорошо описано в литературе, но стоит отметить, что проявилось оно только уже во взрослом возрасте. В тесте ПКЛ наоборот пропало наблюдавшееся нами у крыс подросткового возраста межполовое различие. При этом как самцы, так и самки крыс, подвергнутые СРО, делали статистически достоверно меньше входов в открытые рукава лабиринта и проводили в них меньшее время (на уровне тенденции). Подобное поведение также трактуют как повышенный уровнь тревожности животных. Другой интересной особенностью крыс взрослого возраста, выявленной в поведенческих тестах, является наличие разнонаправленных изменений поведенческих показателей, чего мы не наблюдали у крыс подросткового возраста. Так, для пройденной дистанции в тесте ОП есть достоверное взаимодействие факторов «пол» и «СРО», что при учете средних значений позволяет сделать предположение о том, что СРО приводит к уменьшению пройденного расстояния за время теста у самцов, но к увеличению — у самок. Однако post hoc анализ показал лишь различие между группами самцы и самки, подвергнутые СРО, но не для различий между контрольными и подвергнутыми СРО самцами или контрольными и подвергнутыми СРО самками. Сходные, но менее выраженные различия мы наблюдали и для числа выходов в центр в тесте ОП, и для числа переходов между рукавами в тесте ПКЛ. Схожая ситуация разнонаправленных изменений, но с противоположным знаком, обнаружена для числа актов груминга в тесте ОП: у самок СРО приводил к снижению их числа, а у самцов — к увеличению. Однако и в этом случае достоверного взаимодействия факторов не было, а post hoc анализ выявил лишь достоверное отличие по этому показателю групп самцы, подвергнутые СРО, и самки, подвергнутые СРО. В тесте Порсолта мы наблюдали аналогичную картину: время пассивного плавания во второй день теста было увеличено по сравнению с контролем у самцов, но уменьшено у самок. Таким образом, по нескольким поведенческим показателям, отвечающим за уровень тревожности (число выходов в центр в ОП, число актов груминга) и за проявление депрессивно-подобного поведения (время пассивного плавания во второй день теста Порсолта), проявления последствий СРО имели разнонаправленный характер для самцов и самок крыс. По этим изменениям можно предположить, что СРО приводил скорее к повышению уровня тревожности у самок и одновременно к продепрессивно-подобному поведению у самцов. Однако, мощности статистических тестов недостаточно, чтобы с полной уверенности говорить о наличии таких разнонаправленных изменений. Таким образом, в целом за прошедший отчетный период в ходе работы по настоящему гранту получены данные о влиянии СРО на поведение крыс в подростковом и взрослом возрастах. При этом в обоих возрастах обнаружены признакои повышенной тревожности у крыс обоих полов, подвергнутых СРО. У крыс взрослого возраста было обнаружено также различие по проявлению влияния СРО на поведение между самцами и самками. Также в ходе работы по гранту получены данные о динамике изменений микроглии в здоровом мозге у самцов и самок крыс: показано регион-специфичное уменьшение числа клеток микроглии у крыс обоих полов при переходе от ювенильного возраста к подростковому. И наконец, получены данные о влиянии СРО на состояние микроглии в ювенильном и подростковом возрастах крыс. У ювенильных крысят обнаружено наличие последствий СРО, причем оно было специфичным как для исследованных структур, так и для пола животных. У крыс подросткового возраста не было выявлено эффектов СРО, но был обнаружен некоторый половой диморфизм состояния микроглии в гиппокампе. В следующем отчетном периоде планируется получение данных о состоянии микроглии у взрослых крыс, а также получение данных о состоянии астроглии в гиппокампе у самцов и самок всех трех исследуемых возрастов и влиянии СРО на состояние астроглии. Эти данные позволят получить полную картину отставленного эффекта СРО на микро- и астроглию гиппокампа самцов и самок крыс в разные возрастные периоды, необходимую для понимания степени вовлечения глии в этиологию социальнозначимых психоневрологических заболеваний.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Среди механизмов возникновения таких социально значимых заболеваний, как аутизм, шизофрения и депрессия, часто называют стресс в раннем детском возрасте. Одной из моделей такого стресса является провоспалительная провокация: введение эндотоксина, приводящее к активации не только иммунной системы, но и системы стресс-реакции организма. Такое воздействие отражается на всех клеточных элементах развивающегося мозга. В глиальных клетках происходит, так называемое, «праймирование», закладывающее способ реагирования клеток на молекулярные индикаторы стресса на протяжении всей последующей жизни. Дисфункция глиальных клеток в норме и/или в ответ на стрессирующие события может способствовать возникновению вышеупомянутых заболеваний. Подобное изменение глиальных клеток можно обнаружить не только с помощью молекулярных и биохимических методов исследования, но и по оценке таких показателей как число клеток и их морфологическое состояние. В нашей лаборатории была разработана методика оценки морфологии клеток микроглии с помощью автоматического анализа, который позволяет описать морфологию клетки одним показателем — фрактальной размерностью. Объекты, обладающие сложной формой, такой, например, как ветвящиеся отростки рамифицированных клеток микроглии имеют фрактальную размерность близкую к 2. У объектов с редуцированными отростками, по форме более близких к кругу, фрактальная размерность будет ближе к 1. Оценивая фрактальную размерность клеток микроглии и плотность их популяции, можно определить степень их активированности. Такие данные позволят судить о масштабе влияния провоспалительного процесса на состояние микроглии, а значит, помогут в выяснении этиологии социально значимых психоневрологических заболеваний. Для исследования глиальных изменений, вызванных стрессом в раннем онтогенезе (СРО), мы использовали модель введения липополисахарида (компонент клеточной стенки бактерий, эндотоксин) на 3 и 5 постнатальные дни (ПД). Эндотоксин вводили подкожно, в дозе 50 мкг/кг. Контрольным крысятам вводили физ. раствор в эквивалентном объеме. Исследование состояния глиальной составляющей нервной ткани проводили на иммуногистохимически окрашенных фронтальных срезах мозга с использованием антител к белкам-маркерам глиальных клеток: GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) - маркер астроцитов, и Iba-1 (белок, входящий в состав главного комплекса гистосовместимости III) - маркер микроглии. Для исследования изменений морфологии микроглиальных клеток в лаборатории была разработана методика автоматической оценки фрактальной размерности границы изображения микроглии, для чего подобраны параметры фильтров обработки цифровых изображений и написан скрипт для программы ImageJ. Для оценки плотности популяции астро- и микроглии проводили подсчет числа клеток на цифровых микрофотографиях с помощью скрипта, написанного для программы ImageJ. Влияние СРО на состояние глии гиппокампа исследовали в возрастах ПД18 (ювенильном), ПД30 (подростковый) и ПД90 (взрослый). В возрастах ПД30 и ПД90 дополнительно исследовали влияние острого поведенческого стресса (ОПС), в роли которого выступал тест Порсолта. Учет состояния глии проводили как в дорсальной, так и в вентральной частях гиппокампа, в полях СА1 и СА3 аммонова рога и в хилусе зубчатой фасции. Исследование проводили в контексте рассмотрения половых различий. В первую очередь были исследованы изменения глии гиппокампа в ходе нормального онтогенеза на животных, не подвергнутых СРО и ОПС. Было показано, что при переходе от подросткового к взрослому возрасту плотность популяции астроцитов уменьшается в полях СА1 и СА3 аммонова рога как в дорсальной, так и в вентральной частях гиппокампа. Плотность популяции микроглиоцитов также уменьшалась с возрастом при нормальном онтогенезе, но динамика снижения и ее распределение по структурам отличались от таковой у астроцитов. Так, снижение плотности популяции микроглиоцитов начиналось уже при переходе от ювенильного возраста к подростковому и продолжалось при дальнейшем переходе ко взрослому возрасту. Такое снижение мы наблюдали в полях СА1 и СА3 аммонова рога дорсальной части гиппокампа. При этом в хилусе дорсальной части гиппокампа снижение плотности популяции микроглиоцитов было лишь при переходе от подросткового возраста к ювенильному. А в вентральной части гиппокампа изменений плотности популяции микроглиоцитов с возрастом мы не обнаружили, но при этом только в вентральной части гиппокампа были обнаружены изменения морфологии микроглиальных клеток. Так, в подростковом возрасте значение фрактальной размерности микроглиальных клеток было меньше по сравнению со значением этого показателя в ювенильном и взрослом возрастах. Все указанные изменения обнаружены у животных обоих полов. Но в дорсальной части гиппокампа было обнаружено различие между самцами и самками: у самок фрактальная размерность микроглии была ниже во всех исследованных областях для любого возраста крыс, что может говорить о несколько большей активированности микроглии у самок по сравнению с самцами. Одной из основных целей исследования было выяснить наличие отставленных эффектов стресса в раннем онтогенезе на состояние глии гиппокампа. Действительно, у самок, перенесших СРО, в ювенильном возрасте (ПД18) была снижена плотность популяции микроглиоцитов в дорсальной части хилуса зубчатой фасции. У самцов такого снижения не наблюдалось. Но при этом у самцов, перенесших СРО, была снижена плотность как астро-, так и микроглии в вентральной части поля СА3 гиппокампа. Таким образом, СРО имел отставленный эффект на состояние глии гипплкампа, причем был выраженный половой диморфизм, проявлявшийся как в различии сроков отставленных эффектов, так и в различии структур, в которых эффекты проявлялись. Примечательно, что у самцов изменения, вызванные СРО, проявлялись именно в вентральной части гиппокампа, которую связывают с обработкой эмоциональной составляющей информации, и именно в том возрасте, когда у них начинает проявляться также и депрессивно-подобное поведение. В последнее время получила широкое распространение гипотеза "двойного удара" (Walker AK, et al., 2009). В ней предполагается, что негативное воздействие в раннем возрасте проявляется довольно слабо пока во взрослом возрасте индивидуум не подвергается достаточно сильному стрессу. В частности, именно "праймирование" микроглии в раннем возрасте (Frank MG, et al., 2012) может привести к дезадаптивной реакции микроглии во взрослом возрасте, что в свою очередь может вести к нейродегенеративным изменениям и увеличивать, тем самым, риск социально-значимых психоневрологических заболеваний таких как депрессия и шизофрения. Поэтому в данном проекте было исследовано влияние острого поведенческого стресса на состояние глии гиппокампа у крыс, перенесших СРО. Острый поведенческий стресс (ОПС) в подростковом и взрослом возрастах сам по себе имел влияние на состояние глии гиппокампа. Так, ОПС в подростковом возрасте приводил к уменьшению плотности популяции как астроцитов, так и микроглии в дорсальной части поля СА1 гиппокампа у самок. При этом ни к каким изменениям состояния глии в гиппокампе самцов крыс ОПС в подростковом возрасте не приводил. ОПС во взрослом возрасте также приводил к изменениям состояния глии гиппокампа только у самок, но не у самцов. Однако в этом случае изменения происходили в дорсальной части хилуса зубчатой фасции и имели другую направленность: обнаружено увеличение плотности популяции как астроцитов, так и микроглиоцитов. Совместное влияние СРО и ОПС на состояние глии гиппокампа проявилось только во взрослом возрасте как у самцов, так и у самок крыс. У самцов при этом оно проявилось в некотором, не сильном, увеличении эффекта СРО: плотность популяций астроцитов и микроглии уменьшалась в вентральной части поля СА3 гиппокмпа. У самок же, у которых во взрослом возрасте отставленных эффектов СРО обнаружено не было, совместное предъявление СРО и ОПС привело к увеличению плотности популяции астроцитов в вентральной части поля СА1 гиппокампа. При этом стоит отметить, что у самок изменения состояния глии гиппокампа, вызванные ОПС происходили только в дорсальной части гиппокампа, а совместное действие СРО и ОПС имело эффект именно в вентральной ее части. В целом, за прошедший отчетный период в ходе работы по проекту были получены и проанализированы данные по влиянию СРО на состояние микро- и астроглии в гиппокампе крыс трех различных возрастов и по влиянию совместного действия СРО и ОПС на состояние глии гиппокампа в подростковом и взрослом возрастах. Анализ данных шел в контексте исследования полового диморфизма, поскольку, с одной стороны, для социально значимых психоневрологических заболеваний, связываемых с негативным детским опытом, показана различная частота встречаемости для мужчин и женщин, а с другой стороны, для микро- и астроглии показана чувствительность к половым гормонам, особенно в ранний постнатальный период (Lenz KM, McCarthy, 2015). Нами показано наличие полового диморфизма морфологии микроглиальных клеток в дорсальной части гиппокампа при нормальном онтогенезе. Показано, что при нормальном взрослении реакция глии гиппокампа на ОПС в подростковом и взрослом возрастах различна у самцов и самок: у самцов не было обнаружено никакой глиальной реакции на острый стресс ни в одной из исследованных областей гиппокампа, в то время как у самок и в подростковом и во взрослом возрастах изменялась плотность популяции астро- и микроглии в дорсальной части гиппокампа. Мы показали, что СРО имеет отставленные последствия. При этом отставленные последствия СРО также обладали половым диморфизмом: у самок они проявлялись только в ювенильном возрасте, а у самцов только во взрослом. По результатам нашего анализа совместное действие СРО и ОПС приводило к изменениям в состоянии глии вентральной части гиппокампа у животных обоих полов. Вентральный гиппокамп ассоциируют с обработкой эмоциональной составляющей информации, и поэтому можно предполагать, что нарушение адаптационных процессов в вентральном, а не в дорсальном, ассоциируемом с обработкой пространственной информации и процессами консолидации памяти, гиппокампе будет сопровождать проявление расстройств тревожного и депрессивного спектров. У самцов крыс вследствие ОПС мы наблюдали некоторое усиление тех изменений глиальной составляющей нервной ткани, которые были вызваны СРО. У самок отставленных эффектов СРО во взрослом возрасте не было, и изменения глии в результате совместного действия СРО и ОПС касались только астроглии и происходили в другой структуре гиппокампа, чем у самцов. Таким образом, полученные данные позволяют составить полную картину эффектов СРО и ОПС, а также их совместного действия, на микро- и астроглию гиппокампа самцов и самок крыс в разные возрастные периоды. Полученные данные находятся в согласии с данными современной литературы и при этом значительно уточняют многие детали изменения глиальной составляющей нервной ткани вследствие стресса.