Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Одним из трендов развития биомедицины и биомедицинской диагностики является молекулярный имиджинг, то есть, визуализация процессов в живом организме с использованием сигнала, селективно детектируемого от известного типа молекул. К методам молекулярного имиджинга можно отнести и ряд оптических методов. В идеале, с помощью молекулярного имиджинга можно отследить локализацию и взаимодействие определенных молекул в организме с целью диагностики заболеваний и разработки лекарств. В большинстве случаев, для реализации молекулярного имиджинга используются экзогенные метки различной природы. Несмотря на то, что глубина проникновения оптического излучения в биологическую ткань невелика, оптические методы используются для молекулярного имиджинга чрезвычайно широко. Это связано во много с интересом к методам неинвазивной диагностики патологических процессов в организме человека на молекулярном и клеточном уровне, поскольку они обладают рядом преимуществ в сравнении с «золотым стандартом» – гистологическими исследованиями. В связи с этим, имеется интерес к методам с эндогенным контрастом, то есть, подходам, в которых информативный сигнал детектируется от молекул, присутствующих в организме. Задачи данного проекта были стимулированы тем фактом, что во-первых, список эндогенных молекул, которые могут выступать в качестве контраста для молекулярного имиджинга, достаточно ограничен, а, во-вторых, ряд структур и процессов в организме до сих пор не был визуализирован и изучен с помощью эндогенного (флуоресцентного) контраста. Таким образом, для расширения возможностей методов оптической спектроскопии (флуоресцентной и спектроскопии комбинационного рассеяния) и микроскопии (прежде всего, многофотонной томографии, МФТ) необходимо проведение комплексного исследования, затрагивающего вопросы формирования сигнала при оптической томографии и фотофизических механизмов, ответственных за оптический отклик эндогенных флуорофоров, а также разработка методов селекции сигналов от эндогенных молекул-репортеров и верификация их применимости для биомедицинской диагностики. В результате, работа в проекте шла по двум направлениям: (1) исследование новых типов флуорофоров, механизмов формирования оптических свойств в них и возможностей их применения в диагностике и (2) применение методов оптической спектроскопии и микроскопии для детектирования объектов, исследование которых неинвазивно на пациентах ранее было затруднено. Наиболее важными из полученных на отчетном этапе результатов являются: 1) описание механизмов формирования оптических свойств молекул при их окислении, 2) влияние окислительных процессов на оптические свойства клеток (in vitro), 3) определение локализации и свойств меланина и продуктов окисления in vivo с помощью одновременного применения флуоресцентной спектроскопии и микроскопии КР, 4) детектирование тучных клеток в дерме методом МФТ/FLIM. 1. Было исследовано формирование оптического отклика систем, возникающих в результате окисления молекул-прекурсоров. Было показано, что при окислении аминокислот, белков, прекурсоров меланина возникает монотонно спадающее с ростом длины волны поглощение в видимом и ближнем ИК диапазоне. При окислении также возникает флуоресцентный отклик в видимом и ИК диапазоне, параметры которого (положение максимума и квантовый выход) зависят от длины волны возбуждения. Было получено, что для гетерогенных систем, образованных в результате окисления, стоксов сдвиг и квантовый выход монотонно спадают с ростом длины волны возбуждения. Методом сверхбыстрой спектроскопии был показан перенос энергии возбуждения в таких системах и наличие в них спектральной диффузии. В результате была предложена модель формирования оптических свойств в гетерогенных системах флуорофоров, образующихся в результате окисления биомолекул, объясняющая, в частности, закономерности формирования низкого квантового выхода флуоресценции и широкого спектра возбуждения. 2. Роль продуктов окисления в формировании оптического сигнала в красной и ИК области спектра была продемонстрирована также на примере клеточной культуры. Было показано, что продукты окисления аминокислот, белков, ДНК, липидов – а их могут быть сотни – причастны к формированию флуоресцентного отклика от клеток в красном и ИК диапазонах. Было показано, что, несмотря на гетерогенность молекулярного состава, электронное взаимодействие между продуктами окисления приводит к оптическому отклику со свойствами, не зависящими от наличия конкретного флуорофора. Иными словами, первичен механизм взаимодействия между молекулами-продуктами окисления, а не наличие конкретного вещества. Понимание этого механизма позволяет отслеживать состояние живых клеток, например, детектировать в них окислительный стресс, а также проводить диагностику патологических процессов в организме человека in vivo, используя красную и ИК флуоресценцию, например, для исследования воспалительных и онкологических процессов. 3. В качестве продолжения направления, связанного с влиянием окислительных процессов на оптические свойства клеток и тканей, была проведена серия экспериментов по облучению кожи УФ излучением in vivo и ex vivo несколькими методами, включая МФТ. Было показано, что в случае образцов ex vivo наблюдалось быстрое увеличение ИК флуоресценции для УФ-облученных образцов, что соответствовало результатам, полученным на клетках и модельных образцах (растворах). На основе спектроскопии комбинационного рассеяния и флуоресцентной спектроскопии был предложен новый подход к определению локализации и свойств меланина in vivo, а также продуктов окисления белков, ответственных за ИК флуоресценцию кожи. 4. На основе метода МФТ/FLIM был разработан метод для исследования клеток в дерме, в частности, тучных клеток. Несмотря на то, что МФТ позволяет исследовать структуры в коже на глубине до ~150 мкм с субмикронным разрешением, в литературе отсутствует описание применения этого метода для визуализации и диагностики ряда компонентов кожи, которые должны наблюдаться в исследуемом объеме. В частности, нам неизвестны работы, в которых бы сообщалось об исследовании клеток в дерме человека in vivo методом МФТ. Под клетками в дерме при этом мы понимаем, в частности, фибробласты, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки и др. ТК являются многофункциональными клетками иммунной системы. Они непосредственно участвуют в этиологии нескольких заболеваний, включая крапивницу, псориаз, атопический дерматит и мастоцитоз, при которых их концентрация увеличиваются в местах поражения. Рутинным методом для оценки числа ТК и их состояния (наличия активации) служит гистоморфометрическое исследование биопсийных образцов, в то время как неинвазивных методов для исследования ТК in vivo у пациентов не существует. В рамках данного проекта нами был предложен алгоритм для in vivo детектирования тучных клеток методом МФТ/FLIM, который был верифицирован с помощью гистологических исследований.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Одним из трендов развития биомедицины и биомедицинской диагностики является молекулярный имиджинг, то есть, визуализация процессов в живом организме с использованием сигнала, селективно детектируемого от известного типа молекул. К методам молекулярного имиджинга можно отнести и ряд оптических методов. В идеале, с помощью молекулярного имиджинга можно отследить локализацию и взаимодействие определенных молекул в организме с целью диагностики заболеваний и разработки лекарств. В большинстве случаев, для реализации молекулярного имиджинга используются экзогенные метки различной природы. Несмотря на то, что глубина проникновения оптического излучения в биологическую ткань невелика, оптические методы используются для молекулярного имиджинга чрезвычайно широко. Это связано во много с интересом к методам неинвазивной диагностики патологических процессов в организме человека на молекулярном и клеточном уровне, поскольку они обладают рядом преимуществ в сравнении с «золотым стандартом» – гистологическими исследованиями. В связи с этим, имеется интерес к методам с эндогенным контрастом, то есть, подходам, в которых информативный сигнал детектируется от молекул, присутствующих в организме. Задачи данного проекта были стимулированы тем фактом, что, во-первых, список эндогенных молекул, которые могут выступать в качестве контраста для молекулярного имиджинга, достаточно ограничен (Глобальная задача 1), а, во-вторых, ряд структур и процессов в организме до сих пор не был визуализирован и изучен с помощью эндогенного (флуоресцентного) контраста (Глобальная задача 2). Соответственно, проект нацелен на решение двух глобальных проблем, и в соответствии с этим решались следующие задачи : 1. исследованы фотофизических процессов в новых флуорофорах – гетерогенных системах, ответственных, по нашей гипотезе, за флуоресценцию клеток и биотканей в красной и ближней ИК спектральных областях. На втором этапе проекта подробно исследованы механизмы формирования оптического отклика в гетерогенных системах флуорофоров, возникающих в результате окисления биомолекул. Показана общность фотофизических механизмов в таких системах, а также роль этих систем в формировании красную и ИК флуоресценцию биотканей. В рамках этой подзадачи были - показана общность стационарных оптических свойств (спектров поглощения и флуоресценции) меланина и гетерогенных продуктов модификаций белков и аминокислот, - методом масс-спектрометрии сверхвысокого разрешения показана взаимосвязь оптических свойств и гетерогенности молекулярного состава исследуемых систем, - методом микроскопии светового листа изучена агрегация гетерогенных продуктов окисления и установлена связь параметров супрамолекулярных агрегатов со стационарными оптическими свойствами, - методами сверхбыстрой спектроскопии показано влияние межмолекулярного взаимодействия на параметры затухания флуоресценции на субпикосекундном временном масштабе. 2. выявлены возможности селективного детектирования флуоресцентного отклика гетерогенных систем флуорофоров из общего сигнала флуоресценции биотканей. Было доказано, что системы, образующиеся в результате окисления (или гликирования) можно селективно детектировать с помощью двухфотонной микроскопии с использованием флуориметрии насыщения за счет наличия у них длинноволнового поглощения и эффекта двухквантового возбуждения флуоресценции. Показана принципиальная возможность детектирования таких систем методом термографии, в частности, в случае геморрагий. 3. создан новый метода in vivo неинвазивного детектирования макрофагов и их фенотипов в коже человека методом ДФТ-FLIM. Чувствительность отделения макрофагов других клеток дермы составила по данным метода ДФТ-FLIM составила 81%, а специфичность – 80%. Алгоритм также отличал макрофаги фенотипов M1 и M2 с чувствительностью 88% и специфичностью 89%. Помимо этого, алгоритм детектирования тучных клеток in vivo методом ДФТ-FLIM, который был представлен в отчете за первый год, был применения к пациентам с аллергией и мастоцитозом, для которых удалось определить не только количество тучных клеток in vivo, но и показать их активацию in vivo. 4. развиты новые подходы к анализу данных микроспектроскопии комбинационного рассеяния кожи в контексте выделения вкладов эндогенных молекул, в частности, меланина, относящегося к гетерогенным системам флуорофоров. Было показано, что алгоритм неотрицательного матричного разложения, примененный к реальным экспериментальным данным, позволяет выделять компоненты схожие с компонентами основных компонент, помимо этого, был предложен метод определения конформации кератина и локализации меланина. Данный подход можно использовать в дальнейшем для диагностики заболеваний кожи как путем анализа изменения глубинных профилей компонент, так и путем анализа изменения формы их спектра.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Одним из трендов развития биомедицины и биомедицинской диагностики является молекулярный имиджинг, то есть, визуализация процессов в живом организме с использованием сигнала, селективно детектируемого от известного типа молекул. К методам молекулярного имиджинга можно отнести и ряд оптических методов. В идеале, с помощью молекулярного имиджинга можно отследить локализацию и взаимодействие определенных молекул в организме с целью диагностики заболеваний и разработки лекарств. В большинстве случаев, для реализации молекулярного имиджинга используются экзогенные метки различной природы. Несмотря на то, что глубина проникновения оптического излучения в биологическую ткань невелика, оптические методы используются для молекулярного имиджинга чрезвычайно широко. Это связано во много с интересом к методам неинвазивной диагностики патологических процессов в организме человека на молекулярном и клеточном уровне, поскольку они обладают рядом преимуществ в сравнении с «золотым стандартом» – гистологическими исследованиями. В связи с этим, имеется интерес к методам с эндогенным контрастом, то есть, подходам, в которых информативный сигнал детектируется от молекул, присутствующих в организме. Задачи данного проекта были стимулированы тем фактом, что, во-первых, список эндогенных молекул, которые могут выступать в качестве контраста для молекулярного имиджинга, достаточно ограничен, а, во-вторых, ряд структур и процессов в организме до сих пор не был визуализирован и изучен с помощью эндогенного (флуоресцентного) контраста. В рамках решения двух указанных глобальных задач на третьем этапе выполнения проекта были получены следующие результаты: 1. Предложен и верифицирован на растворах модельных соединений (на классических флуорофорах – красителях – и гетерогенной системе флуорофоров, меланине) метод микроскопии насыщения, совмещенной с FLIM. Данная методика позволяет картировать сечение двухфотонного поглощения (аналогично тому, как метод FLIM позволяет картировать параметры затухания флуоресценции) и визуализировать распределение флуорофоров различного типа с его использованием. Проверена гипотеза о возможности селективного возбуждения флуоресценции гетерогенных систем флуорофоров с использованием их двухквантового возбуждения (на примере меланина и липофусцина) и однофотонного возбуждения в ИК области спектра (на примере белковых молекул). Эксперименты были выполнены на клетках (гепатоцитах) и образцах гликированного коллагена типа I. 2. Проведено исследование механизмов формирования оптического отклика гетерогенных систем флуорофоров и применение его для биомедицинской диагностики: - проведена серия исследований оптических свойств белковых молекул при их химической модификации – окислении и гликировании. Показано, что в результате этих процессов у растворов белков появляются оптические свойства, характерные для гетерогенных систем флуорофоров – длинноволновое поглощение, флуоресценция в видимой и ИК области спектра. Аналогичные результаты получены для растворов гемоглобина и эритроцитов, что позволяет визуализировать геморрагии по сигналу их красной и ИК автофлуореценции. Полученные результаты являются еще одним подтверждением роли продуктов окисления биомолекул в формирование фонового сигнала ИК флуоресценции у живых систем. - проведено подробное исследование фотофизических свойств гетерогенных систем флуорофоров, в том числе, исследована зависимость параметров их флуоресценции от распределения частиц по размерам. Показано, что для появления характерных оптических свойств гетерогенных систем флуорофоров нет необходимости в появлении агрегатов взаимодействующих частиц. Установлено, что величина анизотропии флуоресценции исследуемых систем не изменяется на интервале 150 фс – 100 пс после начала возбуждения и имеет начальный уровень 0.2–0.35 для исследуемых гетерогенных систем флуорофоров. Показано, что сверхбыстрая компонента затухания флуоресценции с характерным временем ~1 пс наблюдается для молекулярной фракции менее 1 кДа, а параметры затухания наблюдаемой компоненты зависят от полярности растворителя. Наблюдаемые факты говорят в пользу формирования кинетики затухания флуоресценции гетерогенных систем флуорофоров по модели усреднения оптических свойств невзаимодействующих флуорофоров, а наличие сверхбыстрой компоненты в диапазоне 480–560 нм может быть объяснено релаксацией молекул растворителя, окружающих флуорофоры гетерогенной системы, обладающих различными длинами волн эмиссии флуоресценции, после возбуждения системы. Результаты опубликованы в журнале Environmental Science&Technology Letters (https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.estlett.2c00161). 3. Было впервые показано, что сигнал флуоресценции плазмы крови в видимой области спектра определяется, в первую очередь, не наличием в ней флуорофоров небелковой природы, например, НАД(Ф)Н, а белками и флуорофорами, связанными с продуктами их химической модификации. Так, показано, что 70% флуоресценции плазмы крови при возбуждении на длине волны 350 нм связано с альбумином, и 40% из них пропадает после диализа и связано с лигандом, предположительно, НАД(Ф)Н. При возбуждении на длине волны >400 нм также 70% флуоресценции плазмы крови связано с альбумином, и данная флуоресценция не уменьшается после диализа. Проведенный анализ является наиболее подробным исследованием флуоресценции плазмы крови из имеющихся в литературе. Во-первых, впервые была установлена природа флуоресценции плазмы крови в видимой области спектра и количественно показан вклад в нее окисленного альбумина. Во-вторых, детальный анализ параметров белковой флуоресценции плазмы крови был произведен на выборке образцов n > 200, в результате чего был разработан алгоритм классификации образцов пациентов с подозрением на колоректальный рак с точностью классификации 82%. 4. Верифицирован метод детектирования и определения фенотипа макрофагов в коже пациентов in vivo методом двухфотонной томографии (ДФТ)-FLIM. Путем сопоставления параметров затухания флуоресценциии макрофагов, измеренных in vitro, ex vivo (в биопсийных образцах кожи) и in vivo доказано, что с помощью метода ДФТ-FLIM можно отличить макрофаги от других клеток в дерме – тучных клеток и фибробластов, а также визуализировать процесс фагоцитоза.