Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Для изучения взаимосвязи между температурой трансплантата печени, состоянием внутритканевого метаболизма глюкозы в нем и начальной функцией после пересадки использована комбинация двух методов: дистанционной инфракрасной термографии и внутритканевого микродиализа. Определение температурных характеристик донорского органа во время холодовой консервации является новым направлением исследований в области донорства и трансплантации органов. Поэтому одной из задач работы было установить температуру донорской печени на момент окончания холодовой ишемии в реальной клинической практике. В исследование включено четыре трансплантата правой доли печени родственных доноров (LD) и семь трансплантатов целой печени, полученных от посмертных доноров (DD). В каждом наблюдении термографию трансплантата и получение микропробы внутритканевой жидкости проводили на момент окончания времени холодовой ишемии (CIT). В полученных микропробах определяли концентрацию глюкозы, лактата, пирувата и глицерола (Glyc). Медианы температуры трансплантатов были существенно выше целевого значения в 4°C и варьировали в широких пределах (LD: 13.4–16.8°C; DD: 7.7–12.4°C). Более того, температура в пределах одного трансплантата имела большие различия, так разницы температур между самыми теплыми и самыми холодными точками трансплантатов составляли от 3.5°C до 7.3°C. Температура трансплантатов посмертных доноров с нормальной начальной функцией была статистически значимо ниже, чем температура органов, которые продемонстрировали дисфункцию в раннем послеоперационном периоде: 8.5°C (6.6–12.0°C) и 12.1°C (9.2–15.7°C) соответственно, P=0.005. Независимо от типа донора, концентрация пирувата во внутритканевой жидкости трансплантатов с ранней дисфункцией была статистически значимо выше, чем в нормально функционирующих органах: 6 мкмоль/л (2–19 мкмоль/л) и 22 μmol/L (20–183 мкмоль/л), P=0.024). Среди параметров, отражающих метаболическое состояние органа, статистически значимые различия между трансплантатами от посмертных и родственных доноров наблюдались только по концентрации глицерола: 723 мкмоль/л (397–1973 мкмоль/л) и 70 мкмоль/л (53–75 мкмоль/л) соответственно, P=0.006. Предположив, что не только CIT но и температура трансплантата влияет на его метаболический статус, была введен новый параметр, одновременно учитывающий и длительность консервации и температуру органа: CIT * Temp_med (час * °C). Далее было установлено, что имеется довольно сильная нелинейная связь между этим параметром и концентрациями Glu, Lac и Glyc. Значения R2 составили 0.80, 0.60, and 0.81, соответственно. Зависимость наилучшим образом описывалась уравнениями вида: f=y0+a*exp(b*x). Таким образом, результаты анализа первых наблюдений подтверждают, что не только длительность холодовой консервации но и температура донорского органа влияют на состояние внутритканевого метаболизма и начальную функцию. Мониторинг температуры и микродиализ могут использоваться для оценки качества донорских органов и для совершенствования технологии статической холодовой консервации.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В течение второго года исследования в анализ включено 8 клинических и 3 экспериментальных наблюдения. Совокупно с начала проекта получены фактические данные о состоянии внутритканевого метаболизма печени: # посмертного донора - на этапе изъятия, консервации и транспортировки - 12 наблюдений; - в раннем (первые 7 дней) посттрансплантационном периоде - 13 наблюдений (c учетом данных, полученных нами ранее в рамках проекта РНФ 17-75-10010 "Изучение особенностей метаболизма глюкозы в трансплантате печени для ранней диагностики его дисфункции" - 23 наблюдения) # родственного донора - на этапе изъятия и консервации - 4 наблюдения; - в раннем (первые 7 дней) посттрансплантационном периоде - 4 наблюдения. В течение отчетного периода нами были окончательно определены все технические аспекты, связанные с установкой микродиализных катетеров в паренхиму печени. Разработанные правила позволяют минимизировать риск серьезных ятрогенных повреждений донорского органа, связанных с ними хирургических осложнений, а также контаминации консервирующего раствора и инфицирования донорского органа в период консервации и транспортировки. При проведении оценки параметров внутритканевого метаболизма глюкозы в печени во время статической холодовой консервации установлены следующие тенденции: (количественные данные представлены в виде Медиана [интерквартильный размах] a) на момент начала холодовой консервации; b) через 4 часа холодовой ишемии; с) через 8 часов холодовой ишемии): - рост концентрации глюкозы (ммоль/л): a) 6,8 [5,6 - 7,5]; b) 13,1 [7,6 - 19,9]; c) 12,3 [8,5 - 23,6], что отражает процесс деградации накопленного в гепатоцитах гликогена (гликогенолиз); - рост концентрации лактата (ммоль/л): a) 2,6 [2,2 - 3,4]; b) 8,2 [5,5 - 12,1]; c) 10,5 [8,6 - 11,9], что отражает процесс анаэробного гликолиза, который протекает несмотря на то, что орган находится в условиях гипотермии и наполнен конcервирующим раствором; - снижение концентрации пирувата до значений близких к 0 (мкмоль/л) a) 43 [27 - 62]; b) 7 [4 - 11]; c) 10 [5 - 17], что свидетельствует об остановке аэробного гликолиза; - рост концентрации глицерола (мкмоль/л): a) 47 [21-120]; b) 149 [123 - 488]; c) 650 [458 - 889], что происходит за счет разрушения клеточных мембран (цитолиз). Сделанные наблюдения позволяют предположить, что уровни лактата и глицерола могут быть использованы для объективной оценки степени ишемического повреждения и, возможно, для прогнозирования начальной функции трансплантата еще на этапе консервации. Полученные данные, подтверждают исходно выдвинутую гипотезу, однако для ее проверки требуется расширение исследуемой выборки, что будет сделано на следующем этапе работы. Во всех наблюдениях дополнительно к методу внутритканевого микродиализа применялась инфракрасная дистационная термография и контактная термометрия. Температура органов на момент упаковки после эксплантации варьировала от 11,9C до 20,4 C (медиана: 14,2, интерквартильный размах: 13,1 - 19,0), а на момент распаковки в операционной центра трансплантации - от 7,9C до 17,1C (медиана:10,9, интерквартильный размах: 10,5 - 15,9). Результаты контактной термометрии согласовывались с результатами инфракрасной термографии. При этом контактные датчики теспературы позволяли проводить мониторинг температуры в течение всего периода транспортировки донорского органа. Следует подчеркнуть, что из-за крайне высокой чувствительности инфракрасного термографа результаты измерения температуры органа могут значительно искажаться из-за неизбежных тепловых артефактов (прикосновение к органу рук хирургов, инструментов, свет операционных ламп). В связи с этим мы приходим к выводу, что в реальной клинической практике использование инфракрасной термографии как метода мониторинга температуры донорского органа сопряжено с высоким риском получения недостоверных данных. В то же время мы полагаем, что этот метод может быть эффективно использован при проведении экспериментальных работ, особенно во время изолированной перфузии органа ex vivo. Результаты экспериментальной части работы по длительной (18 - 24 ч) статической холодовой консервации печени барана показали, что такая экспериментальная биомодель является адекватной, удобной и воспроизводимой. Динамика внутритканевых концентраций глюкозы, лактата и пирувата соответствует ранее полученным клиническим данным (на сроках до 8 часов). Дальнейшая пролонгация сроков консервации сверх предельно допустимых в клинической практике сопровождается теми же изменениями показателй внутритканевого метаболизма (рост концентрации глюкозы, лактата и глицерола, снижение концентрации пирувата до близких к 0 значений). Сосудистая анатомия печени барана позволяет использовать ее в экспериментах по изолированной ex-vivo перфузии. При исследовании динамики концентраций внутритканевых параметров метаболизма глюкозы в раннем послеоперационном периоде (первые двое суток) и соотнесении их значений с клиническими исходами переспективным представилось перейти от анализа значений в различных временных точках к оценке динамики концентраций исследуемых веществ за опеделенный интервал. В качестве количественной меры, было решено использовать площадь под кривой "концентрация- время". Так, данные показатели в группах с нормальной начальной функцией (n = 16) и ранней дисфункцией трансплантата (n = 7) составивли a) в течение первых 12 часов, b) в течение первых суток, c) в течение вторых суток соответсвенно: - глюкоза (ммоль/л*ч): a) 136 [114 - 172] и 121 [92 - 145], p = 0.249; b) 287 [259 - 340] и 281 [206 - 320], p = 0.367; c) 256 [237 - 285] и 210 [121-315], p = 0.381. - лактата (ммоль/л*ч): a) 48 [28 - 57] и 181 [94 - 185], p < 0.001; b) 81 [58 - 91] и 264 [172 - 413], p < 0.001; c) 49 [35 - 55] и 142 [98 - 188], p < 0.001. - пирувата (мкмоль/л*ч): a) 1982 [1298 - 3116] и 3030 [260 - 4442], p = 0.579; b) 4262 [3603 - 6923] и 8719 [6654 - 9378], p = 0.098; c) 3711 [2691 - 5256] и 6263 [5421 - 8699], p = 0.029. - глицерола (мкмоль/л*ч): a) 282 [209 - 737] и 1238 [759 - 7917], p = 0.003; b) 422 [332 - 1299] и 1465 [1094 - 5051], p =0.023; c) 336 [252 - 860] и 3335 [551 - 7977], p =0.020. Полученные результаты говорят о том, что мониторинг внутритканевых параметров метаболизма глюкозы позволяет значительно сократить срок наблюдения, необходимый для оценки начальной функции пересаженной печени.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В течение третьего этапа проекта (с 1 июля 2021 г по 1 мая 2022 г) в клиническую часть работы включено 13 новых наблюдений трансплантации печени. Во всех из них в после операционном периоде проведено исследование динамики внутритканевых концентраций глюкозы, лактата, пирувата и глицерола. В случаях, когда технически и организационно было возможно сбор и последующий анализ проб внутритканевой жидкости донорской печени проводился также на донорском этапе и в течение статической холодовой консервации. Принципиально важным для дальнейшего развития научной концепции мониторинга внутритканевого метаболизма глюкозы при трансплантации органов, а также для ее практической реализации стало решение ряда технологических вопросов, связанных с процедурой получения внутритканевой жидкости и анализа ее состава. Главными модификациями стали: - использование вместо оригинального микродиализного насоса инсулиновой помпы, что обеспечило возможность бесконтактного (bluetooth) управления подачей перфузионной жидкости в микродиализный катетер, повысило надежность и безопасность процесса за счет более высокого класса влагозащищенности изделия, надежной фиксации емкости с перфузионном составом. - использование проточного электрохимического сенсора глюкозы и лактата для определения концентраций данных соединений во внутритканевой жидкости, что позволяет получать результаты анализа в режиме реального времени с интервалом измерений от 1 секунды и отказаться от использования стационарного оборудования. Данные модификации были оправданы также и с экономической точки зрения. Без увеличения суммарной стоимости расходных материалов, необходимых для проведения одного сенса мониторинга, цена используемого оборудования была снижена более чем в 47 раз. Работоспособность модифицированной системы была подтверждена в эксперименте по длительной статической холодовой консервации печени крысы. После чего в первые в мировой практике был проведен мониторинг внутритканевых концентраций глюкозы и лактата в донорской печени во время ее эксплантации, консервации и на всех этапах трансплантации человеку. Полученный результат является важным аргументом в пользу инициации научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ по созданию специализированного медицинского изделия, предназначенного для мониторинга состояния донорского органа в период консервации, дополнительной объективной оценки при принятии решения о его пригодности для трансплантации, а также ранней диагностики нарушений функции трансплантата в послеопрационном периоде. В отчетном периоде был проведен анализ 32 трансплантаций печени, включенных в исследование в течение срока исполнения проекта. Наблюдения были распределены на две группы в зависимости от начальной функции пересаженной печени: Группа A (нормальная начальная функция, n = 23); Группа B (ранняя дисфункция трансплантата, n = 9). Наиболее важной особенностью являлалась статистически значимо более высокая концентрация лактата при нарушении функции трансплантатов: как при первом измерении (через 3 часа после реперфузии): Группа A : 12,3 [10,1; 15,6] ммоль/л против Группа B: 7,2 [3,9; 9,9] ммоль/л (p = 0,003), так и спустя 24 часа: Группа A: 6,1 [4,2; 13,2] ммоль/л против Группа B: 2,4 [1,7; 2,8] ммоль/л (p < 0,001). При проведении ROC-анализа установлено пороговое значение внутритканевой концентрации лактата через 3 часа после реперфузии – 8,8 ммоль/л. Использование его для диагностики ранней дисфункции трансплантата обеспечивает чувствительность – 89%, специфичность – 65% (площадь под ROC-кривой – 0,85). В 18 наблюдениях мониторинг внутритканевых концентраций глюкозы, лактата, пирувата и глицерола дополнительно проводился в течение статической холодовой консервации. При анализе данной когорты, наблюдения также были разделены на две группы в зависимости от начальной функции трансплантатов: Группа C (нормальная начальная функция), n = 13; Группа D (ранняя дисфункция трансплантата), n = 5. При сравнительном анализе по перечню "традиционных" параметров, характеризующих посмертного донора и качество печени статистически значимых различий установлено не было. В то же время были идентифицированы значимые различия для значений внутритканевой концентрации лактата и площади под кривой "концентрация лактата - длительность консервации". Далее были установлены граничные значения для данных параметров: 15,4 ммоль/л и 76,1 ммоль/л*ч, превышение которых с чувствительностью 100% в обоих случаях и специфичностью 77% и 85%, соответственно, могут использоваться для прогнозирования нарушения начальной функции трансплантатов. При ретроспективном анализе 106 последовательно выполнененных в одном центре трансплантаций печени посмертного донора установлен перечень предикторов ранней (до 30 дней) утраты трансплантата: Среди предоперационных факторов доминирующий негативный эффект оказывают: - повторная трансплантация, - ургентная трансплантация, - скорость клубочковой фильтрации кандидата на трансплантацию, - концентрация натрия в крови кандидата на трансплантацию, - уровень лейкоцитов у кандидата на трансплантацию, - показатель D-MELD, - уровень аминотрансфераз донора перед изъятием печени, - продолжительность статической холодовой консервации донорского органа. Среди интраоперационных факторов: - объем гемотрансфузии (сумма объемов введенной эритроцитарной массы и аутогемотрансфузии), - инотропная подержка норадреналином на момент завершения трансплантации К исходу первых послеоперационных суток значимость большей части ранее приведенных факторов нивелируется и на первый план выходят результаты лабораторных исследований крови реципиента: - уровень лактата артериальной крови реципиента через 24 часа после операции, - уровень амитрансфераз (АСТ и АЛТ) в крови реципиента через 24 часа после операции, - уровень тромбоцитов, - отношение лактат/тромбоциты, - концентрация натрия в крови реципиента. Две последние группы факторов (интра- и посттрансплантационные) позволяют с высокой долей точности прогнозировать раннюю потерю трансплантата (AUC всех моделей при верификации на обучающей выборке выше 0,9) и подготовиться, при необходимости, к выполнению срочной ретрансплантации. В связи с известной связью между температурой и скоростью протекания метаболических реакций, вопрос изучения температурного режима консервации донорской печени находился в фокусе нашего внимания. Дистанционная инфракрасная термография исходно рассматривалась нами в качестве метода выбора. Анализ полученных термограмм позволил нам сделать вывод, что в большинстве случаев к моменту начала транспортировки донорского органа его температура не достигает целевого интервала в +2 - +4 градуса Цельсия. Более того, после доставки органа в центр трансплантации в большинстве случаев его температура также была выше целевых значений и в большинстве случаев находилась в интервале +8 - +12 градусов Цельсия. Дальнейшее сопоставление результатов одновременного измерения температуры разными методами (контактным и инвазивным) показало существенные расхождения в показателях. Также были получены данные о температурном режиме 11 транспортировок печени посмертного донора, проведенных в разные месяцы года (кроме декабря). Внешняя температура, независимо от времени года варьировала от +9 до +30 градусов Цельсия, внутренняя - от от +5 до +15 градусов Цельсия. Эти результаты, полученные в условиях реальной клинической практики, подтверждают необходимость разработки специализированного медицинского изделия для хранения и транспортировкой донорских органов с возможностью контроля и управления температурой.